一株鴕鳥源新城疫病毒對雞胚的毒力特性初探

謝 洋，曹紫夢，郜道玉，湯學(xué)超，唐瑞林，唐春燕，王家鄉(xiāng)，李 鵬

（長江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北荊州 430025）

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染疾病，主要發(fā)病特征是呼吸困難、嚴(yán)重下痢、黏膜和漿膜出血，病程稍長的伴有神經(jīng)癥狀［1］。新城疫成為中國鴕鳥養(yǎng)殖中危害較大的傳染?。?］，對鴕鳥的健康養(yǎng)殖影響巨大［3］，特別是從2017 年以后，鴕鳥新城疫頻發(fā)，給廣大鴕鳥養(yǎng)殖戶造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在防控鴕鳥新城疫的臨床實(shí)踐中，于2019 年從河北省某鴕鳥養(yǎng)殖場送檢的具有新城疫典型臨床癥狀的1 日齡雛鴕鳥體內(nèi)分離到1 株野毒株，通過試驗(yàn)確定該野毒株為新城疫強(qiáng)毒株。

1 材料與方法

1.1 病料來源

具有新城疫典型臨床癥狀的病雛鴕鳥1 只，來源于河北省某鴕鳥養(yǎng)殖場，為送檢樣品。

1.2 試驗(yàn)材料

9～11 日齡SPF 雞胚、3 日齡健康雛雞，均購自湖北省荊州市川店鎮(zhèn)峪口禽業(yè)有限公司；雞紅細(xì)胞、新城疫陽性血清及其他試劑儀器等均由長江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 病毒的分離和鑒定

1.3.1 病毒的分離 取患病鴕鳥腦、肝、脾和十二指腸等病變組織加入PBS 溶液等體積混合并研磨勻漿。離心取上清液接種到10 枚9 日齡的SPF 雞胚，0.2 mL/只，置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育，24 h 后照蛋并去除死胚，繼續(xù)孵化，照蛋取死胚放置在4 ℃冰箱，36 h后取出全部雞胚并放置在4 ℃冰箱內(nèi)過夜，在無菌條件下提取尿囊液備用。

1.3.2 血清學(xué)鑒定 將提取的雞胚尿囊液與1%雞紅細(xì)胞按照經(jīng)典的免疫學(xué)試驗(yàn)方法進(jìn)行血凝試驗(yàn)，測定其血凝活性。用實(shí)驗(yàn)室提供的標(biāo)準(zhǔn)新城疫陽性血清與雞胚尿囊液進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)。

1.4 毒力指數(shù)的測定

1.4.1 雞胚平均死亡時(shí)間（MDT）測定 將雞胚尿囊液稀釋10 倍，每個(gè)稀釋度經(jīng)尿囊腔接種10 只9 日齡SPF 雞胚，每只接種0.1 mL，同時(shí)另設(shè)10 只9 日齡SPF 雞 胚接種0.1 mL 無菌PBS 溶 液作為 對 照。37 ℃孵育，棄去24 h 內(nèi)死亡的雞胚，每隔2 h 照蛋1 次，連續(xù)觀察120 h，觀察記錄雞胚死亡時(shí)間。使所有雞胚死亡的最高稀釋度就是最小致死量（MLD）。MDT是MLD致死雞胚的平均時(shí)間，強(qiáng)毒株為40～60 h，中毒株為60～90 h，弱毒株為90 h 以上。MDT按下列公式計(jì)算：MDT=（X時(shí)死亡雞胚數(shù)×X時(shí)+Y時(shí)死亡雞胚數(shù)×Y小時(shí)+Z時(shí)死亡雞胚數(shù)×Z時(shí)+……）/死亡雞胚總數(shù)。

1.4.2 3 日齡雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)（ICPI）測定 將雞胚尿囊液稀釋10 倍，腦內(nèi)接種10 只3 日齡SPF 雛雞，每只接種0.1 mL，同時(shí)另設(shè)10 只9 日齡SPF 雞胚接種0.1 mL 無菌PBS 溶液作為對照。所有雛雞置溫箱內(nèi)隔離飼養(yǎng)8 d，每天觀察并記錄雛雞的生理狀況，按照正常得0 分，患病得1 分，死亡得2 分，累計(jì)病雞數(shù)和死亡雞數(shù)的積分。ICPI是3 日齡雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)，根據(jù)OIE 提供的毒力鑒定分型標(biāo)準(zhǔn)：ICPI達(dá)0.2～0.6，為溫和型（弱毒株），0.5～1.0 為中等毒力型，1.5～2.0 為速發(fā)型（強(qiáng)毒力型）。ICPI按下列公式計(jì)算：ICPI=（累積死亡雞數(shù)×2+累積發(fā)病雞數(shù)×1）/雞的累積總數(shù)。

1.4.3 半數(shù)致死量（ELD50）的測定 將該病毒溶液用生理鹽水連續(xù)稀釋10 倍至10-9～10-5，并將每個(gè)稀釋的溶液用9 日齡的非免疫雞胚尿囊腔接種，每個(gè)雞胚接種0.2 mL 病毒液，每個(gè)稀釋度組中接種5個(gè)雞胚，封蠟后在37 ℃培養(yǎng)箱中溫育。每天觀察雞胚的狀態(tài)，丟棄24 h 內(nèi)死亡的雞胚，并且每天觀察2次，直到72 h。記錄雞胚死亡。然后根據(jù)Reed-Muench 法［4］計(jì)算ELD50。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清學(xué)鑒定結(jié)果

將分離保存的尿囊液進(jìn)行血凝和血凝抑制試驗(yàn)。結(jié)果顯示，該毒株能夠凝集1%雞血紅細(xì)胞，而且其血凝特性能夠被新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽性血清抑制。根據(jù)此結(jié)果可確定該分離到的毒株為新城疫病毒，暫命名為NDV-HB2019 株。

2.2 雞胚平均死亡時(shí)間（MDT）的測定結(jié)果

由表1 可知，能夠使雞胚全部死亡的最高稀釋倍數(shù)為10-7，且在36 h 時(shí)死亡的雞胚數(shù)為1 枚，48 h時(shí)死亡的雞胚數(shù)為2 枚，60 h 時(shí)死亡的雞胚數(shù)為2枚，以上的數(shù)據(jù)用公式計(jì)算可以得出雞胚平均死亡時(shí)間MDT為50.4 h。

表1 MDT 的測定結(jié)果

2.3 3 日齡雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)（ICPI）測定結(jié)果

由表2 可知，雞胚尿囊液對雛雞有很強(qiáng)的致死作用，死亡率較高；對照組注射生理鹽水后全部正常存活。根據(jù)國際上ICPI的計(jì)算公式可得ICPI為1.71。

表2 ICPI測定結(jié)果

2.4 半數(shù)致死量（ELD50）的測定結(jié)果

從表3 可知，測定的ELD50在10-8～10-7，按照數(shù)據(jù)并結(jié)合Reed-Muench 方法計(jì)算ELD50可得每0.2 mLELD50為5×10-7.4。

表3 ELD50的測定結(jié)果

3 討論

新城疫是由新城疫病毒引起的一種急性高接觸性傳染病，又被稱作“亞洲雞瘟”，作為被OIE 規(guī)定必須予以報(bào)告的疫病是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的重要疾病。薛應(yīng)照等［5］、尹燕博等［6］研究發(fā)現(xiàn)，有的患病鴕鳥會(huì)出現(xiàn)頸部扭轉(zhuǎn)、彎曲并出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，排出黑色稀糞等癥狀。研究者分析發(fā)現(xiàn)，剖解時(shí)可以觀察到氣管和喉頭黏膜有出血點(diǎn)、腺胃水腫、乳頭有出血點(diǎn)、肌胃角質(zhì)層易脫落、角質(zhì)層下有出血點(diǎn)或出血斑、小腸黏膜嚴(yán)重滲出性出血、結(jié)腸和直腸的黏膜有出血點(diǎn)、心包外膜可見有噴灑狀出血、大腦和小腦表面血管充血、腦出血等病理變化［7-10］。本試驗(yàn)中觀察到該病雛鴕鳥頸部扭轉(zhuǎn)、彎曲并出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，內(nèi)部解剖特征與孫矗等［7］的研究報(bào)道一致，為鴕鳥新城疫的快速診斷提供了臨床依據(jù)。

NDV 根據(jù)不同致病菌株感染的家禽的不同表現(xiàn)形式可分為3 種致病類型［11，12］：速發(fā)型（強(qiáng)毒株）的菌株，對所有年齡段的易感禽造成急性感染性死亡；中發(fā)型（中毒株）的菌株中，只在易感幼禽引起致命感染；緩和型，低毒或無毒菌株，輕度呼吸道感染的臨床表現(xiàn)或腸道感染，無臨床癥狀。NDV 的毒力測定需根據(jù)雞胚平均死亡時(shí)間（MDT）、3 日齡雞胚腦內(nèi)接種致病指數(shù)（ICPI）和6 周齡雞靜脈接種致病指數(shù)（IVPI）及半數(shù)致死量（ELD50）的測定。

由于新城疫病毒不同分離毒株的毒力不同，判定毒力大小常用的毒力測定指標(biāo)MDT、ICPI、IVPI有時(shí)并不完全一致，所以在這3 種判定指數(shù)中，需2 種或2 種以上指標(biāo)綜合分析才能判定毒株的致病性強(qiáng)弱［13，14］。判斷新城疫病毒強(qiáng)毒株毒力的國際通用標(biāo)準(zhǔn)是MDT為30～60 h，ICPI＞1.6。在本試驗(yàn)中測得MDT為50.4 h，ICPI為1.71，每0.2 mLELD50為5×10-7.4，符合強(qiáng)毒型毒株判定標(biāo)準(zhǔn)，故根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可以判定本次分離的NDV-HB2019 株為強(qiáng)毒株，為下一步對其進(jìn)行分子生物學(xué)特性研究和疫苗候選株篩選打下了基礎(chǔ)。