藤苦參組培快繁技術

肖 明，胡琦敏，龐曉云，陳曉藝，譚安薔，李清平，羅宇東

（1.廣西中醫(yī)藥大學百年樂制藥有限公司，南寧 530023；2.廣西中醫(yī)藥研究院，南寧 530022）

藤苦參又名馬蓮鞍、古羊藤、南苦參、地苦參等，系蘿藦科杠柳亞科馬蓮鞍屬植物馬蓮鞍（Streptocaulon griffithiiHook.f.），多產(chǎn)于廣西壯族自治區(qū)、云南省、貴州省，生長于山野坡地、山谷疏林中或路旁灌木叢中。藤苦參的干燥根入藥，可用于治療痢疾、濕熱腹瀉、心胃氣痛、感冒發(fā)燒、慢性腎炎、跌打等疾?。?-3］。作為廣西中醫(yī)藥大學百年樂制藥有限公司的獨家產(chǎn)品外感風痧系列產(chǎn)品的主藥材，藤苦參的生產(chǎn)需求大，為保證藥材的來源及產(chǎn)量，需要進行大面積人工種植。本研究在種子繁殖基礎上開展組培繁殖，探索不同植物生長調(diào)節(jié)劑對藤苦參無菌苗不定芽增殖、生根等的影響，篩選出適宜藤苦參種子萌發(fā)條件及組培繁殖培養(yǎng)基配方，以期為藤苦參種質(zhì)資源的保護和開發(fā)利用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

藤苦參種子為野外采集，由廣西中醫(yī)藥大學中藥鑒定室鑒定為蘿藦科杠柳亞科馬蓮鞍屬植物馬蓮鞍的種子。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體滅菌 將藤苦參果莢未開裂的果實用自來水沖洗，在超凈工作臺上，將清洗過的果莢置于培養(yǎng)皿中，切開果莢取出種子，用75%乙醇浸泡20 s，無菌水沖洗1 次，加0.1%升汞，浸泡12 min，用無菌水沖洗4～5 次，備用。

1.2.2 培養(yǎng)基制備 添加不同濃度的6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）和萘乙酸（NAA）、30 g/L 食用蔗糖、1 g/L活性炭、7 g/L 瓊脂，滅菌前pH 6.5，配置分裝后，在121°C 溫度下滅菌20 min。

1.2.3 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)室溫度（25±2）℃，光照度1 000～1 200 lx，每天光照12 h。

1.2.4 種子萌發(fā)培養(yǎng) 將種子播種于MS 培養(yǎng)基中，添加不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑、1 g/L 活性炭，20 d后觀察種子的萌發(fā)情況。

1.2.5 叢生芽分化培養(yǎng) 將種子萌發(fā)培養(yǎng)獲得的芽苗接種于不同的叢生芽分化培養(yǎng)基中，以MS 為基本培養(yǎng)基，比較不同濃度的6-BA 和NAA 對藤苦參芽增殖分化的影響，40 d 后觀察芽的增殖分化情況。

1.2.6 生根壯苗培養(yǎng) 當幼苗高在3～4 cm 時便可轉(zhuǎn)接到生根壯苗培養(yǎng)基中，以MS 為基本培養(yǎng)基，添加NAA1.0 mg/L，添加活性炭和不添加活性炭對比試驗，觀察生根壯苗后幼苗的葉片數(shù)量、葉片長度、根數(shù)及根長。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel軟件進行處理和計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑對藤苦參種子萌發(fā)的影響

將藤苦參種子播種在種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，20 d統(tǒng)計種子萌發(fā)率，觀察種子萌發(fā)情況。從表1 可以看出，當不添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑時，種子萌發(fā)率偏低，隨著6-BA 濃度的升高，種子萌發(fā)率逐漸增加。當NAA 濃度為0.5 mg/L 時，種子萌發(fā)率相對較高；當NAA 濃度為1.0 mg/L 時，種子萌發(fā)率相對較低；當6-BA 濃度分別為1.0 mg/L 和1.5 mg/L，NAA濃度為0.5 mg/L 時，種子萌發(fā)率均為100%，芽生長較壯。因此，最適合藤苦參種子萌發(fā)的培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA+1 g/L 活性炭或MS+1.5 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA+1 g/L 活性炭。藤苦參種子萌發(fā)生長情況如圖1 所示。

表1 MS 培養(yǎng)基中不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑對藤苦參種子萌發(fā)的影響

圖1 藤苦參種子萌發(fā)情況

2.2 不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑對藤苦參芽誘導的影響

將藤苦參芽接種于叢生芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，40 d統(tǒng)計芽的增殖數(shù)。從表2 可以看出，當6-BA 濃度在0～3.0 mg/L 時，隨著濃度的升高，芽的增殖數(shù)量增多，且芽的長勢較好；當6-BA 濃度達4.0 mg/L 時，分化的芽數(shù)開始下降；其中11 號培養(yǎng)基芽的分化數(shù)量最多。相同6-BA 濃度的情況下，NAA 濃度為0.5 mg/L 時，分化的芽數(shù)相對較多。因此，最適合藤苦參叢生芽分化的培養(yǎng)基為MS+3.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA。藤苦參叢生芽分化具體生長情況見圖2。

表2 不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑對藤苦參芽誘導的影響

圖2 藤苦參叢生芽分化情況

2.3 活性炭對藤苦參生根壯苗的影響

將每天光照時間增加至14 h，植株生長旺盛，莖粗葉綠。生根培養(yǎng)50 d 后可長出2～4 條根，幼苗高為6～8 cm。由表3 和圖3 可知，添加活性炭的生根培養(yǎng)基中幼苗生長較壯，因此，最適合藤苦參生根壯苗的培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L NAA+1 g/L 活性炭。

圖3 藤苦參生根壯苗情況

表3 活性炭對藤苦參生根壯苗的影響

3 小結(jié)與討論

藤苦參為蘿藦科植物，已有同科其他植物組織培養(yǎng)研究的報道［4-9］，但未見藤苦參組織培養(yǎng)的報道。同科其他植物的組織培養(yǎng)外植體選用的是種子、莖尖、子葉、葉片等，藤苦參莖及葉均具有乳汁，且密被絨毛，在選擇外植體的時候考慮到外植體取莖尖不易滅菌，且其本身受傷會釋放乳汁影響外植體接種到培養(yǎng)基后的存活率等，所以，本研究選取種子作為外植體，可提高滅菌率，從而提高存活率。

藤苦參種子萌發(fā)培養(yǎng)中，當6-BA 濃度分別為1.0 mg/L 和1.5 mg/L，NAA 濃度為0.5 mg/L 時，種子萌發(fā)率為100%，芽生長均較壯，因此，在實際生產(chǎn)過程中，考慮到成本的因素，采用1.0 mg/L濃度的6-BA更合適。

在組織培養(yǎng)中，植物生長調(diào)節(jié)劑和生長素的合理搭配是達到最佳培養(yǎng)效果的關鍵，本研究中藤苦參叢生芽分化增殖培養(yǎng)采用了較高濃度的6-BA 和較低濃度的NAA 配合使用，這與高山林等［3］對藤苦參同科植物的組織培養(yǎng)研究結(jié)果相符。

培養(yǎng)基中添加活性炭在植物組織培養(yǎng)中較常見，在植物生根培養(yǎng)過程中，適當增加光照時間有利于幼苗生根，但強光直接照射根部會抑制根的生長，所以在生根壯苗培養(yǎng)基中添加活性炭可提供生根的暗環(huán)境，防止褐變；活性炭還可以吸附植物生長過程中釋放的一些有害物質(zhì)，因此，本研究中在生根壯苗培養(yǎng)階段添加活性炭，幼苗生長較壯。