梅毒螺旋體及其相關(guān)蛋白與不同宿主細(xì)胞相互作用的研究進(jìn)展

岳銳，鄭舉敦，廖玉輝，楊斌

梅毒(syphilis)作為全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題，長(zhǎng)期位居我國(guó)法定乙類(lèi)傳染病發(fā)病率的第三位[1]。梅毒螺旋體(Treponemapallidum, TP)作為梅毒的病原體，屬于密螺旋體屬蒼白密螺旋體中的蒼白亞種，其結(jié)構(gòu)由內(nèi)向外依次為圓柱狀原生質(zhì)體、內(nèi)鞭毛、胞質(zhì)膜、肽聚糖層、周質(zhì)空間、細(xì)胞外膜[2]。盡管其革蘭氏染色呈陰性，但因不含脂多糖，故不是嚴(yán)格意義的革蘭氏陰性菌。目前研究認(rèn)為,TP致病過(guò)程主要涉及暴露、黏附/定植、侵襲/感染、播散等環(huán)節(jié)，現(xiàn)已有眾多研究探索了TP致病過(guò)程中與不同宿主細(xì)胞相互作用的致病機(jī)制。本文將從不同過(guò)程，對(duì)TP及其相關(guān)蛋白在致病過(guò)程同各種宿主細(xì)胞相互作用的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 暴露

梅毒可通過(guò)性接觸、胎盤(pán)等方式進(jìn)行傳播，其中性接觸是最主要的傳播途徑。當(dāng)梅毒患者皮膚黏膜部位含有TP，性接觸過(guò)程中所產(chǎn)生的微擦傷會(huì)增加TP暴露感染風(fēng)險(xiǎn)，而這一過(guò)程中最先接觸的是表皮中含量最多的角質(zhì)形成細(xì)胞。

對(duì)此，Juanpere-Rodero等[3]發(fā)現(xiàn)在二期梅毒患者病理切片中，TP大量存在于表皮角質(zhì)形成細(xì)胞之間。在59例梅毒切片中，有39例(66.1%)出現(xiàn)了壞死角質(zhì)形成細(xì)胞，認(rèn)為角質(zhì)形成細(xì)胞壞死可能是二期梅毒的病理特征之一[4]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)是作用于細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的一類(lèi)蛋白水解酶。Tsai等[5]發(fā)現(xiàn)，梅毒與HIV共感染患者腦脊液(cerebrospinal fluid, CSF)中MMP-9、組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMP)-1、TIMP-2表達(dá)較正?；颊呙黠@升高，而TIMP-4表達(dá)下調(diào)，認(rèn)為梅毒與HIV共感染患者CSF中MMP/ TIMP系統(tǒng)平衡失衡。在細(xì)胞層面，Jiang等[6]研究也發(fā)現(xiàn)，TP鞭毛蛋白(Flagellin B, FlaB)可通過(guò)Toll樣受體5(Toll-like receptor 5, TLR5)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)/核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)通路刺激人角質(zhì)形成細(xì)胞系(HaCaT)產(chǎn)生MMP-9、MMP-13，從而有助于降解ECM成分，導(dǎo)致梅毒硬下疳潰瘍的發(fā)生。

2 黏附、定植

TP在既往研究中被發(fā)現(xiàn)為微需氧型菌，即僅在低濃度氧中生長(zhǎng)，一方面它缺乏抵抗活性氧(reactive oxygen species, ROS)中間產(chǎn)物的保護(hù)機(jī)制，另一方面TP生物合成能力有限，其生存需要黏附、定植于宿主細(xì)胞，從宿主細(xì)胞中攝取營(yíng)養(yǎng)成分，借助宿主細(xì)胞的過(guò)氧化氫酶等抵抗氧化物的毒性作用。TP的黏多糖酶有助于TP附著于黏多糖含量豐富的組織，如皮膚、臍帶、主動(dòng)脈、眼、胎盤(pán)等[7]?？傊壳罢J(rèn)為黏附是TP致病機(jī)制中的關(guān)鍵初始步驟，黏附宿主細(xì)胞對(duì)于TP的持續(xù)生長(zhǎng)和活力維持是必要的。

后續(xù)有眾多學(xué)者通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察到TP可黏附多種宿主細(xì)胞，如人皮膚上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞系Hela、兔睪丸細(xì)胞、棉尾兔上皮細(xì)胞(Sf1Ep cottontail rabbit epithelial cells, Sf1Ep)、大鼠原代神經(jīng)元細(xì)胞等。其中，F(xiàn)itzgerald等[8]發(fā)現(xiàn)，TP所黏附的細(xì)胞表面形態(tài)、活力并未發(fā)生改變，由此提出TP與細(xì)胞的黏附可能是一種物理黏附。我國(guó)學(xué)者Wu等[9]發(fā)現(xiàn)，TP能夠不均一地黏附于人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human brain microvascular endothelial cells, HBMEC)，且黏附數(shù)量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而遞增，在4 h黏附最多，然后黏附能力呈下降趨勢(shì)，該黏附也不改變細(xì)胞形態(tài)的完整性，部分TP可能通過(guò)末端與細(xì)胞膜溶解的方式黏附于細(xì)胞表面。這是學(xué)者們對(duì)于TP黏附現(xiàn)象的初步觀察。后續(xù)Lee等[10]發(fā)現(xiàn)，ECM成分纖連蛋白(fibro-nectin, FN)在介導(dǎo)TP黏附于宿主細(xì)胞中起到重要作用，且只有具備毒力的TP可通過(guò)結(jié)合人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human dermal microvascular endothelial cells, HDMEC)FN的RGD基序(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)，從而偶聯(lián)細(xì)胞整合素-α5β1而實(shí)現(xiàn)黏附，且該黏附可被抗-α5整合素抗體及合成的RGD肽段競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

TP0954是TP表面的脂蛋白，若在黏附缺陷的伯氏疏螺旋體B314菌株中表達(dá)此蛋白的基因，在硫酸皮膚素、硫酸乙酰肝素的介導(dǎo)下可促進(jìn)該菌株黏附不同宿主細(xì)胞如上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元、人胎盤(pán)絨毛膜癌BeWo細(xì)胞系及人胎盤(pán)組織切片等，這表明TP0954可能有助于TP定植皮膚上皮及遠(yuǎn)端播散性感染，特別是TP的跨胎盤(pán)傳播[11]。此外，TP黏附素TP0751、TP0136用類(lèi)似的基因操作方法也可與ECM成分(纖維蛋白原、FN、膠原Ⅰ、膠原Ⅳ、層粘連蛋白等)相互作用后黏附于宿主細(xì)胞表面[12-13]，這一操作方法為深入了解梅毒的發(fā)生發(fā)展及其免疫逃逸機(jī)制提供了技術(shù)支持。

另一方面，憑借TP容易黏附在Sf1Ep細(xì)胞的特點(diǎn)，目前TP體外培養(yǎng)主要采用在34 ℃、1.5%O2、5%CO2、93.5%N2環(huán)境下與Sf1Ep共培養(yǎng)的方式，但由于易污染、營(yíng)養(yǎng)成分等問(wèn)題仍不能實(shí)現(xiàn)TP在體外長(zhǎng)久、穩(wěn)定的增殖并保持其相當(dāng)毒力，因此，TP的體外培養(yǎng)方法仍然需要進(jìn)一步研究?jī)?yōu)化。

3 侵襲、感染

TP具有強(qiáng)大的侵襲、感染能力，導(dǎo)致梅毒發(fā)生發(fā)展過(guò)程中呈現(xiàn)不同的臨床癥狀，可分為一期的硬下疳，二期的梅毒疹、扁平濕疣，三期的樹(shù)膠腫、心血管、神經(jīng)梅毒等。在病原體侵襲、感染過(guò)程中，多種宿主免疫細(xì)胞、炎癥因子等發(fā)揮了重要的防御作用。

梅毒的基本病理改變?yōu)殚]塞性動(dòng)脈內(nèi)膜炎及小血管周?chē)祝憩F(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、增生，管壁增厚、管腔狹窄，管周淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞(human myeloid leukemia mononuclear cells, THP-1)、漿細(xì)胞等浸潤(rùn)。Gao等[14]研究發(fā)現(xiàn)，TP可通過(guò)NF-κB通路刺激人真皮血管平滑肌細(xì)胞(human dermal vascular smooth muscle cells, HDVSMCs)在蛋白及mRNA水平增加白介素6(interleukin, IL-6)、單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1)、細(xì)胞黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)的表達(dá)，從而促進(jìn)人THP-1向HDVSMC的黏附、遷移，為解釋TP所致的血管炎癥反應(yīng)提供新的見(jiàn)解。Zhang等[15]發(fā)現(xiàn)，TP0965可通過(guò)TLR2、MAPK通路(p-ERK、p-p38)誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)趨化素(chemerin)及其受體23(chemerinreceptor 23, ChemR23) 表達(dá)，以自分泌/旁分泌的方式激活HUVEC；并在Ras 同源基因家族成員A(ras homolog gene family member A, RhoA)/Rho相關(guān)蛋白激酶(Rho-associated protein kinase, ROCK)通路的參與下誘導(dǎo)THP-1衍生的巨噬細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞遷移。巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是早期殺滅TP的主力軍。有研究[16-17]發(fā)現(xiàn)，TP可激活絲氨酸/蘇氨酸激酶AKT-哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)-NF-κB通路，刺激巨噬細(xì)胞由M0型向促炎M1型方向極化，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。此外，TP刺激M0巨噬細(xì)胞可誘導(dǎo)Nod 樣受體家族包含 pyrin 結(jié)構(gòu)域蛋白3(nod like receptor pyrin domain containing 3, NLRP3)炎癥小體、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase-1)的活化，促進(jìn)IL-1β呈時(shí)間、劑量依賴性分泌[18]。以上這些結(jié)果均有助于闡釋梅毒血管炎癥的免疫發(fā)病機(jī)制。

P2X7受體(P2X7receptor, P2X7R)是ATP門(mén)控的三聚體離子通道，表達(dá)于大多數(shù)免疫、人體神經(jīng)元細(xì)胞等。胞外的ATP可激活 P2X7R，誘導(dǎo)鉀離子(K+)通道開(kāi)放，引起K+外流，K+水平的降低可激活 NLRP3 炎癥小體。Xu等[19]發(fā)現(xiàn)，TP可增加巨噬細(xì)胞P2X7R在mRNA、蛋白水平的表達(dá)，繼而激活NLRP3，促進(jìn)NLRP3依賴的IL-1β分泌增加及吞噬TP數(shù)量增多。此外，TP通過(guò)激活 NLRP3 炎癥小體可觸發(fā)巨噬細(xì)胞自噬以促進(jìn)TP的被吞噬和清除[20]。Hawley等[21]發(fā)現(xiàn)，二期梅毒患者皮損的免疫組織化學(xué)顯示TP存在于真表皮交界處、血管周?chē)Ｔ诿范靖腥驹缙?，巨噬?xì)胞結(jié)合有限數(shù)量的未被抗體調(diào)理的TP，分泌少量炎癥因子，造成TP的大量逃逸。隨后，在抗原遞呈細(xì)胞的作用下，淋巴細(xì)胞在局部分泌干擾素γ(interferon-γ, IFN-γ)等細(xì)胞因子，引發(fā)T細(xì)胞活化并協(xié)助B細(xì)胞成熟產(chǎn)生TP特異性抗體，這一過(guò)程也使得巨噬細(xì)胞表面FcγRs(主要為CD64)表達(dá)增加，促進(jìn)巨噬細(xì)胞在人梅毒血清(human syphilitic serum, HSS)作用下對(duì)TP的調(diào)理吞噬作用。但吞噬效果仍舊有限且對(duì)于吞噬后的進(jìn)一步發(fā)生發(fā)展過(guò)程還需進(jìn)行深入探討。

Marangoni等[22]從大鼠肝臟分離的庫(kù)普弗(Kupffer)細(xì)胞與TP孵育20 min后即可檢測(cè)到ROS，且35 min該值達(dá)到高峰。但細(xì)胞產(chǎn)生的ROS是否會(huì)對(duì)TP產(chǎn)生殺傷作用還需進(jìn)一步深入探討。

TP免疫逃逸的原因除了巨噬細(xì)胞的吞噬能力有限外，Babolin等[23]發(fā)現(xiàn)，二期梅毒患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)中Treg細(xì)胞(CD4+CD25+high)較正常對(duì)照組表達(dá)增多。而TPF1可加劇這一反應(yīng)并促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)、IL-10 分泌，導(dǎo)致細(xì)胞免疫受到抑制，這可能是造成TP在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期慢性感染的重要原因之一。

就神經(jīng)元細(xì)胞而言，Oakes等[24]將TP與大鼠背根神經(jīng)元細(xì)胞共孵育來(lái)探究細(xì)胞的電生理反應(yīng)并發(fā)現(xiàn)暴露于2×108條/mL TP 的神經(jīng)元細(xì)胞13 h后反應(yīng)異常，18 h后沒(méi)有反應(yīng)，持續(xù)孵育會(huì)造成細(xì)胞不同程度的破壞。而暴露于熱滅活TP或培養(yǎng)基的細(xì)胞在72 h后反應(yīng)正常。這一發(fā)現(xiàn)將有助于闡釋梅毒臨床表現(xiàn)中的無(wú)痛性及TP對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)的損害。

另外，梅毒雖可產(chǎn)生硬下疳，但?？勺杂uo等[25]發(fā)現(xiàn)，TP0136可通過(guò)TLR4誘導(dǎo)MCP-1/趨化因子受體2(chemokine C-C-motif receptor 2, CCR2)表達(dá)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞遷移，這可能為梅毒潰瘍后期自我愈合的機(jī)制之一。

4 播散

TP可通過(guò)血行、淋巴途徑，穿過(guò)血腦、血睪、胎盤(pán)屏障等播散到全身各臟器。但目前研究多集中于血行播散，對(duì)淋巴播散機(jī)制研究較少。

Salazar等[26]研究發(fā)現(xiàn)，新西蘭大白兔睪丸接種TP 24 h，即可在血液中檢測(cè)到TP-FlaA的拷貝數(shù)。在細(xì)胞層面，Thomas等[27]提出，相較滅活的、無(wú)致病性的Reiter株，只有有毒力的TP才能穿透內(nèi)皮細(xì)胞單細(xì)胞層。此外，透射電子顯微鏡捕捉到TP位于細(xì)胞間連接處，其可在不破壞緊密連接的情況下穿透內(nèi)皮細(xì)胞層，離開(kāi)血液循環(huán)系統(tǒng)而進(jìn)入組織間隙。TP0965預(yù)處理HUVEC后使細(xì)胞滲透性增強(qiáng)，肌動(dòng)蛋白F-actin的重塑增加，緊密連接蛋白Claudin-1的表達(dá)減少，表明TP0965可能通過(guò)改變細(xì)胞骨架蛋白結(jié)構(gòu)及緊密連接蛋白的表達(dá)而調(diào)節(jié)HUVEC滲透性[28]。Lithgow等[29]通過(guò)免疫熒光、Transwell小室模型也發(fā)現(xiàn)TP定位于內(nèi)皮細(xì)胞連接處，可在不破壞內(nèi)皮細(xì)胞屏障滲透性的情況下破壞內(nèi)皮細(xì)胞間鈣粘連蛋白(vascular endothelial-cadherin, VE-cadherin)，從而穿透內(nèi)皮細(xì)胞屏障，但膽固醇依賴的脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞抑制劑可抑制這一過(guò)程。因此推測(cè)，TP可能通過(guò)兩種方式穿透內(nèi)皮細(xì)胞屏障，一為“旁路”途徑，即破壞細(xì)胞間連接蛋白進(jìn)入，二為借助膽固醇依賴的脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞作用穿透內(nèi)皮細(xì)胞屏障。TP血管黏附素TP0751也可破壞VE-Cad-herin，但不能改變內(nèi)皮細(xì)胞屏障滲透性，也不能穿透內(nèi)皮細(xì)胞屏障。以上研究結(jié)果均有助于解釋TP的血行播散機(jī)制。

也有文獻(xiàn)報(bào)道TP外膜蛋白可促進(jìn)血管生成，從而有利于TP播散。TPF1刺激HUVEC后可通過(guò)活化環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)/NF-κB通路，使IL-8而非血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)分泌增加，促進(jìn)HUVEC增殖、遷移及微血管樣結(jié)構(gòu)形成[30]。同時(shí)，在斑馬魚(yú)卵黃囊注射TP47也同樣具有促進(jìn)血管生成的作用[31]。但尚未見(jiàn)TP本身促進(jìn)血管生成的報(bào)道。

近年來(lái)，研究[32]發(fā)現(xiàn)多種病原體可活化血小板，且血小板本身對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞屏障通透性具有雙向調(diào)控作用。Church等[33]利用羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(carboxyfluorescein succinimidyl ester, CFSE)染色TP，用標(biāo)記了PE/Cy5的血小板特異鼠抗人CD41單克隆抗體來(lái)指示血小板，應(yīng)用流式、暗視野顯微鏡等方法研究TP與血小板的相互作用，發(fā)現(xiàn)TP以其尖端或邊緣等方式活化血小板，并優(yōu)先與活化的血小板相互作用，增加其旋轉(zhuǎn)和平移速度，且這種相互作用是可逆的，這表明TP可能利用血小板功能來(lái)實(shí)現(xiàn)播散性感染。

5 總結(jié)

梅毒致病機(jī)制涉及暴露、黏附/定植、侵襲/感染和播散過(guò)程，已在過(guò)去全世界科研工作者的不斷努力下取得了許多進(jìn)展，但TP及其相關(guān)蛋白在與不同宿主細(xì)胞相互作用過(guò)程中的毒力維持情況、繁殖特點(diǎn)、被吞噬后的降解過(guò)程、在體內(nèi)的藏匿部位、淋巴播散方式等問(wèn)題仍需進(jìn)一步的深入研究。