sgp130對糖尿病小鼠視網膜p-STAT3及VEGF-A表達的影響

劉光輝，史常旋，洪雅軍，鄭永征，王 航2，，孟 春2，

0 引言

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)最常見的微血管并發(fā)癥和全球主要的致盲性眼病之一。DR發(fā)病機制復雜，至今仍未完全闡明。研究認為DR與蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)激活、多元醇代謝異常、己糖胺途徑增加、蛋白非酶糖基化等多因素有關[1]。自1990年代以來，炎性因子在DR發(fā)病過程中的作用日益受到重視，越來越多的研究表明炎癥反應異常激活在DR發(fā)病中起重要的作用[2-3]。白介素6(interleukin 6，IL-6)作為炎性因子在DR的啟動及發(fā)展中具有重要的地位[4-5]?？扇苄蕴堑鞍?30(soluble glycoprotein 130，sgp130)是IL-6的游離受體，能夠抑制IL-6反式信號轉導通路介導的炎癥[6]。本研究觀察了糖尿病小鼠視網膜中IL-6、p-STAT3和VEGF-A表達及sgp130的拮抗效應，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物清潔級6周齡ICR雄性小鼠45只，購買自上海斯萊克實驗動物有限責任公司[許可證號SCXK(滬)2017-0005]。實驗動物的飼養(yǎng)及處理遵循國家科學技術委員會1988年頒布的《實驗動物管理條例》執(zhí)行。本實驗通過福州大學實驗動物倫理學委員會審查。

1.1.2主要試劑及儀器sgp130(福州大學生物科學與工程學院CHO-K1SP穩(wěn)定細胞系表達并純化)，抗IL-6抗體(1∶1000，美國abcam公司)，抗p-STAT3抗體(1∶1000，美國CST公司)，抗VEGF-A抗體(1∶1000，武漢愛博泰克生物科技有限公司)，抗β-actin抗體(1∶1000，美國Proteintech)，生物素標記的羊抗兔IgG(1∶5000，美國abcam公司)，鏈脲佐菌素(Streptozotoci，STZ；美國Thermo Fisher公司)，RIPA裂解液、蛋白酶磷酸酶抑制劑(上海碧云天生物技術研究所)。G35注射器針頭、納升注射器(美國WPI公司)，蛋白垂直電泳槽(北京六一儀器廠)。

1.2方法

1.2.1動物模型及分組干預小鼠經簡單數(shù)字隨機法分為3組：正常組、DM組和sgp130組，每組各15只，其中DM組和sgp130組參考文獻[7]的方法行DM造模。臨用前以0.1mmol/L、pH4.5檸檬酸緩沖液溶解STZ，配制成1%溶液。小鼠禁食8h后，以STZ 60mg/kg進行腹腔注射，連續(xù)注射5d。造模結束3d后，取尾血行血糖測定，血糖≥11.1mmol/L者為造模成功。造模成功后，連續(xù)喂養(yǎng)10wk。于第1、5wk的第1d對sgp130組小鼠進行sgp130玻璃體腔注射，濃度為1.5mg/mL，注射量2μL，注射后予氧氟沙星滴眼液點眼，每日4次，共7d。正常組、DM組小鼠予常規(guī)喂養(yǎng)，不做特殊干預。

1.2.2蛋白免疫印跡法檢測IL-6和p-STAT3及VEGF-A蛋白造模成功并喂養(yǎng)10wk后，采用2%戊巴比妥鈉腹腔注射，過量麻醉處死所有小鼠，提取各組小鼠視網膜組織，每次隨機選取各組組內3只小鼠眼球做為1個蛋白樣本，每組各計3個樣本。參考文獻[7]的方法進行蛋白免疫印跡法檢測。加入含有RIPA裂解液對視網膜組織進行勻漿，4℃條件下離心5min，取上清。以BSA為標準，用Bradford法對上清進行蛋白定量。取20μg蛋白樣品，10% SDS-PAGE電泳，100V轉移1h至硝酸纖維素薄膜，放入封閉液中37℃封閉1h，一抗4℃過夜。同時，另1張用不含抗體TBS-T液孵育，作為陰性對照。反復洗膜后，將膜與抗IgG抗體孵育，室溫輕搖1h，洗膜后，用Western blotting印跡觀察。以β-actin作為內參，采用Gel-Pro Analyzer 4分析條帶光密度值，獲取目的蛋白相對表達量。

統(tǒng)計學分析：采用Graphad 6進行數(shù)據處理，采用單因素方差分析進行多組間比較，進一步的兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1sgp130對IL-6和p-STAT3蛋白表達的影響各組間IL-6、p-STAT3表達差異具有統(tǒng)計學意義(F=37.085、137.370，均P<0.01)。DM組(1.234±0.154)和sgp130組(1.190±.212)IL-6的表達水平較正常組(0.271±0.055)均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(t=2.674，P=0.01；t=3.902，P=0.002)。DM模型鼠中，sgp130組和DM組IL-6的表達水平差異無統(tǒng)計學意義(t=0.379，P=0.784)，見圖1A、D。DM組STAT3磷酸化增加，p-STAT3表達水平(0.989±0.030)較正常組(0.582±0.026)顯著升高,差異具有統(tǒng)計學意義(t=0.22，P<0.01)。sgp130組p-STAT3表達水平(0.492±0.055)較正常組差異無統(tǒng)計學意義(t=2.736，P=0.061)，較DM組顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(t=1.861，P<0.01)，見圖1B、D。

2.2sgp130對VEGF-A蛋白表達的影響各組間VEGF-A表達差異具有統(tǒng)計學意義(F=96.780，P<0.01)。DM組(0.509±0.047)和sgp130組(0.345±0.309)VEGF-A表達水平較正常組(0.140±0.008)均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(t=3.447、3.754，均P<0.01)。DM模型鼠中，sgp130組VEGF-A表達水平較DM組低，差異具有統(tǒng)計學意義(t=0.362，P=0.007)，見圖1C、D。

3 討論

低度慢性炎癥是DR發(fā)生發(fā)展中重要的因素，炎性因子在糖尿病視網膜微血管損害中具有重要的作用[2-3]。IL-6是人體中主要的炎性因子之一，主要由單核細胞、巨噬細胞、淋巴細胞等分泌產生。在生理條件下，健康個體血液中IL-6的濃度幾乎檢測不到；在炎癥病理條件下，IL-6水平可顯著上升[8]。臨床研究表明，DR患者的血清、房水和玻璃體中IL-6水平均有升高，并參與了DR的進程[9-10]。基礎研究結果提示，IL-6可誘導視網膜血管內皮細胞炎性損害，引發(fā)視網膜慢性炎癥等連鎖反應[7]。

IL-6的炎性效應主要由IL-6反式信號傳導通路介導，即IL-6與游離IL-6受體R(soluble IL-6 receptor，sIL-6R)結合形成活化的IL-6/sIL-6R復合物，復合物再與gp130結合，引起gp130的二聚體化，從而啟動細胞內信號傳導[11]。在病理情況下，IL-6和sIL-6R表達量將急劇增長，形成大量的IL-6/sIL-6R聚合體，通過反式途徑將IL-6信號傳入胞內，再通過JAK/STAT信號通路誘導炎性信號傳導因子STAT3磷酸化。并介導VEGF等下游炎癥因子的過表達，誘發(fā)炎性損害[12]。

動物研究顯示，糖尿病模型動物視網膜組織中IL-6及STAT3過表達，p-STAT3和VEGF明顯增加[13-14]。臨床觀察表明，DR患者的血清和房水IL-6和sIL-6R濃度顯著升高[15]；DR患者房水中IL-6水平隨著DR病變的嚴重程度增加，且與眼內VEGF的表達量呈正向相關性[16]。本研究結果顯示，DM小鼠視網膜組織較正常組在第10wk即可出現(xiàn)IL-6表達增高，STAT3磷酸化水平也升高，提示存在炎癥傳導通路的激活，且下游炎癥效應因子VEGF-A表達增強，與既往研究報道一致。因此，拮抗IL-6反式信號傳導通路抑制炎癥信號的傳遞可作為DR的一種潛在治療手段。

sgp130是IL-6反式信號傳導通路的天然拮抗劑。sgp130作為IL-6受體gp130的可溶性形式，廣泛分布于全身。其能與IL-6/sIL-6R結合，使IL-6/sIL-6R失活[6]，在不影響經典信號轉導的情況下選擇性阻斷IL-6反式信號轉導，可起到負性調節(jié)的作用。已有研究證實，中和IL-6及IL-6R對風濕性關節(jié)炎、哮喘、炎性腸病等多種炎性疾病均有改善作用[17]。因此，增加外源性sgp130拮抗IL-6/sIL-6R可抑制IL-6引起的視網膜炎性損害。Valle等[18]體外研究結果表明sgp130-Fc可以抑制IL-6反式信號通路，減輕視網膜血管內皮細胞炎癥和內皮屏障破壞。本研究從體內實驗角度揭示了sgp130能夠拮抗DM小鼠IL-6反式信號通路，下調STAT3磷酸化，降低p-STAT3的表達和下游炎癥因子VEGF-A的表達。VEGF是DM導致視網膜損害的一個重要炎性因子，sgp130能夠降低VEGF的表達，意味著sgp130能夠拮抗DM引起的視網膜炎癥損傷。然而，本研究也觀察到sgp130并不能完全阻斷VEGF表達水平的升高，提示VEGF的表達除了IL-6反式信號傳導通路外，可能還存在著其他信號通路的調控。

IL-6也是一個多效因子，其對組織還具有保護和抗炎效應，這種效應主要是通過IL-6的經典信號傳導通路來實現(xiàn)的。因此，完全阻斷包含IL-6經典途徑在內的信號傳遞可能帶來不良的副反應，如增加細菌或病毒感染風險等[6]。理論上sgp130可以選擇性拮抗IL-6反式信號通路，避免上述缺點。本研究的結果顯示，sgp130對糖尿病小鼠視網膜中IL-6的表達并無顯著影響，這可能與以下因素有關：(1)在DM狀態(tài)下，視網膜中IL-6升高主要歸因于IL-6系統(tǒng)性升高[7-8]；(2)sgp130對單獨的IL-6沒有可測量的親和力[6]，玻璃體腔注射sgp130失活的為IL-6/sIL-6R復合物，調控下游炎癥因子的表達，作用范圍局限于眼內，而對全身影響較小。研究還觀察到sgp130并未完全阻斷STAT3的磷酸化，這意味著外源性sgp130可以在不影響經典信號傳導通路的情況下，實現(xiàn)選擇性拮抗IL-6反式信號傳導通路抑制炎癥信號的傳遞，避免既往廣譜阻斷IL-6或IL-6R帶來的副作用。這或將成為sgp130拮抗DR炎癥損害的優(yōu)勢所在。

綜上所述，sgp130可以選擇性拮抗IL-6反式信號傳導通路，降低DM小鼠視網膜STAT3的磷酸化，下調下游炎癥因子VEGF-A的表達，可以用于干預DM引起的視網膜微血管的炎性損傷。