連接蛋白43:致盲性眼病治療新靶點(diǎn)

程馨儀，李 慧，王 方,2

0 引言

縫隙連接(gap junctions,GJs)又稱縫隙連接斑塊，由數(shù)十個(gè)甚至數(shù)千個(gè)排列整齊且緊密相鄰的通道組成。每一個(gè)完整的通道分別由相鄰細(xì)胞膜上兩個(gè)半通道(hemichannel)對(duì)接而成。半通道是由6個(gè)連接蛋白(connexins,Cxs)亞單位構(gòu)成的六聚體中空結(jié)構(gòu)，其中心孔徑為1.5nm，允許鈣離子等可溶性離子和分子量小于1.2kDa的小分子包括營(yíng)養(yǎng)素、氨基酸、核苷酸、多胺、第二信使或調(diào)節(jié)分子等直接通過。該通道具有親水性、低選擇性和低電阻等特點(diǎn)，主要功能是介導(dǎo)細(xì)胞間電和化學(xué)信號(hào)的傳遞，即縫隙連接通訊(gap junction intercellular communication,GJIC)，確保細(xì)胞代謝和電耦合，從而維持組織和器官內(nèi)環(huán)境平衡[1-2]。

Cxs在人類和小鼠中分別存在21種和20種亞型。其中，連接蛋白43(connexin 43,Cx43)是分布最廣泛、研究最深入的一種亞型[3]。Cx43不僅參與細(xì)胞間通訊，還參與細(xì)胞自噬、黏附、遷移、增殖分化等過程[4]，它對(duì)維持正常眼組織的生理功能具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，Cx43在角膜炎、白內(nèi)障、青光眼、糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)等常見致盲性眼病中發(fā)揮重要作用，參與炎癥、氧化應(yīng)激、上皮-間充質(zhì)樣細(xì)胞轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、血管滲漏與新生血管形成等病理過程。目前，多項(xiàng)研究表明靶向Cx43治療具有良好的臨床應(yīng)用前景，比如以Cx43為靶點(diǎn)治療角膜炎的藥物已進(jìn)入人類臨床試驗(yàn)Ⅱ期。本文將就Cx43在上述常見致盲性眼病發(fā)病機(jī)制中的作用和靶向Cx43治療進(jìn)展作一綜述。

1 Cx43的結(jié)構(gòu)與功能

Cx43基因GJA1 (gap junction protein alpha1)定位于6q22.31，其編碼的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為43kD，故命名為Cx43[4]。Cx43單體結(jié)構(gòu)由4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域、2個(gè)胞外環(huán)和3個(gè)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域包括胞內(nèi)環(huán)、氨基末端和羧基末端。Cx43與其他Cxs亞型的主要區(qū)別在于胞內(nèi)環(huán)和羧基末端氨基酸序列的差異[5]。Cx43羧基末端含有150個(gè)氨基酸，存在多種轉(zhuǎn)錄后修飾和蛋白質(zhì)結(jié)合的位點(diǎn)，調(diào)控Cx43蛋白的內(nèi)吞、降解及通道門控，還可以與β-連環(huán)蛋白、周期蛋白E、Src蛋白激酶等相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和遷移等正常生理過程[6]。在炎癥、氧化應(yīng)激、pH值降低等病理?xiàng)l件下，Cx43半通道開放并在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外環(huán)境之間形成直接聯(lián)系，允許Na+、K+自由通過，引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載，促進(jìn)小分子如ATP、谷氨酸等逃逸，抑制細(xì)胞代謝和細(xì)胞膜去極化，導(dǎo)致細(xì)胞損傷[7]。

2 Cx43與常見致盲性眼病

眼組織中，Cx43主要分布于角膜、晶狀體和視網(wǎng)膜，涉及的種屬?gòu)V泛，包括人、鼠、兔、雞、豬、斑馬魚等[8]。Cx43表達(dá)和分布異常，或Cx43介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊功能異常與多種致盲性眼病密切相關(guān)。

2.1Cx43與角膜炎Cx43分布于角膜的上皮細(xì)胞層及基質(zhì)層，形成角膜細(xì)胞間相互通訊的功能性網(wǎng)絡(luò)[9-10]。Chen等[11]通過選擇性地?fù)p傷體外培養(yǎng)的原代人或小鼠角膜基質(zhì)細(xì)胞中的單個(gè)靶細(xì)胞，引起靶細(xì)胞膜的短暫破裂，發(fā)現(xiàn)Cx43介導(dǎo)了靶細(xì)胞與其相鄰細(xì)胞間的Ca2+傳導(dǎo)，Ca2+內(nèi)流顯著增加。研究發(fā)現(xiàn)，病毒的雙鏈RNA類似物聚肌苷酸胞苷酸能夠抑制人角膜成纖維細(xì)胞中Cx43表達(dá)和GJIC活性，提示病毒感染下調(diào)GJIC的活性可能導(dǎo)致角膜基質(zhì)內(nèi)穩(wěn)態(tài)破壞[10]。在離體培養(yǎng)的人角膜成纖維細(xì)胞中，Cx43可以被腫瘤壞死因子α介導(dǎo)的泛素-蛋白酶體途徑降解[12]。而在化學(xué)燒傷或感染的人角膜臨床樣本中，Cx43信使RNA和蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，與角膜炎癥密切相關(guān)[13]。Qin等[14]采用shRNA-Cx43腺病毒抑制真菌性角膜炎小鼠模型中Cx43的表達(dá)或通過IL-17/Akt信號(hào)通路抑制Cx43，發(fā)現(xiàn)Cx43表達(dá)減少可以促進(jìn)角膜緣血管內(nèi)皮細(xì)胞激活，調(diào)節(jié)角膜早期炎癥反應(yīng)，利于抵抗真菌感染和角膜上皮損傷愈合。

2.2Cx43與白內(nèi)障Cx43主要分布于晶狀體的上皮細(xì)胞，其表達(dá)隨著晶狀體上皮細(xì)胞分化為成熟的纖維細(xì)胞而下調(diào)[15]。由于晶狀體無(wú)血管，晶狀體的大部分代謝物質(zhì)通過晶狀體上皮細(xì)胞間和晶狀體纖維之間的縫隙連接通道進(jìn)行運(yùn)輸[16]。與正常透明晶狀體相比，Cx43在白內(nèi)障患者的晶狀體中表達(dá)上調(diào)近50%[17]。年齡相關(guān)性白內(nèi)障的風(fēng)險(xiǎn)隨著氧化應(yīng)激和紫外線暴露增加[18-19]，采用過氧化氫或紫外線輻射處理人晶狀體上皮細(xì)胞HLE-B3可以激活Cx43半通道，促進(jìn)氧化還原代謝分子如過氧化氫、氧化型谷胱甘肽、還原型谷光甘肽的內(nèi)流或外流，進(jìn)而保護(hù)晶狀體免受氧化應(yīng)激損傷[20]。Liu等[21]通過表達(dá)泛素-K6W的轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)現(xiàn)，泛素化修飾的Cx43在小鼠晶狀體上皮細(xì)胞中積累，導(dǎo)致Ca+濃度顯著升高及鈣蛋白酶過度激活，誘發(fā)白內(nèi)障。此外，DeRosa等[22]報(bào)道Cx43可以與Cx50-S50P突變相互作用，抑制小鼠晶狀體上皮細(xì)胞中Cx43介導(dǎo)的GJIC，促進(jìn)白內(nèi)障形成。

2.3Cx43與青光眼研究發(fā)現(xiàn)，Cx43在青光眼患者視神經(jīng)和視網(wǎng)膜組織中表達(dá)升高并與星形膠質(zhì)細(xì)胞重塑和軸突順行運(yùn)輸有關(guān)[23]，星形膠質(zhì)細(xì)胞重塑促進(jìn)了視神經(jīng)篩板區(qū)結(jié)構(gòu)的改變，這一過程可促進(jìn)青光眼進(jìn)展[24]。Liu等[25]降低大鼠的眼灌注壓并向其玻璃體腔注射靶向Cx43基因的腺相關(guān)病毒載體以抑制膠質(zhì)細(xì)胞中Cx43的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Cx43表達(dá)降低能夠損害小動(dòng)脈和小靜脈的血管反應(yīng)性，間接證明了Cx43介導(dǎo)的膠質(zhì)細(xì)胞GJIC具有主動(dòng)調(diào)節(jié)靜息小靜脈直徑的生理功能。在單側(cè)持續(xù)眼壓升高的小鼠模型中，Cx43介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞間代謝物質(zhì)的重新分布，緩解了高眼壓所致的視神經(jīng)功能損傷[26]。此外，Xu等[27]在慢性眼壓升高的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞大量增殖并遷移至神經(jīng)纖維層和節(jié)細(xì)胞層，這與Müller細(xì)胞中Cx43半通道激活并釋放ATP密切相關(guān)。

房水分泌和引流的平衡調(diào)節(jié)是控制青光眼的主要手段[28]?？p隙連接介導(dǎo)的睫狀體上皮跨細(xì)胞離子轉(zhuǎn)運(yùn)被認(rèn)為是房水主動(dòng)分泌的動(dòng)力之一[29]。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠睫狀體色素上皮細(xì)胞中Cx43表達(dá)受Nectin信號(hào)通路調(diào)控，Cx43穩(wěn)定表達(dá)可以促進(jìn)房水分泌并維持眼內(nèi)壓[30]。敲除Cx43基因使小鼠睫狀體無(wú)色素上皮和虹膜中的Cx43部分失活后，色素上皮和無(wú)色素上皮之間出現(xiàn)擴(kuò)張，眼壓顯著降低[31]。Cx43在正常小梁網(wǎng)組織中穩(wěn)定表達(dá)，Yu等[32]在小鼠前房注射縫隙連接通道抑制劑甘珀酸或氟芬那酸，發(fā)現(xiàn)抑制GJs可以導(dǎo)致房水流出阻力增加和眼壓升高。

2.4Cx43與DR 正常條件下，Cx43在視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、Müller細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細(xì)胞中表達(dá)豐富[33]。研究發(fā)現(xiàn)，Cx43可以通過介導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)血管異常改變、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、EMT等過程參與DR。

Cx43在正常小鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管和供血?jiǎng)用}之間沿著內(nèi)皮細(xì)胞連接呈線狀表達(dá)，參與血管內(nèi)皮細(xì)胞與周細(xì)胞之間的功能性偶聯(lián)[34]。Tien等[35]通過研究糖尿病捐獻(xiàn)眼的視網(wǎng)膜組織發(fā)現(xiàn)，Cx43表達(dá)下調(diào)伴隨周細(xì)胞丟失和新生血管形成。同樣，鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型中，周細(xì)胞覆蓋血管范圍減小伴隨Cx43表達(dá)下調(diào)[36]。Tien等[37]報(bào)道，大鼠玻璃體腔注射Cx43小干擾RNA抑制Cx43的表達(dá)可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和新生血管形成，并引起血管滲漏和視網(wǎng)膜增厚。研究發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境下培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞或共培養(yǎng)的周細(xì)胞和Müller細(xì)胞中，Cx43表達(dá)下調(diào)并破壞了血管內(nèi)皮細(xì)胞之間、周細(xì)胞和Müller細(xì)胞之間的GJIC，從而影響細(xì)胞活性[38-39]。此外，高糖還可以誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中線粒體Cx43(mitochondria Cx43,mtCx43)表達(dá)水平降低，促進(jìn)了線粒體的斷裂和血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，而維持mtCx43水平能夠減少血管內(nèi)皮細(xì)胞的丟失[40]。

Mugisho等[41]研究發(fā)現(xiàn)，Cx43在增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy,PDR)患者和DR動(dòng)物模型Akimba小鼠的視網(wǎng)膜組織中表達(dá)增加，Liu等[42]也證實(shí)Cx43和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白在糖尿病小鼠視網(wǎng)膜和PDR患者纖維血管膜中表達(dá)顯著增加。低氧狀態(tài)下，小鼠視網(wǎng)膜星形膠質(zhì)細(xì)胞中Cx43磷酸化增加導(dǎo)致細(xì)胞間偶聯(lián)增加，促使細(xì)胞毒性分子從瀕臨死亡的星形膠質(zhì)細(xì)胞中轉(zhuǎn)移至其相鄰的健康細(xì)胞，擴(kuò)大了缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性損害，嚴(yán)重破壞了視網(wǎng)膜血管定向生成所需要的星形膠質(zhì)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)支架，進(jìn)而促進(jìn)異常血管生長(zhǎng)[43]。以上研究提示Cx43和星型膠質(zhì)細(xì)胞在新生血管的形成中發(fā)揮重要作用。

炎癥在DR病理過程中亦發(fā)揮重要作用。Mugisho等[44]采用高糖聯(lián)合炎癥因子白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和IL-18處理人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞ARPE-19，發(fā)現(xiàn)與單純炎癥因子處理組相比，聯(lián)合處理組的ARPE-19細(xì)胞中的IL-6、IL-8、單核細(xì)胞趨化蛋白1、可溶性黏附分子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和ATP等因子的表達(dá)顯著上調(diào)；而采用Cx43半通道阻滯劑Peptide5處理可明顯減少炎癥因子的表達(dá)和ATP釋放，提示Cx43半通道開放擴(kuò)大了DR病理過程中的炎癥反應(yīng)。Lyon等[45]研究發(fā)現(xiàn)高糖聯(lián)合炎癥因子IL-1β、IL-18處理可誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞發(fā)生EMT，表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變、閉鎖小帶蛋白1表達(dá)下降和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)上調(diào)，而應(yīng)用Cx43半通道阻滯劑Tonabersat可阻遏EMT過程。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子和高糖可以促使ARPE-19細(xì)胞Cx43半通道開放并大量釋放ATP，ATP促進(jìn)炎癥體復(fù)合物形成并增加IL-1β和VEGF的釋放，這些促炎因子的釋放可以進(jìn)一步激活Cx43半通道開放，從而形成一個(gè)永存的自分泌反饋環(huán)[46]。

3 Cx43靶向藥物與眼部疾病治療

Cx43靶向藥物主要包括三種，分別為Cx43模擬肽、Tonabersat和反義寡核苷酸(Antisense Oligodeoxynucleotides,AsODN)。

Cx43模擬肽包含以Cx43胞外環(huán)為靶點(diǎn)的Gap26、Gap27、Peptide 5和以Cx43 羧基末端為靶點(diǎn)的α羧基末端合成肽(alpha carboxyl-terminal peptides,αCT1)[47]。研究發(fā)現(xiàn)，Gap27可以加速離體人角膜傷口中巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)并促進(jìn)角膜傷口愈合，而在活體大鼠角膜縫合模型中卻發(fā)現(xiàn)，Gap27促進(jìn)粒細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥介質(zhì)的釋放，表明Gap27的促角膜愈合作用適用于淺表傷口，而不適用于深層角膜損傷[48]。應(yīng)用Peptide 5抑制ARPE-19細(xì)胞的Cx43半通道后，可以下調(diào)高糖和炎癥因子誘導(dǎo)的乳酸脫氫酶和ATP的釋放，并阻止Cx43的內(nèi)吞和降解，從而保護(hù)視網(wǎng)膜色素上皮外屏障的完整性[49]。在大鼠角膜創(chuàng)傷模型中，αCT1可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制Cx43與閉鎖小帶蛋白1結(jié)合從而降低Cx43的活性，減輕炎癥反應(yīng)并加快傷口愈合[50]。Obert等[51]采用激光光凝誘導(dǎo)小鼠脈絡(luò)膜新生血管或強(qiáng)光暴露破壞小鼠視網(wǎng)膜外屏障后，給予αCT1滴眼液治療，結(jié)果顯示其不僅可以減少脈絡(luò)膜新生血管的生成及滲漏，并且可以阻止強(qiáng)光損傷引起的RPE細(xì)胞形態(tài)紊亂，同時(shí)體外實(shí)驗(yàn)顯示αCT1可以獨(dú)立于Cx43穩(wěn)定RPE細(xì)胞的緊密連接。Huang等[52]應(yīng)用納米顆粒來裝載Cx43模擬肽并給予視網(wǎng)膜缺血大鼠模型玻璃體腔注射，持續(xù)釋放的Cx43模擬肽可以抑制炎癥反應(yīng)，并防止缺血引起的視網(wǎng)膜變薄和視網(wǎng)膜血管破壞，有望應(yīng)用于DR、青光眼等與視網(wǎng)膜缺血相關(guān)的眼病治療中。

Tonabersat是一種新型苯并吡喃衍生物,其作用效果與Peptide 5類似。Tonabersat的優(yōu)勢(shì)主要在于它能夠通過血腦屏障，故可以采用口服途徑給藥[46]，多項(xiàng)研究證實(shí)Tonabersat在DR病理過程中具有保護(hù)視網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)和功能的重要作用，其安全性驗(yàn)證正在進(jìn)行Ⅱ期臨床試驗(yàn)[53]。最新研究發(fā)現(xiàn)，Tonabersat可以通過抑制炎癥體途徑減輕干性黃斑變性大鼠模型的炎癥反應(yīng)，并保護(hù)視網(wǎng)膜光感受器和雙極細(xì)胞的功能[54]。

AsODN是由13～25個(gè)核苷酸組成的單鏈核酸，其堿基序列與目標(biāo)基因RNA序列互補(bǔ)并特異性地結(jié)合形成雙鏈結(jié)構(gòu)，從而沉默靶基因[55]。兔青光眼小梁切除術(shù)模型中，結(jié)膜下注射Cx43 AsODN可以抑制結(jié)膜瘢痕形成和纖維化[56]。Grupcheva等[57]應(yīng)用Cx43AsOSN處理大鼠機(jī)械刮傷角膜模型，發(fā)現(xiàn)AsODN減輕了角膜基質(zhì)的水腫和炎癥反應(yīng)，更完整地修復(fù)角膜上皮基底層，從而顯著提高了傷口的閉合率。Ormonde等[58]首次報(bào)道了5例應(yīng)用Cx43 AsODN治療嚴(yán)重眼表燒傷患者的前瞻性臨床研究，結(jié)果顯示Cx43 AsODN治療1～2d后炎癥反應(yīng)明顯減輕，最終5例患者均獲得了完整、穩(wěn)定的角膜上皮再生。目前，應(yīng)用天然寡核苷酸Nexagon，CODA001治療角膜上皮缺損的人類Ⅱ期臨床試驗(yàn)研究正在進(jìn)行中[59]。

4 展望

Cx43在維持眼組織正常結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮多重關(guān)鍵作用，如參與角膜細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、晶狀體代謝、眼內(nèi)壓維持、星型膠質(zhì)細(xì)胞激活和視網(wǎng)膜血管調(diào)節(jié)等。Cx43表達(dá)異?；蚱浣閷?dǎo)的縫隙連接通道異常與角膜炎、白內(nèi)障、青光眼、DR等常見致盲性眼病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。探索以Cx43為靶點(diǎn)的藥物有望為常見致盲性眼病的治療提供嶄新的方向。