二代測(cè)序技術(shù)在胸腔積液病因診斷中的應(yīng)用進(jìn)展

滕佳凝 魏 麗

山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，山東 泰安 271000

胸腔積液是多種疾病都可能引起的臨床表現(xiàn)，經(jīng)過(guò)胸部影像學(xué)檢查能明確其診斷，但其病因復(fù)雜。通過(guò)分析積液的性質(zhì)，臨床將其分為漏出性胸腔積液和滲出性胸腔積液。漏出性胸腔積液的最常見(jiàn)病因?yàn)槌溲孕牧λソ?，在急性腎小球腎炎、肝硬化等疾病中也可見(jiàn)到。而滲出性胸腔積液，常見(jiàn)有結(jié)核性胸腔積液、類肺炎性胸腔積液、惡性胸腔積液，其中結(jié)核性胸腔積液在臨床滲出性胸腔積液中最為常見(jiàn)［1-2］。通常情況下，對(duì)患者采取胸腔穿刺或閉式引流，在治療的基礎(chǔ)上同時(shí)獲取用于分析的胸腔積液，并對(duì)其進(jìn)行檢驗(yàn)，以明確胸腔積液的性質(zhì)。相關(guān)研究顯示，不明原因的胸腔積液在臨床病例中所占比例可達(dá)20%左右［3］。若要對(duì)胸腔積液進(jìn)行根本性的治療，需要進(jìn)一步明確其產(chǎn)生的病因。

二代測(cè)序（next-generation sequencing，NGS）技術(shù)是一項(xiàng)正在飛速發(fā)展的新興技術(shù)，擁有著諸多優(yōu)點(diǎn)，有望成為主流的檢測(cè)方式之一。本文將主要對(duì)目前臨床上胸腔積液的傳統(tǒng)檢驗(yàn)及檢測(cè)、NGS對(duì)診斷胸腔積液病因的價(jià)值以及選取胸腔積液作為樣本進(jìn)行NGS檢測(cè)的可行性作一綜述。

1 胸腔積液的傳統(tǒng)檢測(cè)項(xiàng)目及其局限性

臨床上，想要明確胸腔積液的病因首先要區(qū)分其性質(zhì)，常用區(qū)分其性質(zhì)的檢查包括胸水常規(guī)、生化檢查、微生物學(xué)檢驗(yàn)、免疫學(xué)檢驗(yàn)及細(xì)胞學(xué)檢查等。其中，在良惡性胸腔積液鑒別方面，酶學(xué)檢測(cè)中乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）以及腺苷脫氨酶（adenosine deaminase，ADA）的檢測(cè)被認(rèn)為有較大診斷價(jià)值。研究表明，結(jié)核性胸腔積液中ADA的水平升高，膿性及腫瘤性胸腔積液中LDH顯著升高［4］。此外，免疫學(xué)檢測(cè)中腫瘤標(biāo)志物、腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素、類風(fēng)濕因子、C-反應(yīng)蛋白等指標(biāo)也具有較高價(jià)值。腫瘤標(biāo)志物包括癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)抗原（squamous cell carcinoma associated antigen，SCCA）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuronspecific enolase，NSE）、細(xì)胞角蛋白19的可溶性片段（Cyfra21-1）等［5］，在鑒別良惡性胸腔積液中發(fā)揮重要的作用。佟威威等［6］研究表明，Cyfra21-1 及NSE等腫瘤標(biāo)志物在惡性胸腔積液中的水平明顯升高，且其水平與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。以上指標(biāo)在診斷中僅起到一定輔助作用，惡性胸腔積液鑒別診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”仍是通過(guò)細(xì)胞學(xué)檢查尋找腫瘤細(xì)胞［7］，如發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞即可診斷惡性胸腔積液。對(duì)于疑似感染引起的胸腔積液，有細(xì)菌涂片、培養(yǎng)，真菌涂片、抗酸染色等微生物檢查來(lái)進(jìn)一步尋找其病因。

臨床常見(jiàn)的檢測(cè)項(xiàng)目有一定的局限性：微生物培養(yǎng)需要至少3 ～ 7天，結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)時(shí)間則更長(zhǎng)，易延誤治療，而且其總體陽(yáng)性率較低。有研究表明，僅有56%的病例中獲得陽(yáng)性培養(yǎng)物［8］。另外，一些特殊病原體很難通過(guò)培養(yǎng)獲得，如軍團(tuán)菌、支原體、衣原體等；胸水脫落細(xì)胞學(xué)的總陽(yáng)性率約在40% ～ 87%之間［9］，且其受外來(lái)因素影響較大。這使一些胸腔積液經(jīng)過(guò)常規(guī)檢查后仍不能明確診斷。臨床上對(duì)這種患者更多采用胸膜活檢，取材后再通過(guò)組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)與病原學(xué)檢查明確診斷。經(jīng)皮穿刺胸膜活檢創(chuàng)傷小，更易為患者所接受，但取材陽(yáng)性率相比胸腔鏡低［10］。近年來(lái)，胸腔鏡作為安全、有效、易操作的微創(chuàng)檢查技術(shù)，在診斷胸腔積液病因中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，與常規(guī)檢查相比，其更能增加胸腔積液病因的檢出率［11-13］，但在胸膜腔嚴(yán)重粘連，不能建成良好的人工氣胸帶，術(shù)前反復(fù)行胸腔穿刺，氧飽和度在吸氧后仍低，不能耐受低氧以及病程長(zhǎng)、年紀(jì)大的患者中仍受一定的限制［14］；且胸膜活檢為有創(chuàng)檢查，并非每一位患者都能接受，在臨床上很難大范圍開(kāi)展。選用胸腔積液，有采集方便、創(chuàng)傷小等優(yōu)點(diǎn)。因此，選用胸腔積液作為樣本，選取更準(zhǔn)確的檢測(cè)方法對(duì)臨床診斷及治療有極大的價(jià)值。探究更準(zhǔn)確、快捷的檢測(cè)新方法，來(lái)滿足臨床診斷的需要，是目前需要關(guān)注的重點(diǎn)。

2 NGS的優(yōu)勢(shì)及不足

NGS 也被稱為高通量測(cè)序，是一種高通量、檢測(cè)時(shí)間短、準(zhǔn)確度高、信息量大的新一代檢測(cè)方法。它可以同時(shí)對(duì)數(shù)千至數(shù)億個(gè)DNA 片段進(jìn)行獨(dú)立的測(cè)序。在微生物檢測(cè)、腫瘤診斷及其靶向藥物治療指導(dǎo)等方面有較大的臨床價(jià)值［15］，受抗生素、厭氧環(huán)境的限制也較?。?6-17］。在癌癥研究方面，NGS 通過(guò)設(shè)定可以關(guān)注多個(gè)靶向區(qū)域，其中包括已知的驅(qū)動(dòng)基因，且可以識(shí)別序列變異，其結(jié)果具有較高的可信度和準(zhǔn)確性［18-19］。研究表明，NGS 更易檢測(cè)基因突變，包括罕見(jiàn)基因，進(jìn)而指導(dǎo)靶向藥物治療［20］。

在病原微生物檢測(cè)方面，可分為靶向基因檢測(cè)（target next-generation sequencing，tNGS）和宏基因檢 測(cè)（macro next-generation sequencing，mNGS）。tNGS 對(duì)從樣本中提取的DNA 使用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)引物組進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)得到的擴(kuò)增子進(jìn)行測(cè)序，對(duì)比數(shù)據(jù)庫(kù)以確定樣品中存在的微生物及其相對(duì)豐度。檢測(cè)目標(biāo)僅涵蓋預(yù)定好的病原體，不會(huì)受到背景菌及人源核酸的影響，且其操作簡(jiǎn)便、成本較低，更適合用于臨床常規(guī)病原學(xué)檢測(cè)。tNGS 對(duì)于耐藥基因及突變檢測(cè)有較高的敏感性，在某些遺傳性疾病的診斷及研究中也發(fā)揮著重要作用［21］。mNGS 不依賴PCR，直接對(duì)樣本中的總核酸進(jìn)行高通量測(cè)序，并為檢測(cè)到的所有基因產(chǎn)生相對(duì)豐度信息。其優(yōu)點(diǎn)包括： 檢測(cè)范圍廣、種類多，無(wú)需培養(yǎng)，可檢測(cè)出多重感染以及靈敏度高等［22-25］。mNGS 可以更全面地識(shí)別混合肺部感染的病原體。幾乎所有病原體，如病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)等，都可在一個(gè)單一樣本中檢測(cè)識(shí)別出來(lái)［26-27］，能有效提高診斷效率。有研究顯示，mNGS對(duì)肺部感染病原體的總體陽(yáng)性率為82.14%，明顯高于常規(guī)檢測(cè)的35.71%［28］。Wang 等［29］研究顯示，mNGS診斷混合肺部感染的靈敏度和特異度分別為97.2%和63.2%，而選用傳統(tǒng)的檢驗(yàn)，其靈敏度和特異度分別為13.9%和94.7%。由此可見(jiàn)mNGS在靈敏度方面有顯著的優(yōu)勢(shì)。

無(wú)論是mNGS還是tNGS，都具有靈敏度高及速度快等優(yōu)勢(shì)，最快在24 h 內(nèi)可以出結(jié)果［16］，在臨床相關(guān)疾病診斷和治療方面具有很大的指導(dǎo)價(jià)值。Xu等［30］提供的1項(xiàng)臨床案例顯示，通過(guò)NGS在送檢樣本鑒定出大量鮑曼不動(dòng)桿菌，實(shí)現(xiàn)了重癥肺炎的快速診斷，為制定抗生素治療方案提供了及時(shí)且有效的信息。在診斷疑難雜癥方面，Wu等［31］報(bào)道了1例運(yùn)用NGS 技術(shù)成功檢測(cè)不明原因胸腔積液的病例，患者住院期間胸水、痰、血培養(yǎng)均為陰性，NGS結(jié)果顯示肺泡灌洗液中存在陰道加德納菌。此外，也有1 例不明原因胸腔積液的患者，在常規(guī)病原學(xué)檢查得到陰性結(jié)果后，送檢NGS，最終檢測(cè)出星座鏈球菌［32］。這些案例可以證實(shí)NGS 可以有效診斷傳統(tǒng)培養(yǎng)顯示陰性結(jié)果的疑難病例。

雖然NGS 具有的種種優(yōu)點(diǎn)被認(rèn)為有可能取代傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)方法，但其依舊存在一些局限性：mNGS 在區(qū)分定植菌、背景菌與感染及外來(lái)污染的能力較差。目前尚無(wú)權(quán)威的指南來(lái)解讀mNGS的報(bào)告，這對(duì)臨床醫(yī)生仍是個(gè)巨大的挑戰(zhàn)［33-34］；另外，其成本較常規(guī)檢測(cè)高，很難在臨床上大規(guī)模開(kāi)展；tNGS雖然成本較低，但只針對(duì)設(shè)定好的病原體進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果陰性率較高。這些缺點(diǎn)仍需要進(jìn)一步的研究及技術(shù)克服。

3 胸腔積液檢測(cè)中NGS的應(yīng)用

雖然NGS 診斷疾病的相關(guān)研究為目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的重點(diǎn)，但利用胸腔積液來(lái)進(jìn)行NGS檢測(cè)的相關(guān)文獻(xiàn)依舊很少，大部分研究選取肺泡灌洗液作為樣本進(jìn)行檢測(cè)。這與肺泡灌洗液的檢測(cè)可靠性相對(duì)更高有關(guān)［35］，但這并不能否定胸腔積液在NGS檢測(cè)方面的臨床價(jià)值。由于上呼吸道與外界相通，有很多外來(lái)微生物，口咽處也有很多正常定植細(xì)菌及共生生物，自然咳出的痰易受其污染。因此留取標(biāo)本的質(zhì)量不能保證，應(yīng)用NGS檢測(cè)痰液可能具有一定的局限性［36-37］。而支氣管鏡肺泡灌洗液直接取于病變的部位，受口咽部定植菌污染小，病原學(xué)檢測(cè)準(zhǔn)確率較高［38］。但其為侵入性檢查，仍存在一些相關(guān)并發(fā)癥（如氣道痙攣等）［39］，并非所有患者都能接受此檢查。胸腔積液作為樣本進(jìn)行NGS 的可行性也通過(guò)一些研究得以證明，Yi等［40］對(duì)某血液及痰液培養(yǎng)均為陰性的患者胸腔積液行NGS，成功檢測(cè)出嗜肺軍團(tuán)菌，其原始讀數(shù)為2 867個(gè)。給予莫西沙星治療后，患者癥狀在1 周內(nèi)消失，再行NGS，未測(cè)出嗜肺軍團(tuán)菌。Guo等［41］在探討mNGS對(duì)兒童侵襲性肺炎球菌病的診斷價(jià)值的研究中發(fā)現(xiàn)，選用胸腔積液的試驗(yàn)組靈敏度（90.9%）遠(yuǎn)大于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的靈敏度（36.3%）。此外，Kanellakis等［42］對(duì)成人胸膜感染病原體的研究也證實(shí)了選取胸腔積液進(jìn)行NGS從而明確診斷的可行性。胸膜腔具有無(wú)菌的特性，這使得其涂片或者培養(yǎng)的陽(yáng)性率較低［43］。但從另一方面來(lái)說(shuō)，當(dāng)患者出現(xiàn)胸腔積液的臨床表現(xiàn)時(shí)，若其是病原體感染引起，以胸腔積液作為標(biāo)本得到的結(jié)果或許更有利于臨床醫(yī)生診斷病因；且胸腔積液的獲取更為方便，更易為患者所接受。因此在臨床上大規(guī)模開(kāi)展的可能性更高。

對(duì)于患有肺部惡性腫瘤，尤其是非小細(xì)胞肺癌患者，晚期常伴有惡性胸腔積液，此時(shí)大多數(shù)患者已不耐受手術(shù)，難以獲取腫瘤組織標(biāo)本。因此，可考慮選擇胸腔積液行NGS檢測(cè)特定基因突變，從而對(duì)患者制定個(gè)體化的靶向治療。另一方面，肺癌患者的免疫功能較差，在治療期間容易發(fā)生致病菌感染等情況。感染的部位多為肺部［44］，也可累及胸膜。當(dāng)患者出現(xiàn)感染時(shí)，往往會(huì)導(dǎo)致病情加速惡化，對(duì)后期的治療產(chǎn)生不利影響，需要盡早進(jìn)行干預(yù)［44-45］。當(dāng)患者出現(xiàn)胸腔積液時(shí)，選用NGS 可鑒別是惡性胸腔積液還是感染引起的胸腔積液，從而進(jìn)一步選擇合適的治療方案，這對(duì)肺癌患者的臨床治療及預(yù)后有著重要的意義。

4 總結(jié)與展望

NGS 作為一種新興技術(shù)手段，沖破了傳統(tǒng)檢驗(yàn)的局限，為快速、準(zhǔn)確的診斷患者病因提供了一種新的可能。在檢測(cè)罕見(jiàn)病原體、混合病原體及重癥感染方面顯示出明顯的優(yōu)勢(shì)，在肺惡性腫瘤晚期患者行特定基因突變檢測(cè)方面也有著重要意義。雖然目前無(wú)法替代傳統(tǒng)方法成為臨床疾病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但可作為一種有效的補(bǔ)充方法。而對(duì)于一些新發(fā)、疑難感染性疾病及免疫缺陷的患者，則可作為一線的檢測(cè)方法。在NGS的樣本選取上，胸腔積液擁有諸多優(yōu)勢(shì)。臨床上患者對(duì)胸腔穿刺引流的接受度也較高，對(duì)于癌癥晚期患者，選取胸腔積液也是相對(duì)簡(jiǎn)便可行的辦法。綜上所述，對(duì)不明原因的胸腔積液患者，抽取其胸腔積液行NGS 檢測(cè)，對(duì)臨床疾病明確診斷和早期干預(yù)有著重要的意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突