棉花枯萎病室內(nèi)苗期抗病性鑒定方法及評價(jià)

龍?zhí)煊?鄧亞輝,祖倩麗,楊 龍,曲延英,陳全家

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/棉花教育部工程研究中心,烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】高密度栽培、寬膜覆蓋、膜下滴灌等新技術(shù)的應(yīng)用,使得棉花單產(chǎn)、品質(zhì)等得到大幅度提高,但是土傳病害枯萎病危害也愈發(fā)明顯[1],棉花枯萎病(Fusarinmoxysporumf.sp.vasinfectum(Atk)Synder et Hansen)是棉花種植期的一種常見土傳性病害,是棉花生產(chǎn)上危害最大的檢疫性病害之一[2],其病原菌為尖孢鐮刀菌萎蔫?；?屬半知菌亞門鐮孢屬,菌絲透明,具分隔,在側(cè)生的孢子梗上生出分生孢子[3]。陸地棉枯萎病時(shí)有發(fā)生[4],選育抗病品種是最經(jīng)濟(jì)有效的辦法[5,7],研究陸地棉種質(zhì)資源對枯萎病尖孢鐮刀菌萎蔫?；?Fusariumoxysporumf.sp.Momordicae)7號生理小種的抗病性。選育和推廣抗病品種(系)是解決病害的重要手段,對棉花抗病育種研究有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】趙俊興等[6]對160個(gè)陸地棉棉花品種(系)的抗枯萎病鑒定結(jié)果分析,枯萎病呈高抗的品種有71個(gè),占測試品種的38.1%。林玲等[7]研究表明,將2014～2017年4 a內(nèi)共有78樣次的棉花品種參加長江流域棉花新品種區(qū)試的枯萎病抗性鑒定,高抗和抗性品種比例之和分別為47.6%、55.6%、38.9%、57.1%;參加了江蘇省棉花品種區(qū)試的抗枯萎病性鑒定的棉花品種共有53樣次,參試棉花品種整體對枯萎病的抗性水平較好,高抗和抗性品種的比例之和分別為32.0%、66.7%、62.5%和57.1%。趙沛等[8]研究表明,2010～2019年10年間通過對江西省207份材料進(jìn)行抗枯萎病性鑒定表明,參試品種的抗枯萎病性水平較高,高抗以及抗病品種占總參試品種的37.20%?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】棉花苗期枯萎病抗性鑒定有耗時(shí)短,受外界因素影響較小的特點(diǎn)。需研究確定棉花苗期抗枯萎病鑒定較為準(zhǔn)確的方法,并通過區(qū)分病級后以品種(系)整體的相對病情指數(shù)來評價(jià)抗性類型?！緮M解決的關(guān)鍵問題】選取265份陸地棉種質(zhì)資源進(jìn)行苗期枯萎病抗病性鑒定及評價(jià),篩選出具有抗病性的品種(系),為棉花抗病育種的選育及品種(系)改良提供技術(shù)支持和基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 棉花品種

選取265份陸地棉種質(zhì)資源材料作為供試品種,材料來源:中國、巴基斯坦、澳大利亞、美國和法國等32個(gè)國內(nèi)外不同地域的陸地棉品種(系),選擇中國新疆材料軍棉1號為感病對照品種,供試材料均由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 供試菌種

棉花枯萎病病原菌(尖孢鐮刀菌7號生理小種)由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方 法

1.2.1 棉花枯萎病孢子懸浮液制備

將實(shí)驗(yàn)室前期已純化保存好的尖孢鐮刀菌7號生理小種在PDA(馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂)培養(yǎng)基上活化,25℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)7 d,用無菌鑷子挑取直徑約為0.6～0.8 cm菌塊,取6塊移入裝有250 mL Czapek's(蔗糖7.5 g、NaNO30.75 g、K2HPO40.25 g、KCl 0.125 g、MgSO4·7H2O 0.125 g、FeSO40.002 5 g、蒸餾水250 mL)培養(yǎng)基500 mL規(guī)格的錐形瓶中,置于溫度28℃、轉(zhuǎn)速200 r/min全自動(dòng)控溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)4 d,隨后將孢子懸浮液用4層無菌紗布過濾菌絲和菌塊,用16×25 血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),配制成1×106個(gè)孢子/mL濃度的孢子懸浮液,供接種試驗(yàn)備用[9,10]。

1.2.2 棉花種子處理及鑒定苗培育

選取已用硫酸脫絨過的籽粒飽滿、大小一致的棉花種子,用70%酒精消毒5 min,再經(jīng)15%的H2O2表面滅菌3 h,用無菌水沖洗5～6次后播種在無紡布育苗袋的無菌營養(yǎng)土中[11],每個(gè)育苗袋種6～7粒種子。以無菌水作對照,設(shè)2個(gè)重復(fù)作接菌處理,每個(gè)重復(fù)種2個(gè)育苗袋,待出土后每個(gè)育苗袋只留5株長勢均勻的棉苗繼續(xù)培育,即每個(gè)品種(系)留苗15株,每一批種植的品種(系)均以軍棉1號作對照品種。培育條件為白天25～30℃,夜間20～25℃,光照時(shí)間12 h/12 h,其他條件正常處理,培育幼苗健壯生長。

1.2.3 室內(nèi)棉花苗期枯萎病種植及鑒定

待無紡布育苗袋培育的棉花幼苗長至兩葉一心(兩片子葉一片真葉)期時(shí),采用傷根灌菌液的鑒定方法[12],即在無紡布育苗袋中的幼苗周圍距離莖約1.5～2.0 cm處采用無菌刀片垂直傷根,接菌前2 d暫不澆水,每個(gè)育苗袋用25 mL規(guī)格玻璃試管量取20 mL配制好濃度(1×106個(gè)孢子/mL)的菌懸液澆灌幼苗根部。接菌后第7 d開始調(diào)查棉花枯萎病發(fā)病情況,棉苗發(fā)病后記錄感病對照品種軍棉1號的病情指數(shù),待感病材料的病情指數(shù)為40.0～66.7時(shí),調(diào)查記錄各品種(系)的發(fā)病情況。圖1

注:A、B、C為同一品種(系),A為正常對照,B、C為接種棉苗

1.2.4 棉花苗期枯萎病抗病性鑒定指標(biāo)及評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.2.4.1 病害的調(diào)查及病級標(biāo)準(zhǔn)

當(dāng)調(diào)查的棉苗普遍發(fā)病后,感病對照軍棉1號病情指數(shù)達(dá)到40.0～66.7時(shí),采用5級分級法[7,13],統(tǒng)一記錄各品種(系)的病害等級發(fā)生情況,計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)。觀察棉苗葉片病變情況,統(tǒng)計(jì)并記錄病害數(shù)據(jù)。表1,圖2

表1 室內(nèi)棉花苗期枯萎病發(fā)病分級標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Grading standards for fusarium wilt Disease in greenhouse cotton seedlings

圖2 棉花苗期枯萎病病級標(biāo)準(zhǔn)表型

1.2.4.2 抗病性評價(jià)

以病葉調(diào)查時(shí)的實(shí)際病情指數(shù)(Disease index,DI)乘以校正系數(shù)K校正,計(jì)算出相對病情指數(shù)(Relative disease index,RDI)來評價(jià)各品種的抗性水平。

采用相對病情指數(shù)來劃分抗性類型,先用50.0除以感病對照實(shí)際病情指數(shù),計(jì)算校正系數(shù)K值,K值在0.75～1.25(50為規(guī)定感病對照品種的標(biāo)準(zhǔn)病指,感病對照病情指數(shù)應(yīng)為40.0～66.7),將參試品種實(shí)際病情指數(shù)乘以K值(%)。

K=50/DIck.

式中,DI為感病對照實(shí)際病指,50為規(guī)定感病對照品種的標(biāo)準(zhǔn)病指。

相對病情指數(shù)(X)=品種(系)病情指數(shù)實(shí)測值×校正系數(shù)(K)。

品種抗病類型根據(jù)校正后相對病情指數(shù)(RDI)按全國統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)劃分為 5個(gè)級別[13]。 表2

表2 室內(nèi)棉花苗期枯萎病抗病性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Evaluation criteria for fusarium wilt Resistance of greenhouse cotton seedlings

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用 Excel 2010及SPSS 19.0軟件對調(diào)查的數(shù)據(jù)進(jìn)行基本計(jì)算、處理和相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 重復(fù)間發(fā)病率與相對病情指數(shù)的相關(guān)性

研究表明,重復(fù)1、重復(fù)2的發(fā)病率與相對病情指數(shù)均呈極顯著正相關(guān),其中重復(fù)1發(fā)病率與重復(fù)2相對病情指數(shù)的相關(guān)性最小,相關(guān)系數(shù)為0.770;重復(fù)1和重復(fù)2相對病情指數(shù)的相關(guān)性最大,相關(guān)系數(shù)達(dá)0.923。表3

2.2 重復(fù)間發(fā)病率與相對病情指數(shù)頻率

研究表明,重復(fù)1、重復(fù)2及均值的分布情況均呈正態(tài)分布,重復(fù)1發(fā)病率的均值為54.91%,標(biāo)準(zhǔn)偏差為19.86%;重復(fù)2發(fā)病率的均值為53.58%,標(biāo)準(zhǔn)偏差為19.29%;兩重復(fù)平均發(fā)病率的均值為54.25%,標(biāo)準(zhǔn)偏差為18.68%。2次重復(fù)的發(fā)病率結(jié)果相近。圖3

表3 兩次重復(fù)間發(fā)病率與相對病情指數(shù)相關(guān)性Table 3 Correlation between incidence and relative disease index between two repeats

圖3 發(fā)病率動(dòng)態(tài)分布

重復(fù)1、重復(fù)2及均值的分布情況均呈偏態(tài)分布,重復(fù)1相對病情指數(shù)的均值為17.43,標(biāo)準(zhǔn)偏差為11.32;重復(fù)2相對病情指數(shù)的均值為14.82,標(biāo)準(zhǔn)偏差為9.99;兩重復(fù)平均相對病情指數(shù)的均值為16.12,標(biāo)準(zhǔn)偏差為10.45。2次重復(fù)的相對病情指數(shù)結(jié)果相近,相對病情指數(shù)范圍在10.0～20.0,供試品種(系)的抗性類型整體表現(xiàn)為耐病。圖4

圖4 相對病情指數(shù)動(dòng)態(tài)分布

2.3 不同地域陸地棉材料的抗病性差異

研究表明,相對病情指數(shù)最大的是中國云南的材料,其相對病情指數(shù)均值為43.3,中國云南的供試材料對棉花枯萎病7號生理小種的抗性較弱;而相對病情指數(shù)最小的是哥倫比亞的材料,其相對病情指數(shù)為9.3,哥倫比亞的供試材料對棉花枯萎病7號生理小種的抗性較強(qiáng)。表4

2.4 不同來源陸地棉材料的抗病性差異

研究表明,來源為保加利亞、烏干達(dá)和中國云南的陸地棉整體抗性表現(xiàn)為感病,澳大利亞、巴基斯坦、中國北京、中國甘肅、中國廣西等20個(gè)來源的陸地棉整體抗性類型為耐病,中國云南的材料與其他22個(gè)不同來源的材料相比具有顯著性差異,平均相對病情指數(shù)達(dá)43.3,其中澳大利亞的平均相對病情指數(shù)最小,為11.2,來自澳大利亞的供試材料抗病性高于其他材料。表5

2.5 陸地棉供試材料對棉花枯萎病的抗性反應(yīng)

研究表明,供試材料對病害的抗性反應(yīng)主要為耐病和感病類型,無表現(xiàn)免疫(I)的材料。具有高抗(HR)枯萎病特性的材料5份、抗病(R)材料78份、耐病(T)材料材料130份、感病(S)材料52份,占百分比分別為總供試材料的1.9%、29.4%、49.1%和19.6%。圖5,表3

圖5 供試材料對枯萎病的抗性表現(xiàn)

表4 不同來源材料的抗性差異Table 4 Differences in resistance of materials from different sources

表5 枯萎病下不同來源材料發(fā)病變化Table 5 Differences in resistance of materials from different sources

3 討 論

在抗病品種改良的全過程中,育種親本的選配、后代群體與新品種(系)抗性表現(xiàn)的評判都依賴抗性鑒定[14,15]。苗期鑒定一直是抗枯萎病鑒定的一個(gè)重要組成部分[16]。研究采用強(qiáng)致病力的棉花枯萎病菌7號生理小種進(jìn)行人工接種,病情發(fā)展較高,鑒定效率高。生產(chǎn)上有多數(shù)品種(系)的抗病性受環(huán)境因素影響具有不穩(wěn)定性,可通過苗期篩選出來的抗性品種(系)可進(jìn)行多年、多點(diǎn)聯(lián)合鑒定,以確保其抗病性的穩(wěn)定。應(yīng)用苗期接種病原菌鑒定植株病害抗性,周期短,速度快,可節(jié)省人力物力,能快速獲得種質(zhì)的抗性信息[17]。目前,針對不同作物種質(zhì)資源枯萎病苗期抗性鑒定方面多有報(bào)道[18,19],作物苗期抗病性鑒定能短期內(nèi)反應(yīng)其抗性,且便于觀察和減小外界環(huán)境影響。陳振東等[20]用苗期接種法對143份苦瓜高代自交系材料進(jìn)行枯萎病抗性評價(jià),篩選到具有高抗枯萎病特性的材料1份、抗病材料2份、中抗材料5份。李曉慧等[16]對西瓜枯萎病苗期進(jìn)行抗性鑒定,通過傷根蘸孢法從40份種質(zhì)資源中篩選出2份耐病材料。田宇等[21]對50份生菜種質(zhì)資源進(jìn)行綜合抗病性評價(jià),結(jié)果篩選到了10份高抗品種。王祿星等[22]在室內(nèi)苗期對23份寧夏甜瓜白粉病進(jìn)行抗病性鑒定,篩選出2份免疫材料、5份高抗材料。

4 結(jié) 論

重復(fù)1相對病情指數(shù)與重復(fù)2相對病情指數(shù)的相關(guān)性最高,鑒定結(jié)果穩(wěn)定。發(fā)病率均值大于50%,相對病情指數(shù)總體分布大于10小于20,耐病材料最多,鑒定方法可取。中國云南的材料整體抗病性最弱,哥倫比亞的材料整體抗病性最強(qiáng),其中云南的材料區(qū)別于其他來源的材料顯著性差異;經(jīng)抗病性評價(jià),篩選得到了5份高抗品種(系),78份抗病品種(系),130份耐病品種(系)及52份感病品種(系),但無免疫品種(系)。供試品種(系)群體表現(xiàn)出多層次的抗性水平,篩選出具有抗病性的品種(系)攜帶大量與抗病相關(guān)的基因,可應(yīng)用于抗病基因的挖掘,亦可作為潛在的親本用于抗病品種改良。