缺氧誘導因子和促紅細胞生成素及其受體基因在綿羊各組織中表達量

雷 艷,蘭 斌,余萬里,戴小華,蔡 鵬,顧偉芳,阿迪萊·艾力,趙紅瓊

(新疆農業(yè)大學動物醫(yī)學學院,烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】缺氧(hypoxia)是指因組織的氧氣供應不足或用氧障礙而導致組織的代謝、功能和形態(tài)結構發(fā)生異常變化的病理過程。輕度的缺氧應激會降低動物的采食量和免疫力,影響動物的生產性能,而嚴重的缺氧應激可能會造成動物死亡[1]。諸多缺氧相關因子中缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor, HIF)是氧信號轉導系統的核心因子。HIF是由α亞基和β亞基組成的異源二聚體,β亞基是結構亞基,在細胞內穩(wěn)定表達;而α亞基是功能亞基,在不同的狀態(tài)下表達存在顯著差異,對低氧適應性起激活作用的HIF主要有HIF-1α、HIF-2α[2,3]。人體中HIF-1α和HIF-2α的氨基酸序列僅有48%的同源性[4]。促紅細胞生成素(erythropoietin, EPO)是一種活性糖蛋白,能促進骨髓中紅系造血祖細胞的增殖和分化,對機體供氧狀況發(fā)揮重要的調控作用[5]。EPO是HIF的下游靶基因之一,當機體受到缺氧應激時,HIF會激活EPO的轉錄活性,促進EPO的表達。EPO主要通過與靶細胞膜表面的促紅細胞生成素受體(erythropoietin receptor, EPOR)結合,發(fā)揮其生物學效應[6]?！厩叭搜芯窟M展】Befani等[7]使用化學物質氯化鈷模擬缺氧,蛋白表達量在48 h內隨著缺氧暴露時間遞增。米曉鈺等[8]對牦牛腦部HIF-1α的表達與定位進行研究,發(fā)現HIF-1α基因和蛋白在腦垂體表達量最高,垂體可能對缺氧具有較強的易感性。商鵬等[9]將飼養(yǎng)到平原地區(qū)的豬移居到高原,發(fā)現EPOR基因表達量增加,EPOR基因可能對高原適應性有重要作用?！颈狙芯壳腥朦c】檢測缺氧相關因子及其受體在動物各組織的基因表達情況有利于探究機體缺氧耐受或不耐受可能的靶組織或器官?！緮M解決的關鍵問題】研究用實時熒光定量PCR的方法探新疆地方品種綿羊新疆細毛羊缺氧相關因子HIF和EPO及其受體的表達,為該品種綿羊引入高原缺氧地區(qū)研究提供組織學依據,為靶向緩解或調控缺氧應激提供組織學參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗動物

4只健康新疆細毛羊,公羊,體重26.1 kg±0.2 kg,3～4月齡,來源于新疆畜牧科學院綿羊繁育試驗基地。采樣前1周,圈舍飼養(yǎng),一天飼喂兩次,飼喂量為600 g/只/d,精料,秸稈青貯和苜蓿干草的比例為1∶1∶2,飲水自由。

1.1.2 主要試劑

反轉錄試劑盒,HiFiScript cDNA Synthesis Kit(CW2569M,康為世紀生物科技有限公司);2 ×TaqMastreMix(CW0682M,康為世紀生物科技有限公司);50 × TAE(biosharp);核酸染料(博邁德生物);瓊脂糖(BIOWEST);熒光定量PCR試劑盒,PerfectStart Green qPCR SuperMix(AQ601,北京全式金生物技術有限公司)。

1.1.3 主要儀器

熒光定量PCR儀(7500 fast,Applied Biosystems);穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(DYY-6C,北京六一生物科技有限公司);微型電泳槽(DYCP-31DN,北京六一生物科技有限公司);單滴分光光度計(SMA400,Merinton)。

1.2 方 法

1.2.1 綿羊組織樣品的采集與處理

采樣前一晚綿羊禁食不禁水,次日早晨頸部放血處死,共采集4只綿羊的樣品,每只綿羊采14種組織。每種組織樣品采樣點保持一致。采集的組織用無菌生理鹽水沖洗干凈,濾紙蘸干后放入無菌無酶凍存管,立即置于液氮中速凍,之后保存于-80℃冰箱,用于RNA的提取。表1

1.2.2 引物設計

根據GenBank中已經發(fā)布的HIF-1a、HIF-2a、EPO和EPOR的全基因組序列(NCBI參考序列號分別為:XM_027971915.1、XM_015094403.2、NM_001024737.1和XM_027970663.1),以GAPDH為內參基因,按照實時熒光定量PCR的引物設計原則,用Primer Premier 5.0軟件設計引物序列,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。表2

1.2.3 總RNA的提取

使用Trizol法提取組織中總RNA,置-80℃保存?zhèn)溆?。用單滴分光光度計在波長為230 nm處檢測RNA的純度和濃度。通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像系統檢測RNA的完整性。

表1 采集的綿羊組織樣品及位點Table 1 The samping site of the tissues

表2 HIF-1α、HIF-2α、EPO和GAPDH 的PCR引物序列Table 2 PCR primer sequences of HIF-1α, HIF-2α, EPO and GAPDH

1.2.4 cDNA的合成

使用HiFiScript cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒將綿羊各組織提取的RNA反轉錄為cDNA,RNA總量為2 000 ng,反應總體系為20 μL。先加入4 μL的dNTP Mix (2.5 mmol/L),2 μL的Primer Mix,模板RNA 2 μg,用RNA無酶水補足到13 μL,70℃水浴10 min,迅速冰浴2 min。然后繼續(xù)加入4 μL 5×RT buffer,2 μL DTT(0.1 mol/L),1 μL HiFiScript反轉錄酶(200 U/μL),混合均勻,50℃水浴15 min。瞬時離心,置于冰上冷卻后,將反轉錄產物保存于-20℃,備用。

1.2.5 引物的特異性

以反轉錄產物cDNA為PCR模板,進行目的基因擴增和引物特異性驗證。PCR體系為2 ×TaqMastreMix 7.5 μL,模板0.5 μL,上下游引物各0.5 μL,ddH2O補足到12 .5 μL。PCR條件為:94℃ 10 min,94℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s,72℃ 10 min,35個循環(huán)。PCR反應結束后,進行2%的瓊脂糖凝膠電泳,1×TAE,電壓120 V,電流100 mA,電泳35 min后觀察引物特異性。

1.2.6 實時熒光定量PCR

將反轉錄的cDNA進行2倍稀釋,作為實時熒光定量PCR的模板。實時熒光定量PCR反應體系為:2 × PerfectStart Green qPCR SuperMix 7.5 μL,模板1.5 μL,上下游引物各0.3 μL,Passive Reference Dye 0.3 μL,ddH2O補足到12.5 μL。每個樣品進行3個重復。反應條件為:94℃ 30 s,94℃ 5 s,60℃ 34 s,72℃ 34 s,40個循環(huán)。

1.3 數據處理

使用2-△△Ct法比較各基因相對表達量,△Ct=(Ct(目的基因)-Ct(內參基因)),△△Ct=△Ct(一個組織目的基因)-△Ct(混樣RNA)。RNA混樣由同一只綿羊的各個組織RNA經稀釋到同一濃度后等量吸取混合而成。SPSS Statistics 21軟件進行2-△△Ct值統計分析,比較各組織之間目的基因相對表達量的差異,結果用均值±標準誤表示。P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 總RNA的提取結果

研究表明,RNA電泳條帶清晰,A260/A280比值大于1.9,無蛋白質和DNA等雜質污染,提取的總RNA可進行后續(xù)反轉錄和熒光定量PCR檢測。圖1

圖1 綿羊各組織提取的RNA完整性檢驗

2.2 目的基因的擴增

研究表明,HIF-1α、HIF-2α、EPO及EPOR基因均擴增出單一清晰條帶,且無其它非特異性條帶,片段大小與預期相符(HIF-1α為166 bp,HIF-2α為185 bp,EPO為73 bp,EPOR為139 bp)。圖2

圖2 綿羊組織中HIF-1α、HIF-2α、EPO和EPOR基因的擴增

2.3 實時熒光定量PCR產物的特異性

研究表明,從4種基因的熒光定量PCR熔解曲線均峰形單一,無引物二聚體等雜峰出現,4種基因的引物具有很強的擴增特異性。擴增曲線基線平整,擴增期和平臺期明顯,無特殊趨勢。圖3,圖4

圖3 實時熒光定量PCR熔解曲線

圖4 實時熒光定量PCR擴增曲線

2.4 HIF-1α基因在綿羊各組織中相對表達量

研究表明,HIF-1α基因在綿羊肺組織的相對表達量最高(4.2±1.2),且極顯著高于其它組織,差異具有統計學意義(P<0.01);脾(1.8±0.3)和睪丸(1.7±0.6)中該基因的相對表達量顯著高于肝和心臟組織(P<0.05);其它各組織之間差異無統計學意義(P>0.05),相對表達量均值為(0.8±0.1)。圖5

注:綿羊各組織之間相對表達量具有統計學意義用*表示P<0.05水平,用**表示P<0.01水平,下同

2.5 HIF-2α基因在綿羊各組織中相對表達量

研究表明,HIF-2α基因在綿羊各組織中相對表達量,肺組織中HIF-2α基因的相對表達量最高(21.9±4.7),其差異具有統計學意義(P<0.01);脾中HIF-2α基因的相對表達量(5.1±3.5)高于盲腸、結腸、空腸、下丘腦、腎臟、回腸、心臟、腎上腺以及睪丸,差異具有統計學意義(P<0.05);其它各組織之間差異不具有統計學意義(P>0.05),其均值為(0.7±0.1)。圖6

2.6 HIF-1α和HIF-2α兩種基因在表達量最高組織中的比較

研究表明,將HIF-1α和HIF-2α基因在表達量最高的肺組織中進行比較,HIF-2α基因的表達量顯著高于HIF-1α基因,差異具有統計學意義(P<0.05),且約為HIF-1α表達量的5.2倍。圖7

圖6 HIF-2α基因在綿羊各組織中的相對表達量

注:兩種基因相對表達量差異具有統計學意義用*表示P<0.05水平,用**表示P<0.01水平

2.7 EPO基因在羊各組織中的相對表達量

研究表明,該基因在腎臟中的相對表達量最高(3.8±3.6),且顯著高于垂體、結腸、脾臟、盲腸、肝臟、腎上腺、瘤胃、下丘腦以及心臟,差異具有統計學意義(P<0.05);其它各組織之間差異無統計學意義(P>0.05),其均值為(0.7±0.1)。圖8

圖8 EPO基因在綿羊各組織中的相對表達量

2.8 EPOR基因在綿羊各組織中的相對表達量

研究表明,該基因在肺(21.1±14.2)和睪丸(18.5±9.0)中相對表達量最高,且顯著高于其它組織,差異具有統計學意義(P<0.05);其它各組織之間差異不具有統計學意義(P>0.05),其均值為(0.6±0.2)。圖9

圖9 EPOR基因在綿羊各組織中的相對表達量

3 討 論

試驗采用實時熒光定量PCR方法檢測到HIF-1α和HIF-2α基因在綿羊的各組織中都有表達,并有明顯的組織差異性,且均在綿羊肺臟的相對表達量最高,其次是脾臟。生活在高海拔缺氧環(huán)境的藏羚羊,HIF-1α和HIF-2α基因在肺臟、心肌、肝臟、大腦、小腦、骨骼肌等組織中均有表達,其中肺臟的表達量最高[10,11]。Spencer等[12]提出,在常氧條件下,HIF-2α mRNA在血管豐富組織中表達量較高,與試驗中肺臟高表達的結果基本一致,但試驗在心臟中檢測到HIF-2α mRNA的表達量非常低,究其原因可能是兩個研究心臟取樣位點不同,研究主要采集的是右心室心肌部的樣品,因而有必要進一步研究心臟不同部位HIF表達是否有差異。常氧環(huán)境下的綿羊和處于高原缺氧氧地區(qū)的藏羚羊,HIF-1α和HIF-2α基因都在肺臟高表達,肺臟可能是HIF的主要來源器官。對于生活在高海拔缺氧地區(qū)的哺乳動物如藏羚羊或牦牛,可高表達HIF基因的肺臟具有更強大的功能,如肺部氣體擴散容量很高,擴散能力強,血液流速更快,以保證體內氧氣的供應[13]。高原哺乳動物為適應低氧環(huán)境,發(fā)生低氧適應性進化,肺泡發(fā)育時期更早,肺泡數目在單位面積內增多,肺泡面積也較小[14],而趙曉萌等[15]也發(fā)現HIF-1α在牦牛肺臟中的肺泡、終末細支氣管環(huán)形平滑肌以及肺泡隔間充質細胞中都有表達。肺臟是機體適應低氧環(huán)境,使HIF發(fā)揮缺氧調控作用的重要器官。

HIF-1α和HIF-2α基因均在綿羊肺部的相對表達量最高,而且HIF-2α的表達量約為HIF-1α的5.2倍。HIF-1α和HIF-2α基因雖然同屬一個家族,在基因表達和低氧調控中具有一定的相似性,但功能與作用有不同之處。Uchida等[16]在研究肺上皮細胞時發(fā)現,在低氧后6 ～ 12 h內HIF-1α的m RNA表達量快速下降,而在相同時間點HIF-2α的mRNA的表達量明顯增加,且在蛋白水平HIF-1α和HIF-2α的表達情況與mRNA表達一致,在缺氧應激過程中HIF-2α表達量的變化可能較HIF-1α更敏感,作用也更明顯。

EPO的表達會受到HIF基因的影響。Miao等[17]研究發(fā)現小鼠肝癌組織中EPO和EPOR的表達與HIF呈正相關,缺氧可使肝癌細胞中EPO和EPOR的表達量增加。試驗檢測綿羊各組織中EPO和EPOR基因的表達量結果顯示,EPO基因在綿羊腎臟的相對表達量最高,這表明腎臟是EPO基因的主要合成部位。Jacobson等[18]發(fā)現大鼠產生EPO的主要器官是腎臟,由腎小管周圍毛細血管內皮細胞或成纖維細胞合成,僅少部分由肝臟、巨噬細胞和有核紅細胞產生。EPO具有促進紅細胞的生成、抗炎癥反應、抗細胞凋亡、增強免疫功能等多種生物學功能。當機體缺氧時,腎臟中的EPO,會刺激幼稚紅細胞的增生,血紅蛋白化和紅細胞的成熟,通過增加紅細胞數量,從而增加組織的供氧量。

EPOR是EPO具有高特異性親和力的受體,EPO需與EPOR特異性結合而激活相關信號通路從而發(fā)揮促進紅細胞增殖等功能。試驗通過對綿羊各組織中EPOR基因相對表達量檢測發(fā)現,EPOR基因在不同組織中廣泛表達,但表達量有所不同,肺臟相對高于其它組織。管春燕[19]研究表明,EPOR基因在牦牛和西藏牛的肺臟、腎臟、臀肌等組織中均有表達,其中肺臟的表達量最高,與研究結果一致。EPO主要來源于腎臟,可能在機體具有廣泛的調節(jié)作用,但是主要作用部位在肺臟。

4 結 論

HIF-1α和HIF-2α基因均在綿羊肺組織的相對表達量最高;在肺臟HIF-2α基因的表達量約為HIF-1α表達量的5.2倍。EPO基因在綿羊腎臟的相對表達量最高且高于垂體、結腸、脾臟、盲腸、肝臟、腎上腺、瘤胃、下丘腦以及心臟。EPOR基因在肺臟的表達量最高,且肺臟和睪丸的相對表達量高于脾臟、下丘腦、腎臟、心臟等組織。肺臟和腎臟可能是綿羊缺氧應激感受和調控的重要器官。