外周血miR-92a和miR-342在急性肺損傷的診斷及預(yù)后中的臨床價(jià)值

畢婧 黃波

安康市中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科一病區(qū)（陜西安康725000）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是由直接或間接損傷因素引起，如敗血癥、肺炎、吸入胃內(nèi)容物、流行性病毒入侵、創(chuàng)傷、爆炸、煙霧吸入和窒息性吸入等，可能危及生命健康的疾?。?］。這些損傷因子誘導(dǎo)激活免疫細(xì)胞，隨后啟動(dòng)異常免疫反應(yīng)。由損傷因子激活的免疫細(xì)胞釋放過(guò)量促炎因子、趨化因子和蛋白酶，最終損傷肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞，如血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞［2］。當(dāng)肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞大量受損，導(dǎo)致通氣功能障礙，呼吸功能迅速減弱。ALI 的特征包括肺泡上皮細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加、彌散性肺間質(zhì)和肺泡水腫、氣體交換障礙和低氧血癥，最終導(dǎo)致呼吸衰竭［3］。目前，沒有有效的藥物治療可提高ALI 患者生存率。微小RNA（microRNA，miRNA）是一種高度保守的單鏈RNA，長(zhǎng)度約為22 個(gè)核苷酸，參與多種疾病的生理和病理功能，包括結(jié)核病［4］、ALI［5］、肺纖維化和腫瘤等［6］。miRNA 主要結(jié)合mRNA 的3′-非翻譯區(qū)（3′-UTR），以控制多種途徑和各種細(xì)胞過(guò)程，如炎癥免疫反應(yīng)等［7］。LIU 等［8］研究提出，miR-92a 在膿毒癥引起的ALI 中介導(dǎo)肺部炎癥，可能是ALI 的一種新的診斷生物標(biāo)志物。miR-342在脂多糖誘導(dǎo)的小鼠ALI 中表達(dá)顯著下調(diào)，而且發(fā)現(xiàn)miR-342 對(duì)A549 細(xì)胞炎癥損傷具有保護(hù)作用［9］。本研究旨在評(píng)價(jià)ALI 患者外周血miR-92a和miR-342 表達(dá)水平，確定miR-92a和miR-342 對(duì)ALI診斷臨床價(jià)值，并探討miR-92a和miR-342 與ALI風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料篩選2019年1月到2021年12月期間在我院就診的60 例ALI 患者，另選取同期在我院接受健康體檢的同齡者52 例作為對(duì)照組，其中男32 例，女20 例，年齡（58.22±9.28）歲。60 例ALI 患者進(jìn)行隨訪，并根據(jù)生存狀態(tài)分為ALI 死亡組和ALI存活組，其中ALI死亡組20例，男12例，女8 例，患者年齡（57.23 ± 8.92）歲，ALI 存活組患者40 例，其中男25 例，女15 例，年齡（55.82 ±10.19）歲。

ALI 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合ALI 診斷標(biāo)準(zhǔn)［10］；（2）臨床資料完整，且配合完成本研究所需所有檢測(cè)；（3）患者及其家屬了解研究?jī)?nèi)容并簽署家屬知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他惡性腫瘤者，包括肺癌、腎癌等；（2）合并免疫性疾病者，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等；（3）長(zhǎng)期服用藥物者；（4）與患者及其家屬溝通不暢者。本研究?jī)?nèi)容符合赫爾辛基宣言，并獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 臨床指標(biāo)觀察和外周血采集

1.2.1 臨床評(píng)分所有患者入院24 h 內(nèi)進(jìn)行急性生理和慢性健康評(píng)分（acute physiology and chronic health evaluation，APACHE Ⅱ）和肺損傷預(yù)測(cè)評(píng)分（lung injury prediction score，LIPS）。

1.2.2 外周血采集所有研究對(duì)象清晨空腹靜脈抽血5 mL，利用生化檢測(cè)儀分析超敏C反應(yīng)蛋白（high-sensitive C-reactive protein，hs-CRP）。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）分析外周血miR-92a和miR-342 表達(dá)水平Trizol 提取各受試者外周血總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（ThermoFisher，美國(guó)）將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，在PCR 儀（UNOII，德國(guó)）上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94 ℃，2 min，94 ℃持續(xù)30 s，循環(huán)35 次，退火溫度為72 ℃，30 s，最后72 ℃持續(xù)7 min，以U6為內(nèi)參，持續(xù)25 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳中分離，用溴化乙錠染色，并用GelDoc 系統(tǒng)（Bio-Rad，美國(guó)）進(jìn)行分析。引物信息為，miR-92a， 正 向 5′ - ACACTCCAGCTGGGAGGTTGGGATTTGTCGC 反向，5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAA-TTCAGTTGAGA-3′；miR-342，正向5′-TCCTCGCT-CTCACACAGAAATC-3′，反向5′-TATGGTTGTTCA-CGACTCCTTCAC-3′；U6，正向5′-AACGAGACGACGACAGAC - 3′ ，反 向 5′ -GCAAATTCGTGAAGCGTTCCATA-3′。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法利用SPSS 20.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用（）表示，三組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料采用百分比表示，組間采用χ2檢驗(yàn)；利用受試者工作曲線（receiver operating characteristic，ROC）評(píng)價(jià)外周血miR-92a和miR-342 表達(dá)水平對(duì)ALI 診斷臨床價(jià)值，單因素和多因素回Cox 歸分析影響ALI 危險(xiǎn)因素，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較本研究中對(duì)照組、ALI 存活組和ALI 死亡組患者年齡、性別、吸煙率以及原發(fā)疾病比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），三組比較APACHEⅡ評(píng)分、LIPS 評(píng)分、CRP 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與對(duì)照組相比，ALI 存活組和ALI 死亡組APACHEⅡ評(píng)分、LIPS 評(píng)分更高，外周血中hs-CRP 更高于對(duì)照組。見表1。

表1 一般臨床資料比較Tab.1 Comparison of general clinical data 例（%）

2.2 外周血miR-92a和miR-342 表達(dá)水平比較對(duì)照組外周血中miR-92a 相對(duì)表達(dá)水平為（1.07 ±0.05），miR-342 相對(duì)表達(dá)水平為（1.12 ± 0.11）；ALI存活組miR-92a 相對(duì)表達(dá)水平為（2.13 ± 0.12），miR-342 相對(duì)表達(dá)水平為（0.55 ± 0.04）；ALI 死亡組miR-92a 相對(duì)表達(dá)水平為（3.11 ± 0.11），miR-342 相對(duì)表達(dá)水平為（0.31 ± 0.02）。ALI 存活組miR-92a相對(duì)表達(dá)水平高于對(duì)照組（P＜0.05），ALI 死亡組miR-92a 相對(duì)表達(dá)水平高于ALI 存活組（P＜0.05）；ALI 存活組miR-342 相對(duì)表達(dá)水平低于對(duì)照組（P＜0.05），ALI 死亡組miR-342 相對(duì)表達(dá)水平低于ALI 存活組（P＜0.05）。

2.3 Cox 回歸單因素分析ALI 患者外周血miR-92a、miR-342 相對(duì)表達(dá)水平、APACHEⅡ評(píng)分、LIPS評(píng)分、CRP 等因素納入ALI 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行分析，單因素分析結(jié)果顯示APACHE Ⅱ評(píng)分、LIPS 評(píng)分、外周血中CRP 濃度、miR-92a 相對(duì)表達(dá)水平過(guò)高，miR-342 相對(duì)表達(dá)水平過(guò)低是ALI 患者發(fā)生死亡風(fēng)險(xiǎn)的危險(xiǎn)因素（P＜0.05），見表2。

表2 Cox 回歸單因素分析Tab.2 Cox regression univariate analysis

2.4 Cox 回歸多因素分析Cox 回歸多因素分析結(jié)果表明，外周血CRP、miR-92a和miR-342 水平是影響ALI發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），見表3。

表3 Cox 回歸多因素分析Tab.3 Cox regression multivariate analysis

2.5 外周血miR-92a和miR-342 水平診斷ALI 的ROC 分析根據(jù)ALI 診斷標(biāo)準(zhǔn)［11］，評(píng)價(jià)外周血中miR-92a和miR-342 相對(duì)表達(dá)水平對(duì)ALI 患者診斷臨床價(jià)值，結(jié)果顯示，miR-92a 曲線下面積為0.865（95%CI：0.722～0.902），靈敏度為84.39%，特異度為73.29%，截?cái)嘀禐?.16；miR-342 曲線下面積為0.839（95%CI：0.728～0.950），靈敏度為82.19%，特異度為71.77%，截?cái)嘀禐?.56。miR-92a和miR-342 聯(lián)合診斷曲線下面積為0.895（95%CI：0.855～0.963），靈敏度為86.87%，特異度為76.57%。見圖1。

圖1 miR-92a和miR-342 診斷ALI 的ROC 曲線Fig.1 ROC curve of miR-92a and miR-342 in the diagnosis of acute lung injury

3 討論

本研究中發(fā)現(xiàn)miR-92a 在ALI 外周血中表達(dá)上調(diào)，miR-342 外周血中表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步Cox 回歸分析表明外周血CRP、miR-92a和miR-342 水平是影響ALI 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），ROC 曲線分析結(jié)果表明，外周血miR-92a和miR-342 相對(duì)表達(dá)水平對(duì)ALI 診斷有臨床價(jià)值。

ALI 是較為嚴(yán)重的健康問(wèn)題，占肺損傷死亡例數(shù)的30%。從機(jī)制上講，ALI 是一種臨床呼吸系統(tǒng)疾病，可能發(fā)展為更為復(fù)雜的綜合征，即急性呼吸窘迫綜合征［12］。炎癥反應(yīng)在ALI 的發(fā)生和維持中起著重要作用，促炎細(xì)胞因子TNF-α 和IL-1β，增加肺上皮通透性，進(jìn)而誘導(dǎo)肺組織損傷和中性粒細(xì)胞聚集導(dǎo)致肺水腫［13］。最近研究表明，miRNA 在ALI 進(jìn)展過(guò)程中起著關(guān)鍵調(diào)控作用。一些研究報(bào)道了miRNA 作為ALI 生物標(biāo)志的作用以及它們作為該疾病治療靶點(diǎn)的潛在用途［14］。微陣列數(shù)據(jù)表明，ALI 誘導(dǎo)miRNA 異常表達(dá)，這些miRNA 的潛在靶點(diǎn)與許多生理病理過(guò)程相關(guān)，如炎癥和凋亡［15］。CHEN 等［16］研究提出，MiR-92a 在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，miR-92a 過(guò)度表達(dá)促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌增殖、侵襲和遷移，并抑制細(xì)胞凋亡。LIU 等［17］研究發(fā)現(xiàn)miR-92a 可激活肺泡巨噬細(xì)胞和肺部炎癥，肺泡上皮細(xì)胞外泌體中的miR-92a 可能代表了ALI 的一種新的診斷生物標(biāo)志物［8］。ALI中miR-92a 在ALI 中高表達(dá)，抑制miR-92a 可改善肺泡上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，減少凋亡。本研究與上述報(bào)道一致，miR-92a 在ALI 進(jìn)展中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用，這種調(diào)控作用可能與ALI炎癥反應(yīng)有關(guān)。

除此之外，研究表明miR-342 也是ALI 炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，ZHU 等［9］提出miR-342 在LPS誘導(dǎo)的A549 細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào)，且伴有炎性因子升高和細(xì)胞凋亡，而過(guò)表達(dá)miR-342 可降低LPS誘導(dǎo)的炎癥水平。WEN 等［18］報(bào)道m(xù)iR-342 與Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞增殖和凋亡有關(guān)，在支氣管肺發(fā)育不良疾病治療中有一定前景。MiR-342 過(guò)度表達(dá)抑制NF-κB/p65 信號(hào)通路，促進(jìn)百草枯誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，并加重百草枯誘導(dǎo)的肺損傷［19］。本研究結(jié)果與上述報(bào)道一致，miR-342 在ALI 患者外周血中表達(dá)下調(diào)，而且在ALI 死亡組患者表達(dá)低于ALI 存活組。上述研究說(shuō)明miR-342在ALI 進(jìn)展中可能發(fā)揮炎癥有關(guān)的調(diào)控作用。

本研究尚存在不足之處，ALI 臨床樣本收集存在一定難度，后期研究過(guò)程中繼續(xù)增加樣本量，提高嚴(yán)謹(jǐn)性。另外，對(duì)于miR-92a和miR-342 在ALI中的具體分子機(jī)制仍需深入探究，進(jìn)一步充實(shí)研究?jī)?nèi)容。綜上所述，外周血miR-92a和miR-342 水平與ALI 有關(guān)，二者聯(lián)合檢測(cè)可為ALI 早期預(yù)測(cè)提供臨床依據(jù)。

【Author contributions】BI Jing performed the experiments，designed the study and wrote the article.HUANG Bo revised and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as sub-mitted.