基于Yes相關(guān)蛋白/同源異型盒轉(zhuǎn)錄因子通路探討淋巴管新生在高血壓心肌重構(gòu)中的作用

劉晶晶 陳昌貴 孫茹雪 李立為

湖北省武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院（武漢市第一醫(yī)院）心血管內(nèi)科重癥監(jiān)護室（武漢430022）

心臟肥大的發(fā)展最初被認(rèn)為是應(yīng)對容量或壓力過載的一種適應(yīng)性反應(yīng)，但最終可能導(dǎo)致心力衰竭（heart failure，HF）［1］。盡管存在可以改善HF患者心臟功能障礙的治療方法，但病死率仍然很高，迫切需要發(fā)現(xiàn)預(yù)防HF 的新目標(biāo)或替代治療策略。心臟有一個復(fù)雜的淋巴管網(wǎng)絡(luò)，對維持組織液平衡、免疫細(xì)胞販運和心臟功能至關(guān)重要。近年來，有研究注意到淋巴管功能損害參與壓力過載引起的心臟功能障礙，而刺激心臟淋巴管生成可改善心臟淋巴運輸和水腫，減少心臟炎癥和纖維化，并改善左心室功能，但其中機制仍有待進一步研究［2-3］。哺乳動物Hippo 信號通路是心血管系統(tǒng)中細(xì)胞命運、細(xì)胞分化、增殖、遷移和器官形態(tài)發(fā)生的重要調(diào)節(jié)者［4］。Hippo 通路的核心涉及大腫瘤抑制激酶1 和2、Yes相關(guān)蛋白（Yes-associated protein，YAP）及其旁系同源物TAZ。最近發(fā)現(xiàn)，YAP 在血管生長和淋巴管生長的內(nèi)皮細(xì)胞中高度富集，并在萌芽血管生成和血腦屏障成熟中發(fā)揮促進作用［5］。重要的是，研究發(fā)現(xiàn)YAP 通過調(diào)節(jié)同源異型盒轉(zhuǎn)錄因子（prospero-related homeobox domain 1，PROX1）表達(dá)參與淋巴內(nèi)皮細(xì)胞可塑性［6］。然而，YAP/PROX1 通路是否調(diào)節(jié)壓力過載引起的心臟淋巴管功能損害修復(fù)仍不清楚。因此，本研究利用YAP 基因敲除小鼠檢查了YAP/PROX1 通路在橫主動脈收縮（transverse aortic constriction，TAC）誘發(fā)的心臟肥大和功能障礙中的潛在作用。同時，檢查了AngⅡ刺激的原發(fā)性小鼠淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞（lymphatic endothelial cells，LECs）的內(nèi)皮細(xì)胞功能和淋巴管生成能力。

1 材料與方法

1.1 動物和分組處理20 只野生型（WT）小鼠和20 只YAP 基因敲除（YAP-KO）小鼠（8 周齡、雄性）均購自均購自杰克森艾特生物科技（北京）有限公司。實驗動物許可證號：SCXK（京）2019-0004。將YAP-KO 小鼠隨機分為兩組：假手術(shù)（Sham）+YAPKO 組（n= 10）和TAC+YAP-KO 組（n= 10），和將WT 小鼠隨機分為兩組：Sham+WT 組（n= 10）和TAC+WT 組（n= 10）。除Sham+YAP-KO 組和Sham+WT 組外，其他組建立6 周TAC 模型。

參照文獻(xiàn)方法，通過TAC 手術(shù)誘導(dǎo)小鼠心臟肥大和HF 模型的持續(xù)壓力過載［7］。小鼠用氯胺酮（0.2 g/kg）和賽拉嗪（0.01 g/kg）進行腹腔注射麻醉。在充分暴露橫主動脈后，將6-0 尼龍縫合線置于鎖骨和左頸動脈之間，將27 號鈍針置于橫主動脈處，并在及時拔出針頭后迅速打兩個結(jié)以產(chǎn)生65%～70%的收縮力。最后，用4-0 PROLENE 縫線縫合皮膚。對于Sham 小鼠，除結(jié)扎外，所有操作都以相同的程序進行。

1.2 超聲心動圖和血壓測量在TAC手術(shù)后的6周，使用30 MHz 探頭進行超聲心動圖檢查。測量左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、分?jǐn)?shù)縮短（FS）、舒張末期左心室前壁尺寸［LVAW（d）］、舒張末期左心室后壁尺寸［LVPW（d）］、舒張末期的左心室內(nèi)部尺寸［LVID（d）］、收縮末期的左心室前壁尺寸［LVAW（s）］、收縮末期的左心室后壁尺寸［LVPW（s）］、收縮末期的左心室內(nèi)部尺寸［LVID（s）］。通過創(chuàng)尾套系統(tǒng)（美國Softron 公司）測量小鼠的收縮壓（SBP）、平均血壓（MBP）、舒張壓（DBP）和心率（HR）。

1.3 心臟水含量測量取出小鼠心臟的心房和大血管以評估心室的濕重。心室在65 ℃下干燥5 d后，獲得心臟干重。心肌含水量按以下公式計算：心臟含水量=（心臟濕重-心臟干重）/心臟濕重×100%。

1.4 組織病理學(xué)和免疫染色心臟組織在室溫下用4%多聚甲醛在磷酸鹽緩沖鹽水中固定48 h并嵌入石蠟中。將心臟組織切成5 μm 的切片用于以下分析。切片用小麥胚芽凝集素（WGA）染色以測量心肌細(xì)胞的大小。用Image J 對心肌細(xì)胞面積進行了量化。將載玻片與特異性淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞透明質(zhì)酸受體1（lymphatic vessel endothelial receptor-1，LYVE1）（稀釋度，1∶200）的一級抗體在4 ℃下孵育過夜，進行免疫組織化學(xué)。次日，與二抗在37 ℃下孵育30 min，檢測LYVE1 的表達(dá)。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)小鼠LECs 購自美國Procell 公司，在含有5% 胎牛血清和1% 青霉素-鏈霉素的DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長，溫度為37 ℃。在培養(yǎng)基中使用適當(dāng)劑量的AngⅡ（10-6mol/L）處理48 h，對LECs 的功能和基因表達(dá)情況進行檢測。為了抑制YAP 在體外的表達(dá)，用50 nmol/L 的YAP小干擾RNA（si-YAP）轉(zhuǎn)染LECs 48 h。si-YAP 的序列是5′-GGAUGUAGCUGAGCUGCUUTTAAGCAGCUCA-GCUACAUCCTT-3′。為了在體外過量表達(dá)YAP、PROX1，使用YAP、PROX1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染48 h 后收獲轉(zhuǎn)染了質(zhì)?；騭iRNA 的細(xì)胞并進行功能分析。LECs 分為以下6 組進行：對照（Control）組、AngⅡ+NC 組、AngⅡ+si-YAP 組、AngⅡ+YAP 組、AngⅡ+si-YAP+Vector 組和AngⅡ+si-YAP+PROX1 組。其中，Control 組細(xì)胞加入空白溶劑進行處理，AngⅡ+NC 組細(xì)胞加入si-NC、Vector轉(zhuǎn)染，其他組加入對應(yīng)的小干擾RNA 或質(zhì)粒進行處理。si-NC、si-YAP，YAP、PROX1 質(zhì)粒和相應(yīng)載體（Vector）均購自美國Ambion 公司。

1.6 傷口愈合試驗將處理后的LECs 培養(yǎng)在6 孔板中并形成單層。用黃色吸頭在單層LECs 表面進行1 mm 寬的線性劃痕，然后用含或不含AngⅡ的無血清培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基，持續(xù)24 h。在隨機選擇的5 個區(qū)域測量相對愈合距離，并使用Image J 進行分析。

1.7 EDU 染色LECs 以每孔103～104個細(xì)胞的密度被接種到96 孔板中。將細(xì)胞在含有EDU 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，并用4%的聚甲醛固定。用Apollo 標(biāo)記EDU 陽性細(xì)胞，用Hoechst33342 標(biāo)記細(xì)胞核。在熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）下觀察EDU 陽性細(xì)胞。

1.8 Proteome ProfilerTM 陣列應(yīng)用小鼠血管生成陣列試劑盒（美國R&D Systems 公司）進行因子篩選。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。將阻斷緩沖液加入到膜上，在搖板上搖晃1 h。將樣品與15 μL 重組的檢測抗體雞尾酒混合，然后在室溫下孵育1 h，將混合物轉(zhuǎn)移到膜上孵育過夜。用鏈霉蛋白-HRP緩沖液孵育細(xì)胞30 min。通過加入Chemi Reagent混合液進行最終檢測，然后進行掃描。

1.9 PCR 分析用RNAeasy Plus 微型試劑盒（美國QIAGEN 公司）分離細(xì)胞的總RNA。使用RNA轉(zhuǎn)cDNA 預(yù)混合液（Clontech Laboratories）將分離的RNA 轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR Green 試劑（瑞士Roche Diagnostics 公司）在StepOnePlus 系統(tǒng)（美國Life Technologies 公司）上進行實時PCR 反應(yīng)。在所有實驗中，GAPDH 被用作參考基因，以使基因表達(dá)正?；Ｒ镄蛄腥缦拢篈NG，正向5′-TGCCACAACTCATCCGACA-3′，反向5′-TCTGTTGCGGGTTTGAGT-3′；VEGF，正向5′-CCTGCCATACGCCACATCAT-3′，反向5′-TGCATGAAGCCATCCTTC-3′；MMP-9，正向5′-ATGGTTCTGCTCCTGGTAA-3′，反向5′-AGGTCTGCCTGCATTTCT-3′；IGFBP-3，正向5′-GAATGGCAGTGTGGACCTCT-3′和反向5′-CAGCCTCAAACTCCACCATT-3′；PROX1，正向5′-AAAGCAAAGCTCATGTTTTTATACC-3′和反向5′-GTAAAACTCACGGAAATTGCTAAACC-3′；GAPDH，正向5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，反向5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′。

1.10 蛋白質(zhì)印跡分析使用含有蛋白酶混合抑制劑和磷酸酶混合抑制劑的放射免疫沉淀試驗緩沖液（瑞士Roche Diagnostics公司）制備細(xì)胞裂解液。取20 μg 的總蛋白通過4%～12% Bis-Tris 凝膠（美國Life Technologies 公司）解析，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。在4 ℃下將膜與以下針對指定靶蛋白的一抗進行探測：抗VEGFR3 抗體（1∶1 000）、抗LYVE1 抗體（1∶1 000）和抗GAPDH 抗體（1∶5 000）。隨后，將膜與過氧化物酶偶聯(lián)的抗小鼠或抗兔IgG 抗體一起孵育90 min。使用Western ECL 底物（美國Bio-Rad Laboratories）進行免疫印跡，并通過Image J 測量條帶的強度。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法所有結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 22.0 進行統(tǒng)計分析。所有實驗數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布，并使用單向方差分析多組間的差異，然后用Fisher 最小顯著性差異檢驗進行事后配對比較。P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 YAP 缺失加重了TAC 誘導(dǎo)的高血壓心臟功能障礙與Sham+WT 組相比，TAC+WT 組小鼠EF%、FS%、LVAW 厚度和LVPW 厚度顯著下降（P＜0.05），和SBP、DBP、MBP、LVID 厚度顯著增加（P＜0.05）。TAC+YAP-KO 組小鼠EF%、FS%、LVAW 厚度和LVPW 厚度顯著低于TAC+WT 組（P＜0.05），并且LVID 厚度顯著增加（P＜0.05，圖1、表1）。

表1 WT 和YAP-KO 小鼠在TAC 手術(shù)6 周后或假性對照后的血壓和超聲心動圖參數(shù)Tab.1 Blood pressure and echocardiographic parameters of wild-type WT and YAP-KO mice after TAC operation for 6 weeks or sham control ±s

表1 WT 和YAP-KO 小鼠在TAC 手術(shù)6 周后或假性對照后的血壓和超聲心動圖參數(shù)Tab.1 Blood pressure and echocardiographic parameters of wild-type WT and YAP-KO mice after TAC operation for 6 weeks or sham control ±s

注：與Sham+WT 組比較，***P ＜0.001；與TAC+WT 組比較，###P ＜0.001

參數(shù)HR（bpm）SBP（mmHg）DBP（mmHg）MBP（mmHg）EF（%）FS（%）LVAW（d）（mm）LVPW（d）（mm）LVID（d）（mm）LVAW（s）（mm）LVPW（s）（mm）LVID（s）（mm）Sham+WT 組535 ± 12.96 116.02 ± 4.82 76.02 ± 3.74 88.51 ± 3.05 66.99 ± 2.99 37.38 ± 1.67 0.87 ± 0.04 0.71 ± 0.03 3.58 ± 0.03 1.36 ± 0.02 1.04 ± 0.02 2.23 ± 0.10 Sham+YAP-KO 組528 ± 11.32 115.72 ± 4.77 76.53 ± 3.62 88.93 ± 2.90 66.77 ± 1.92 36.29 ± 1.42 0.87 ± 0.03 0.71 ± 0.02 3.54 ± 0.18 1.38 ± 0.03 1.06 ± 0.03 2.22 ± 0.19 TAC+WT 組536 ± 18.83 159.84 ± 5.23***118.42 ± 3.23***118.85 ± 1.94***31.42 ± 6.15***20.72 ± 2.61***0.75 ± 0.03***0.64 ± 0.03***4.08 ± 0.14***1.05 ± 0.03***0.74 ± 0.04***3.08 ± 0.06***TAC+YAP-KO 組524 ± 7.45 162.41 ± 5.30 125.47 ± 2.84 124.31 ± 3.16 24.44 ± 3.64###13.18 ± 2.05###0.66 ± 0.02###0.58 ± 0.02###4.71 ± 0.15###0.90 ± 0.05###0.63 ± 0.03###3.93 ± 0.14###

圖1 各組代表性的M 型組織多普勒超聲心動圖Fig.1 Representative M-mode tissue Doppler echocardiography of each group

2.2 YAP 缺失加重TAC 誘導(dǎo)的心臟肥大和纖維化與Sham+WT 組相比，TAC+WT 組小鼠心臟質(zhì)量比、心肌細(xì)胞大小和間質(zhì)纖維化面積均顯著增加（P＜0.05）。與TAC+WT 組相比，TAC+YAP-KO組小鼠心臟質(zhì)量比、心肌細(xì)胞大小和間質(zhì)纖維化面積均顯著增加（P＜0.05）。

圖2 YAP 缺失加重TAC 誘導(dǎo)的心臟肥大和纖維化Fig.2 YAP deletion aggravates cardiac hypertrophy and fibrosis induced by TAC

2.3 YAP 是維持心臟淋巴管生成的必要條件與Sham+WT 組相比，TAC+WT 組小鼠淋巴微血管密度顯著降低（P＜0.05），并且TAC+YAP-KO 組小鼠淋巴微血管密度較TAC+WT 組進一步降低（P＜0.05）（圖3A）。此外，與Sham+WT 組相比，TAC+WT 組小鼠心臟水腫及心臟組織中YAP 蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.05），和血清VEGFC 水平以及心臟組織中VEGFR3、LYVE1 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），并且TAC+YAP-KO 組小鼠上述指標(biāo)的變化程度較TAC+WT 組更大（P＜0.05）（圖3B-F）。

圖3 YAP 的缺乏降低了TAC 誘導(dǎo)后的心臟淋巴管生成Fig.3 Lack of YAP reduces cardiac lymphangiogenesis induced by TAC

2.4 YAP 調(diào)節(jié)LECs 的功能如圖4A 所示，與對照組相比，AngⅡ+NC 組愈合面積顯著下降（P＜0.05），并且AngⅡ+si-YAP 組下降程度較AngⅡ+NC 組更大（P＜0.05），而AngⅡ+YAP 組的愈合面積較AngⅡ+NC 組顯著增加（P＜0.05）（圖4A-B）。進行EDU 染色試驗來檢查增殖。如圖4C、D 所示，與對照組相比，AngⅡ+NC 組LECs 的增殖顯著下降（P＜0.05），并且AngⅡ+si-YAP 組下降程度較AngⅡ+NC組更大（P＜0.05），而AngⅡ+YAP組LECs的增殖較AngⅡ+NC 組顯著增加（P＜0.05）。LECs的管形成檢查顯示，與對照組相比，AngⅡ+NC 組LECs 的管形成數(shù)量顯著下降（P＜0.05），并且AngⅡ+si-YAP 組下降程度較AngⅡ+NC 組更大（P＜0.05），而AngⅡ+YAP 組LECs 的管形成數(shù)量較AngⅡ+NC 組顯著增加（P＜0.05，圖4E-F）。

圖4 YAP 調(diào)節(jié)LECs 的遷移、增殖和管形成Fig.4 YAP regulates the migration，proliferation and tube formation of LECs

2.5 YAP 上調(diào)LECs 中PROX1 表達(dá)以加速淋巴管生成為了證實YAP 對LECs 影響的分子機制，研究應(yīng)用小鼠血管生成陣列試劑盒對潛在的生長因子進行了篩選。發(fā)現(xiàn)了5 個頂級的分化因子：ANG、VEGF、MMP-9、PROX1 和IGFBP-3（圖5A）。然后利用PCR 進行驗證，結(jié)果顯示只有PROX1 水平在YAP 敲低后顯著下調(diào)（圖5B）。此外，與AngⅡ+si-YAP+Vector 組相比，AngⅡ+si-YAP+PROX1組LECs 的愈合面積、增殖細(xì)胞和管形成數(shù)量顯著增加（P＜0.05，圖5C-H）。

圖5 YAP 上調(diào)LECs 中PROX1 表達(dá)以加速淋巴管生成Fig.5 YAP upregulates PROX1 expression in LECs to accelerate lymphangiogenesis

3 討論

慢性壓力過載引起了與心臟纖維化和功能障礙有關(guān)的病理性肥大［8］。已發(fā)現(xiàn)多種分子事件和信號通路參與了這一過程，但確切的機制還需要探索。微循環(huán)，尤其是淋巴微血管循環(huán)，在保護心臟不受傷害方面起著重要作用［8］。心臟淋巴功能障礙發(fā)生在各種心血管疾病中，影響心肌液體平衡和炎癥，可能誘發(fā)血管功能障礙、心臟重塑和缺血應(yīng)激后心臟功能障礙［9］。這項研究證明了YAP/PROX1 信號通路在心肌淋巴管生成中的重要性，這是從壓力過載誘導(dǎo)的肥厚過渡到HF 的一個新的調(diào)節(jié)途徑。YAP 敲除加重了壓力過載誘導(dǎo)的心臟淋巴管生成的減少，導(dǎo)致心臟水腫、肥大重塑和功能障礙。因此，本研究數(shù)據(jù)支持YAP 在持續(xù)壓力過載后心臟重塑和功能障礙的發(fā)病機制中發(fā)揮作用。

YAP 是Hippo 信號傳導(dǎo)途徑的主要下游效應(yīng)器［10-11］。研究報道，YAP 信號通路參與了胚胎發(fā)育、組織再生和體細(xì)胞干細(xì)胞的平衡［12］。最近，YAP 因其在病理性淋巴管發(fā)展中的作用而引起越來越多的關(guān)注。在各種癌癥中，包括胃癌和非小細(xì)胞肺癌，YAP 異常激活與TNM 分期和淋巴轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)［13］。關(guān)于淋巴管生成，YAP 通過調(diào)控PROX1 的表達(dá)，在重塑淋巴叢模式和產(chǎn)后淋巴瓣的維持中發(fā)揮促進作用［14］。此外，YAP 抑制劑verteporfin 不僅能減少淋巴管介導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移，還通過促進淋巴消退應(yīng)用于角膜移植后的免疫排斥［15-16］。本研究中，TAC 應(yīng)激后YAP-KO 小鼠比WT 小鼠表現(xiàn)出更顯著的HF 特征。此外，使用LYVE1 作為LECs 的標(biāo)記，本研究數(shù)據(jù)進一步表明，YAP-KO 引起的異?？赡苁怯捎诹馨臀⒀艿拿芏认陆翟斐?。YAP 通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和代謝重編程保護心臟免受內(nèi)皮功能障礙的影響［17-18］。在本研究中，AngⅡ降低了LECs 的遷移、增殖和管形成，抑制YAP 可加劇降低程度，但YAP 過表達(dá)后則逆轉(zhuǎn)這些變化。本研究結(jié)果與ZHONG 等［19］報道的結(jié)果一致，在他們的研究中YAP 的激活促進了LECs 在感染后的增殖、侵襲和管形成。這些結(jié)果表明YAP 通過介導(dǎo)淋巴管的生成參與了TAC 誘導(dǎo)的心臟損傷的發(fā)展。

淋巴轉(zhuǎn)移的一個重要過程是局部淋巴管生成。研究人員發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞和淋巴內(nèi)皮細(xì)胞之間的串聯(lián)是淋巴管生成的一個重要部分，生長因子可能是它們之間的信使［9，20］。本研究應(yīng)用小鼠血管生成陣列試劑盒對潛在的生長因子進行了篩選。我們選擇血管生成陣列試劑盒出于以下原因：（1）一些細(xì)胞表面受體家族，如整合素α4β1 和α2β1［21-22］，已被報道為血管生成和淋巴管生成的調(diào)節(jié)因子，表明血管生成相關(guān)蛋白也可能對淋巴管生成有類似的影響。（2）本陣列試劑盒中包括的一些血管生成相關(guān)的生長因子，如ANG1、ANG2、PROX1、VEGF-C 和VEGF-A，被證明在淋巴管生成中起作用［23-24］。根據(jù)血管生成相關(guān)因子的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)PROX1 與YAP 調(diào)節(jié)的淋巴管生成有關(guān)。PROX1 是主轉(zhuǎn)錄因子，控制著LECs 的分化和維持淋巴的完整性。與先前研究一致［6，25］，本研究證實了YAP/PROX1 信號通路在淋巴管生成中的調(diào)節(jié)作用，并且PROX1 上調(diào)有效逆轉(zhuǎn)了YAP 敲低對LECs 愈合、增殖和管形成的負(fù)面影響。因此，YAP/PROX1 信號通路可能是治療壓力過載引起的心臟功能障礙的潛在靶點。

總之，本研究確定了YAP/PROX1 信號通路是壓力過載誘導(dǎo)的心臟淋巴管生成、適應(yīng)性肥大和HF 的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素。需要進一步的調(diào)查來闡明YAP 參與調(diào)節(jié)LECs 中PROX1 表達(dá)的分子機制，并測試YAP/PROX1 信號傳導(dǎo)在其他動物模型中預(yù)防心臟肥大和HF 的效果。

【Author contributions】Liu Jingjing performed the experiments and wrote the article.Chen Changgui and Sun Ruxue performed the experiments.Li Liwei designed the study and reviewed the article.All authors read and aplproved the final manuscript as submitted.