自噬對(duì)激素性股骨頭壞死大鼠的作用效果分析

屈肖肖 喬慶陽(yáng) 陳寧 宋同陽(yáng) 李瑜 劉樹(shù)義

1西安醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院（西安710021）；2西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科（西安710038）

激素性股骨頭壞死（steroid-induced avascular necrosis of the femoral head，SANFH）是由于激素長(zhǎng)期或過(guò)量使用導(dǎo)致股骨頭出現(xiàn)骨小梁減少、股骨頭塌陷的一種疾病?；颊咄ǔＲ泽y部疼痛、髖關(guān)節(jié)活動(dòng)障礙為主要臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重者出現(xiàn)癱瘓［1］。SANFH 多累及雙側(cè)股骨頭，目前除全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)外，尚無(wú)有效的治療方法。行手術(shù)治療后可能面假體松動(dòng)、使用壽命、假體周?chē)钦?、感染等并發(fā)癥［2］。因此，探索SANFH 的防治策略是臨床亟待解決的難題。目前對(duì)SANFH 的研究較為廣泛，其中脂質(zhì)代謝紊亂學(xué)說(shuō)的關(guān)注度較高。研究表明，激素可使機(jī)體內(nèi)血脂升高，股骨頭內(nèi)出現(xiàn)脂滴堆積現(xiàn)象，進(jìn)而出現(xiàn)股骨頭壞死［3］，而應(yīng)用他汀類(lèi)藥物可改善高血脂和股骨頭壞死發(fā)生率［4-5］。但這仍無(wú)法滿(mǎn)足臨床治療需求，其預(yù)防機(jī)制和方法仍需進(jìn)一步探究。本研究通過(guò)構(gòu)建SANFH 大鼠模型，給予自噬干預(yù)后觀察股骨頭壞死、血脂及血管內(nèi)皮改善情況，為臨床尋找防治SANFH 的新方法。

1 材料與方法

1.1 研究材料本研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD 大鼠18 只（SPF 級(jí)）購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雌、雄各9 只，平均體質(zhì)量為（241.37 ± 10.45）g。脂多糖（LPS，貨號(hào)：L8880）、3-甲基腺嘌呤（3-MA，貨號(hào)：IM0190）、雷帕霉素（Rapamycin，貨號(hào)：R8140）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉（40 mg/瓶）購(gòu)自輝瑞制藥有限公司。LC3Ⅱ/Ⅰ（貨號(hào)：14600-1-AP）、p62（貨號(hào)：18420-1-AP）抗體購(gòu)自Proteintech 公司。內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）、一氧化氮（NO）等ELISA 試劑盒均購(gòu)自美國(guó)R＆D 公司。本研究經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)科學(xué)研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：XYLS2022110）。

1.2 研究方法

1.2.1 分組及動(dòng)物模型制備大鼠進(jìn)入動(dòng)物中心后，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3 組：模型組（M 組）、自噬阻斷組（M-3-MA 組）及自噬激動(dòng)組（M-Rap 組），每組6只，雌、雄各半。3組大鼠經(jīng)腹腔注射LSP（20 μg/kg）2 次，每次間隔24 h，然后兩側(cè)臀肌交替注射甲潑尼龍（40 mg/kg），每周3 次，每次間隔24 h，持續(xù)4 周。M-3-MA 組與M-Rap 組每次肌肉注射甲潑尼龍前30 min，經(jīng)腹腔分別注射3-MA（2.5 mg/kg）、雷帕霉素（1 mg/kg）。停止給予甲潑尼龍后繼續(xù)飼養(yǎng)4 周，腹主動(dòng)脈采血、收集雙側(cè)股骨頭標(biāo)本。

1.2.2 股骨頭壞死表面積測(cè)量股骨頭壞死表面積測(cè)量方法參考趙鳳朝等［6］使用的“坐標(biāo)紙粘貼法”。具體為：將壞死股骨頭切成層厚為5 mm 薄片，粘帖于坐標(biāo)紙上并瞄記其范圍，采用Leica 圖像分析儀計(jì)算實(shí)際面積。

1.2.3 血脂測(cè)定經(jīng)腹主動(dòng)脈采血2 mL 于促凝管中，離心制備血清，采用自動(dòng)生化儀三聯(lián)酶法檢測(cè)血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）。

1.2.4 血清e(cuò)NOS、NO及內(nèi)皮素1（ET-1）含量測(cè)定采用ELISA 法測(cè)定血清中eNOS、NO 及ET-1 含量。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行樣品制備，加入酶標(biāo)抗體孵育，待反應(yīng)終止后，采用全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀，于波長(zhǎng)450 nm 處測(cè)定各孔吸光度值（OD值），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算各組大鼠血清e(cuò)NOS 和ET-1 含量。

1.2.5 Western blot 檢測(cè)LC3Ⅱ/Ⅰ、p62 蛋白表達(dá)量股骨頭組織稱(chēng)重后置于組Ⅰ織研磨機(jī)中，將股骨頭研磨為勻漿狀，加入配置好的組織裂解液后置于冰上裂解，每個(gè)5 min 渦旋1 次，30 min 后置于高速離心機(jī)離心，吸取取上清液后采用BCA 法進(jìn)行蛋白定量。配制10%分離膠進(jìn)行凝膠電泳，100 V恒壓濕轉(zhuǎn)90 min。使用5%脫脂奶粉室溫下封閉60 min，裁取目的蛋白條帶并加入GAPDH（1∶1 000）、LC3Ⅱ/Ⅰ（1∶1 000）及p62（1∶1 000）抗體溶液，4 ℃搖床孵育過(guò)夜。第2天用PBST洗膜4次×5 min后加入二抗（1∶20 000，HRP 標(biāo)記）溶液，室溫孵育1 h。PBST 洗滌4 次后，瀝干膜表面水分，浸于ECL 化學(xué)發(fā)光液中，3 min 后將條帶鋪于膠片夾內(nèi)，于暗室內(nèi)進(jìn)行曝光、顯影。應(yīng)用Image-Pro Plus 軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠自噬活性評(píng)價(jià)結(jié)果比較與M 組比較，自噬干預(yù)后，M-3-MA 組大鼠股骨頭組織中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)量降低，而p62 蛋白表達(dá)量增加，M-Rap 組LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)量增加，而p62 蛋白表達(dá)量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠股骨頭組織中LC3Ⅱ/Ⅰ、p62 蛋白表達(dá)情況Fig.1 Protein expression of LC3Ⅱ/Ⅰand p62 in femoral head tissue of rats in each group

2.2 各大組鼠股骨頭壞死情況比較3 組大鼠股骨頭均發(fā)生了壞死，M 組、M-3-MA 及M-Rap 組發(fā)生率分別為66.7%（4/6）、100%（6/6）、33.33%（2/6），且各組組內(nèi)雌、雄鼠之間股骨頭壞死率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與M 組比較，M-3-MA 組大鼠股骨頭壞死面積更廣泛，而M-Rap 組平均股骨頭壞死面積更小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2、表1。

表1 3 組大鼠股骨頭壞死表面積比較Tab.1 Comparison of femoral head necrosis surface area among three groups±s

表1 3 組大鼠股骨頭壞死表面積比較Tab.1 Comparison of femoral head necrosis surface area among three groups±s

組別M 組（n = 6）M-3-MA 組（n = 6）M-Rap 組（n = 6）F 值P 值股骨頭壞死［例（%）］4（66.7）6（100）2（33.3）股骨頭壞死表面積（mm2）左（L）1.61 ± 0.17 2.56 ± 0.34 1.06 ± 0.21 17.121 0.001右（R）1.33 ± 0.22 1.98 ± 0.10 1.02 ± 0.10

圖2 3 組大鼠股骨頭標(biāo)本Fig.2 Rat femoral head specimens of three groups

2.3 各組大鼠血脂情況比較與M 組相比，自噬干預(yù)后M-3-MA 組大鼠血漿中TG、TCH 及LDL 水平升高而HDL 水平下降，M-Rap 組血漿中TG、TCH及LDL 水平下降而HDL 水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 3 組大鼠血脂情況比較Tab.2 Blood lipids of rats in three groups were compared ±s，mmol/L

表2 3 組大鼠血脂情況比較Tab.2 Blood lipids of rats in three groups were compared ±s，mmol/L

注：與M 組比較，#P ＜0.05

組別M 組（n = 6）M-3-MA 組（n = 6）M-Rap 組（n = 6）F 值P 值TG 1.85 ± 0.08 2.47 ± 0.15#1.19 ± 0.14#16.516＜0.05 TCH 4.36 ± 0.31 5.29 ± 0.23#3.16 ± 0.10#14.372＜0.05 HDL 1.82 ± 0.07 1.03 ± 0.11#2.85 ± 0.12#15.228＜0.05 LDL 0.52 ± 0.11 1.98 ± 0.09#0.28 ± 0.08#15.814＜0.05

2.4 各組大鼠血漿eNOS、ET-1 含量比較與M組相比，自噬干預(yù)后M-3-MA 組大鼠血清e(cuò)NOS、NO 含量降低而ET-1 升高，M-Rap 組大鼠血清e(cuò)NOS、NO 含量升高而ET-1 下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 3 組大鼠血清e(cuò)NOS、NO 及ET-1 含量比較Tab.3 Comparison of serum eNOS，NO and ET-1 contents among three groups±s

表3 3 組大鼠血清e(cuò)NOS、NO 及ET-1 含量比較Tab.3 Comparison of serum eNOS，NO and ET-1 contents among three groups±s

注：與M 組比較，#P ＜0.05

組別M 組（n = 6）M-3-MA 組（n = 6）M-Rap 組（n = 6）F 值P 值eNOS（U/mL）26.13 ± 3.21 20.32 ± 2.64#35.78 ± 3.13#22.367＜0.05 NO（μmol/L）21.38 ± 6.53 14.49 ± 9.62#30.72 ± 6.17#30.536＜0.05 ET-1（pg/mL）52.41 ± 6.82 68.92 ± 6.76#38.55 ± 7.56#27.284＜0.05

3 討論

SANFH的發(fā)病與代謝、凝血等多重因素有關(guān)［7］，隨著研究深入脂質(zhì)代謝紊亂成為了SANFH 研究的焦點(diǎn)。研究表明，激素可誘發(fā)高脂血癥進(jìn)而使得脂質(zhì)在全身多個(gè)部位出現(xiàn)沉積，部分脂滴會(huì)以胞飲的形式進(jìn)入組織細(xì)胞，形成細(xì)胞內(nèi)“占位”效應(yīng)，在股骨頭內(nèi)引發(fā)髓內(nèi)高壓、滋養(yǎng)血管閉塞、靜脈回流受阻等變化，最終導(dǎo)致細(xì)胞功能受損、死亡［8-9］。在SANFH 動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，激素不僅能夠削弱成骨細(xì)胞的作用，而且能增加股骨頭髓內(nèi)脂肪的生成，而阿托伐他汀類(lèi)等藥物能夠改善激素誘發(fā)的脂質(zhì)沉積［10-11］。此外激素進(jìn)入機(jī)體后，可與血液中未乳化的脂蛋白球結(jié)合形成脂肪栓子，進(jìn)而隨血液循環(huán)堵塞外周血管［12-13］，引發(fā)組織缺血性壞死。因此，在長(zhǎng)期、大量使用激素過(guò)程中若給予恰當(dāng)、有效的機(jī)體脂代謝調(diào)節(jié)措施，理應(yīng)能降低股骨頭壞死的發(fā)病率。2009年，SINGH 等［14］首次發(fā)現(xiàn)自噬能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)儲(chǔ)量，揭示了脂質(zhì)代謝過(guò)程中自噬的關(guān)鍵作用，并將這一現(xiàn)象命名為“脂肪噬”（lipophagy）。近年來(lái)的研究表明，脂質(zhì)吞噬作用在許多不同類(lèi)型的細(xì)胞中起作用，是細(xì)胞脂質(zhì)代謝的常見(jiàn)途徑［15］，適當(dāng)利用細(xì)胞內(nèi)的“脂肪噬”現(xiàn)象，可以作為治療脂肪肝等細(xì)胞內(nèi)有脂質(zhì)堆積的疾病的方法［16］。基于上述研究結(jié)果，推測(cè)自噬干預(yù)可能是治療SANFH 的新方向。

為驗(yàn)證研究假設(shè)，本研究構(gòu)建了SANFH大鼠模型，并同時(shí)給予自噬干預(yù)，觀察自噬干預(yù)對(duì)SANFH大鼠股骨頭壞死的改善情況。結(jié)果顯示，未實(shí)施自噬干預(yù)的大鼠股骨頭壞死率為66.7%，平均壞死面積為（1.47 ± 0.19）mm2，給予自噬抑制劑后，大鼠股骨頭組織細(xì)胞中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白明顯下降、p62 蛋白明顯升高，股骨頭壞死發(fā)生率為100%，壞死表面積為（2.27 ± 0.22）mm2，而當(dāng)給予自噬激活劑時(shí)，LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白明顯升高、p62蛋白明顯下降，股骨頭壞死發(fā)生率僅為33.33%，壞死表面積為（1.04 ± 0.15）mm2。這些結(jié)果表明，自噬干預(yù)的確在一定程度上能降低股骨頭壞死的發(fā)生率，且局限了病灶范圍。

為進(jìn)一步明確自噬干預(yù)效果是否與脂質(zhì)代謝、血管內(nèi)皮改善有關(guān)，本研究評(píng)估了每組大鼠血脂和血清e(cuò)NOS、NO、ET-1 含量。結(jié)果顯示，使用激素后大鼠的脂代謝出現(xiàn)了輕度異常，且使用3-MA 抑制自噬后，TG、TCH、LDL 水平明顯升高，HDL 水平明顯下降，而使用雷帕霉素激活自噬后，TG、TCH、LDL 水平明顯降低，HDL 水平明顯升高，接近于正常值。此外，自噬干預(yù)后血清e(cuò)NOS、NO及ET-1 含量同樣出現(xiàn)了顯著變化。與未實(shí)施自噬干預(yù)的大鼠相比，自噬活性被抑制的大鼠血清中eNOS、NO 含量明顯降低，且ET-1 含量明顯升高，而自噬活性被激活的大鼠eNOS、NO 含量明顯升高，且ET-1 含量明顯降低。眾所周知，eNOS、NO是內(nèi)皮損傷后進(jìn)行修復(fù)并維持血管擴(kuò)張狀態(tài)最為重要的物質(zhì)，對(duì)股骨頭的滋養(yǎng)血管也十分重要。而ET-1 是內(nèi)皮損傷后釋放入血的一種縮血管物質(zhì)，易使諸多滋養(yǎng)動(dòng)脈出現(xiàn)閉塞。這些結(jié)果表明，自噬干預(yù)是通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和促進(jìn)因高血脂導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷修復(fù)，從而改善大鼠股骨頭壞死情況。其機(jī)制在于：一方面血脂降低后，血液黏稠度下降，內(nèi)皮損傷減輕，脂肪栓子減少或消失，脂質(zhì)堆積減少或消失；另一方面自噬激活后，血管內(nèi)皮釋放大量eNOS 等內(nèi)皮修復(fù)物質(zhì)，減少了ET-1 等縮血管物質(zhì)，維持滋養(yǎng)血管良好灌注。

綜上所述，在激素進(jìn)入機(jī)體并誘發(fā)SANFH 的過(guò)程中，脂質(zhì)代謝紊亂發(fā)揮了關(guān)鍵作用，通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體組織細(xì)胞自噬活性，可有效改善股骨頭壞死的發(fā)生率和局限病灶范圍。因此，誘導(dǎo)自噬可成為治療SANFH 的新方向。本研究未就自噬干預(yù)效應(yīng)的分子機(jī)制作進(jìn)一步探究，后續(xù)還需要開(kāi)展相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。

【Author contributions】QU Xiaoxiao：Conceptualization，Methodology，Writing original-draft.QIAO Qingyang：Methodology.CHEN Ning：Investigation.SONG Tongyang：Formal analysis.LI Yu：Resorces.LIU Shuyi：Conceptualization，Supervision，Validation，Writing Review and Editing.All authors read and aplproved the final manuscript as submitted.