ANGPTL8敲除減輕DEN誘導的小鼠急性肝損傷

高玉玖 胡蓉 方晨 李盼盼 孟享 郭興榮 馮瑩

1湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院，基礎醫(yī)學院，胚胎干細胞研究湖北省重點實驗室（湖北十堰442000）；2湖北省十堰市太和醫(yī)院腎內科（湖北十堰442000）；3十堰市太和醫(yī)院臍帶血造血干細胞治療臨床醫(yī)學研究中心（湖北十堰442000）；4湖北醫(yī)藥學院生物醫(yī)學工程學院（湖北十堰442000）；5湖北醫(yī)藥學院第一臨床學院（湖北十堰442000）

急性肝損傷是由感染、藥物或酒精攝入過量等引起的以肝細胞功能受損為主要特征的臨床綜合征，是肝纖維化、肝硬化、肝癌等的重要誘因。由于其發(fā)病機制尚不明確，尚無特效治療藥物。進一步明確急性肝損傷發(fā)病機制，探索新型診斷標志物和治療靶點，具有重要的臨床意義。研究發(fā)現，急性肝損傷早期肝臟存在脂質代謝失衡［1］，進而對細胞膜、脂蛋白及其他脂質結構產生嚴重損害［2］，刺激炎癥因子釋放，引起肝細胞凋亡和壞死［3］。抑制細胞凋亡和逆轉肝臟脂代謝紊亂可改善肝損傷［4］。血管生成素樣蛋白8（ANGPTL8）是一種在肝臟和脂肪高表達的分泌性蛋白［5］，主要參與調節(jié)糖脂代謝、炎癥反應、癌細胞侵襲等過程［6］。最新研究發(fā)現，在高脂作用下，肝細胞分泌的ANGPTL8 可加速非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）相關肝纖維化［7］。那ANGPTL8 是否在急性肝損傷中發(fā)揮作用呢？本研究致力于探索ANGPTL8 在N-二乙基亞硝胺（DEN）誘導急性肝損傷中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物實驗采用的雄性C57BL/6J小鼠（15日齡及8 周齡）由湖北醫(yī)藥學院實驗動物中心提供，所有小鼠均飼養(yǎng)在SPF 級動物房［溫度：20～25 ℃，濕度：（50±5）%，光照：12 h/12 h 光/暗循環(huán)］中，均可自由獲取水和食物。本研究所有動物實驗均按照湖北醫(yī)藥學院動物倫理委員會批準規(guī)程進行［批準號：SYXK（鄂）2021-0031］。

1.1.2 試劑DEN（55-18-5）購于阿拉丁生化科技公司。ANGPTL8 抗體（ab180915）購自abcam 公司。丙氨酸轉氨酶（ALT）（C009-3-1）和天冬氨酸轉氨酶（AST）（C010-3-1）檢測試劑盒購于南京建成生物公司?；钚匝酰≧OS）檢測試劑盒（S0033S）、一步法TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒（紅色熒光）（C1089）均來源于碧云天。小鼠白細胞介素（IL）-6（ELMIL6-1）和IL-1β ELISA 檢測試劑盒（ELM-IL1b-1）購自RayBiotech 生物公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型構建取8 周齡野生型（WT）和ANGPTL8 敲除（ANGPTL8 KO）小鼠分別3 只，給予單次腹腔注射DEN（50 mg/kg）誘導急性肝損傷模型。誘導3 d 后取材，利用PCR 檢測肝臟組織中ANGPTL8 表達。取8 周齡WT 和ANGPTL8 KO小鼠分別3 只，給予DEN 誘導3 d 后提取肝原代細胞，利用免疫熒光技術檢測ANGPTL8 表達。取15日齡WT 及ANGPTL8 KO 小鼠各32 只分為7 組：正常對照組（n= 8），DEN 24 h 組（n= 8），DEN 48 h組（n=4），DEN 72 h 組（n=3），DEN 7 d 組（n=3），DEN 10 d 組（n= 3），DEN 14 d 組（n= 3），每只小鼠給予單次腹腔注射DEN（50 mg/kg）。分離血清和肝組織標本，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ? 周齡WT及ANGPTL8 KO 小鼠各8 只分為兩組：正常對照組（n= 4），DEN 48 h 組（n= 4），經過相同的DEN 處理，提取肝原代細胞，檢測活性氧含量。

1.2.2 ALT 和AST 檢測按照ALT 和AST 測試盒說明書通過微板法檢測ALT和AST含量。將ALT和AST 的基質液在37 ℃預溫，取20 μL 加入到96 孔板測定孔和對照孔中，取血清樣本5 μL 加入到96 孔板測定孔中，37 ℃孵育30 min。加入顯色液20 μL，37 ℃孵育20 min。加入終止液200 μL，室溫放置15 min。酶標儀檢測510 nm 的OD值，計算ALT 和AST 含量。

1.2.3 肝組織病理學HE染色分析取小鼠肝左葉，10%的甲醛固定，石蠟包埋切片，厚度為4 μm。HE染色，光學顯微鏡（Leica，Germany）觀察，采用Suzuki 評分法對肝損傷程度進行病理學評分［8］。

1.2.4 肝細胞凋亡檢測取小鼠肝右葉，4%多聚甲醛固定，30%蔗糖脫水，制備冰凍切片，采用TUNEL 試劑盒（碧云天）檢測。光學顯微鏡（Leica，Germany）觀察TUNEL 陽性細胞的數量，評估肝細胞凋亡水平。

1.2.5 肝原代實質細胞分離腹腔注射戊巴比妥鈉（45 mg/kg）麻醉小鼠，無菌下開腹，暴露肝門靜脈，經門靜脈插管（連接裝有HBSS 灌流液的蠕動泵），剪開下腔靜脈，勻速灌洗肝臟，待肝臟變?yōu)橥咙S色后，更換為含0.05% Ⅳ型膠原酶的消化液，待肝臟表面出現條紋樣紋理時終止消化。取下完整肝臟，置于DMEM 培養(yǎng)基中，分離肝組織，細胞篩過濾后離心，棄上清。PBS 重懸后離心，重復3 次以獲取高純度肝細胞。

1.2.6 肝細胞免疫熒光技術LPS（1 μg/mL）處理肝原代細胞，免疫固定液固定，ANGPTL8 抗體（ab180915，abcam）孵育過夜，PBS 漂洗，Alexa Fluor 488 標記山羊抗兔IgG（H+L）（A0423，碧云天）避光孵育，PBS 漂洗，顯微鏡觀察，進行后期分析。

1.2.7 肝細胞ROS檢測按ROS檢測試劑盒說明書（碧云天）進行，重懸肝細胞于已稀釋的DCFH-DA中，37 ℃孵育20 min，用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌3次，刺激細胞20～30 min 后，利用流式細胞儀和激光共聚焦顯微鏡進行檢測。使用488 nm 激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長，檢測熒光強弱，并進行后期統(tǒng)計。

1.2.8 IL-6 和IL-1β 水平檢測血清IL-6 和IL-1β通過ELISA 試劑盒進行檢測。試劑平衡至室溫，將血清樣本加入酶標孔中，37 ℃避光孵育90 min，洗板；加入生物素化抗體，37 ℃避光孵育60 min，洗板；加入酶工作液，37 ℃避光孵育30 min，洗板；加入TMB，37 ℃避光孵育15 min，加入終止液終止反應，在波長450 nm 處檢測吸光度值，根據標準曲線計算濃度。

1.2.9 實時熒光定量PCR（q-PCR）檢測肝臟ANGPTL8 的mRNA 水平取10 mg 肝組織，根據Trizol 法提取RNA，逆轉錄為cDNA，染料法熒光PCR 檢測。根據2-△△CT法計算ANGPTL8 的mRNA水平。

1.3 統(tǒng)計學方法本研究所有計量資料均用均值±標準差（）來表示。采用GraphPad Prism 9.0分析數據。多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DEN上調ANGPTL8表達為了研究ANGPTL8在DEN 誘導小鼠急性肝損傷中的表達，利用DEN腹腔注射WT 小鼠3 d，誘導急性肝損傷模型，并通過q-PCR 檢測肝臟組織中ANGPTL8 表達，結果發(fā)現DEN可顯著上調ANGPTL8表達（圖1A）。同時提取WT 小鼠肝原代實質細胞，經LPS 短期刺激誘導急性炎癥反應，利用免疫熒光技術觀察ANGPTL8表達情況，結果顯示在LPS 刺激肝原代細胞4 h 后，ANGPTL8 表達明顯升高（圖1B）。以上結果表明DEN 可上調ANGPTL8 表達，提示ANGPTL8 在DEN誘導的急性肝損傷中發(fā)揮作用。

圖1 DEN 上調ANGPTL8 表達Fig.1 DEN upregulates the expression of ANGPTL8

2.2 ANGPTL8 KO 減輕DEN 對小鼠急性肝細胞損傷程度血清轉氨酶是反映肝損傷的敏感生物指標，檢測小鼠ALT 和AST 水平可以反映小鼠肝損傷程度［9］。利用DEN（50 mg/kg）單次腹腔注射誘導急性肝損傷模型，血清檢測結果發(fā)現ANGPTL8 KO 小鼠ALT 和AST 水平降低，且在DEN 誘導48 h差異最明顯（圖2A）。HE 染色觀察肝損傷程度，結果顯示，與WT 小鼠相比，ANGPTL8 KO 小鼠肝小葉紊亂程度較輕，并觀察到炎癥相關細胞浸潤和肝細胞淤血、空泡樣變、壞死程度減輕（圖2B）。以上結果表明ANGPTL8 KO 可減輕DEN 對小鼠肝細胞的損傷程度。

圖2 ANGPTL8 敲除可減輕DEN 誘導的急性肝損傷Fig.2 ANGPTL8 knockout attenuates DEN-induced acute liver injury

2.3 ANGPTL8 缺失抑制DEN 誘導的急性肝損傷中活性氧產生DEN 引起的肝損傷常伴有氧化應激和功能障礙，并伴隨ROS 釋放增多，破壞自由基和抗氧化劑之間原有平衡，導致肝細胞破壞，觸發(fā)炎癥反應［10］。利用流式細胞術（圖3A）和激光共聚焦顯微鏡（圖3B）分析急性炎癥期WT 和ANGPTL8 KO 小鼠肝原代細胞中ROS 含量，以及加入重組ANGPTL8 蛋白（rANGPTL8）后ROS 含量。結果顯示ANGPTL8 缺失可抑制DEN 誘導的肝細胞ROS 產生，而加入rANGPTL8 后肝細胞活性氧增加。

圖3 ANGPTL8 敲除抑制DEN 誘導的ROS 產生Fig.3 Knockdown of ANGPTL8 inhibits DEN-induced ROS

2.4 ANGPTL8敲除減輕DEN誘導的急性肝損傷炎性因子表達大量ROS 累積會觸發(fā)炎癥，免疫細胞遷移到炎癥部位會分泌大量炎性因子［11］。在DEN 刺激后，除可直接造成肝細胞損傷外，還可刺激IL-6 和IL-1β 等促炎因子表達，從而級聯放大炎癥反應、加重組織損傷［12］。檢測ANGPTL8 在DEN誘導的肝臟急性炎癥期對小鼠炎性因子表達的影響（圖4），結果顯示ANGPTL8 KO 可減輕DEN 誘導炎性因子IL-6 和IL-1β 表達。

圖4 ANGPTL8 敲除可抑制炎性因子表達Fig.4 Knockout of ANGPTL8 inhibits the expression of inflammatory cytokines

2.5 ANGPTL8 促進DEN 誘導的急性肝損傷肝細胞凋亡取DEN 誘導的急性炎癥期肝臟組織，冰凍切片進行TUNEL 染色檢測細胞凋亡，結果發(fā)現在DEN 誘導48 h 后，ANGPTL8 KO 組中TUNEL 陽性細胞數顯著低于WT 組（圖5），表明ANGPTL8 可促進DEN 誘導的肝細胞凋亡。

圖5 ANGPTL8 敲除抑制DEN 誘導的肝細胞凋亡Fig.5 ANGPTL8 knockout suppresses DEN-induced hepatocyte apoptosis

3 討論

急性肝損傷指肝細胞出現急性損傷或壞死，進而引起肝功能異常，部分患者可導致肝衰竭。急性肝損傷病因復雜、發(fā)病機制尚不清楚，目前多采用消除病因或誘因、補充維生素、降酶保肝及中西醫(yī)結合等對癥支持治療，但晚期預后極差。對急性肝損傷的早期預測及干預，有利于改善預后，降低其發(fā)病率和病死率。

近年研究發(fā)現，肝臟脂質代謝失調通過影響脂質過氧化、活性氧產生和炎癥反應等調節(jié)肝損傷病理進程［13］。此外，長期肝細胞脂肪變性會導致肝細胞再生障礙甚至壞死，進而導致肝纖維化、肝硬化和肝癌［14］。最新研究證實，ANGPTL8 可調節(jié)肝星狀細胞活性，參與高脂及炎癥誘導的NAFLD相關性肝纖維形成過程，提示ANGPTL8 在肝臟脂代謝紊亂及炎癥刺激引起的肝損傷中發(fā)揮作用［7］。本研究發(fā)現DEN 可增強肝臟ANGPTL8 表達，而ANGPTL8 缺失可以顯著降低DEN 誘導的小鼠血清中轉氨酶活性，減輕肝組織炎性病變。DEN可使肝細胞產生大量氧自由基，引起DNA 損傷，刺激炎癥反應和過度增殖，導致長期慢性炎癥引起肝纖維化，甚至肝癌發(fā)生［15］。因此，ANGPTL8 可能在DEN 誘導的急性肝損傷中發(fā)揮重要作用，抑制其表達具有保護作用。

在DEN 誘導的急性肝損傷發(fā)生發(fā)展過程中，活性氧迅速累積，觸發(fā)炎癥反應［16］。炎癥反應激活后，免疫細胞遷移到炎癥部位并迅速分泌大量炎癥因子，導致“炎癥風暴”，肝細胞通過凋亡途徑，抑制炎癥反應加劇［17］。本研究發(fā)現，ANGPTL8 KO 可顯著減輕ROS 累積，抑制IL-6 和IL-1β表達，減少肝細胞凋亡。因此，糖脂代謝關鍵基因ANGPTL8 可能通過調控炎癥反應促進肝損傷發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，ANGPTL8 KO 通過抗炎、抗凋亡等途徑減輕DEN 誘導的急性肝損傷。ANGPTL8 作為急性肝損傷中重要致病因子，其抑制劑可能在急性肝損傷防治中具有潛在應用價值。本研究僅闡明了ANGPTL8 在DEN 短期刺激引起的急性肝損傷中的作用及機制，但其在DEN 長期誘導肝癌形成中的作用有待進一步探索。此外，ANGPTL8是分泌蛋白，其在急性肝損傷中是否與其他細胞（如枯否細胞和肝星狀細胞等）協(xié)同調控免疫微環(huán)境，還需深入研究。

【Author contributions】GAO Yujiu performed the experiments and wrote the article.HU Rong，FANG Chen，LI Panpan，and MENG Xiang performed the experiments.GUO Xingrong revised the article.FENG Ying designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.