LINC00657對結(jié)直腸癌細(xì)胞惡性行為影響及機(jī)制

［摘要］ 目的

探討長鏈非編碼RNA（lncRNA）LINC00657通過調(diào)控miR-26b及其靶基因黏膜相關(guān)組織淋巴瘤異位基因1（MALT1）對結(jié)直腸癌（CRC）細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響。

方法 用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測正常腸上皮細(xì)胞（NCM460）、CRC細(xì)胞系（HT29、HCT116和SW620）中LINC00657的表達(dá)水平。對HT29細(xì)胞轉(zhuǎn)染shRNA-LINC00657或shRNA-CON，分析沉默LINC00657對癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響。用雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證LINC00657、miR-26b和MALT1的靶向作用關(guān)系。對HT29細(xì)胞分別僅轉(zhuǎn)染shRNA-LINC00657、同時(shí)轉(zhuǎn)染shRNA-LINC00657+miR-26b inhibitor、同時(shí)轉(zhuǎn)染shRNA-LINC00657+pcDNA-MALT1，分析LINC00657通過miR-26b/MALT1軸對細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響。采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力，通過Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲和遷移能力。應(yīng)用RT-PCR檢測MALT1 mRNA表達(dá)水平，Western blot檢測MALT1蛋白的表達(dá)水平。

結(jié)果 CRC細(xì)胞系（HT29、HCT116和SW620）的LINC00657表達(dá)水平均高于正常腸上皮細(xì)胞（NCM460），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=30.267，Plt;0.05）。沉默LINC00657可以抑制HT29細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移（t=9.123～18.456，Plt;0.05）。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測證實(shí)，LINC00657靶向作用于miR-26b并下調(diào)其表達(dá)，miR-26b可負(fù)調(diào)控MALT1的表達(dá)。沉默LINC00657表達(dá)可抑制HT29細(xì)胞中MALT1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平（F=15.893、17.231，Plt;0.05）。轉(zhuǎn)染shRNA-LINC00657+miR-26b-inhibitor或shRNA-LINC00657+MALT1過表達(dá)載體以后，MALT1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平較僅轉(zhuǎn)染shRNA-LINC00657明顯上調(diào)（F=15.893、17.231，Plt;0.05），細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力也升高（F=4.783～8.893，Plt;0.05）。

結(jié)論 LINC00657在CRC細(xì)胞中高表達(dá)，可通過調(diào)控miR-26b/MALT1軸促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、侵襲以及遷移。

［關(guān)鍵詞］ 結(jié)直腸腫瘤；RNA，長鏈非編碼；黏膜相關(guān)淋巴樣組織淋巴瘤易位1蛋白；細(xì)胞增殖；腫瘤浸潤

［中圖分類號］ R735.34;R342.2

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

［文章編號］ 2096-5532（2023）06-0860-07

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.203

［網(wǎng)絡(luò)出版］ https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240104.1606.004;2024-01-05 20：10：18

EFFECTS OF LINC00657 ON MALIGNANT BEHAVIOR OF COLORECTAL CANCER CELLS AND UNDERLYING MECHANISMS

ZHANG Shengjun， ZHAO Ajing， ZHANG Anrui， LI Yawei， LI Xiaobao， LIU Minli

（Department of General Surgury， The Affiliated Hospital of Yan′an University， Yan ′an 716000， China）

; ［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the effects of long non-coding RNA （LINC00657） on the proliferation， invasion， and migration of colorectal cancer （CRC） cells by regulating miR-26b and its target gene mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation gene 1 （MALT1）.

MethodsReverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR） was used to mea-

sure the expression of LINC00657 in normal intestinal epithelial cells （NCM460） and CRC cell lines （HT29， HCT116， and SW620）. HT29 cells were transfected with shRNA-LIC00657 or shRNA-CON to analyze the effects of silencing LINC00657 on the proliferation， invasion， and migration of cancer cells. The targeted relationship between LINC00657， miR-26b， and MALT1 was verified by dual-luciferase reporter assay. HT29 cells were separately transfected with shRNA-LINC00657 alone， shRNA-

LINC00657+miR-26b inhibitor， and shRNA-LINC00657+pcDNA-MALT1 to analyze the effects of LINC00657 on cell proliferation， invasion， and migration through the miR-26b/MALT1 axis. Cell proliferation was determined using Cell Counting Kit-8. Cell invasion and migration was determined using Transwell assay. The expression level of MALT1 mRNA was measured by RT-PCR. The expression level of MALT1 protein was measured by Western blot.

ResultsThe expression levels of LINC00657 in CRC cell lines （HT29， HCT116， and SW620） were significantly higher than that in normal intestinal epithelial cells （NCM460） （F=30.267，Plt;0.05）. Silencing LINC00657 significantly inhibited the proliferation， invasion， and migration of HT29 cells （t=9.123-18.456，Plt;0.05）. The dual-luciferase reporter assay showed that LINC00657 targeted miR-26b to downregulate its expression， and miR-26b negatively regulated the expression of MALT1. Silencing LINC00657 expression significantly inhibited the expression of MALT1 mRNA and protein in HT29 cells （F=15.893，17.231，Plt;0.05）. Compared with those transfected with

shRNA-LINC00657 alone， the cells transfected with shRNA-

LINC00657+miR-26b inhibitor or shRNA-LINC00657+MALT1 overexpression vector had significantly up-regulated expression of MALT1 mRNA and protein （F=15.893，17.231，Plt;0.05） and significantly increased abilities of cell proliferation， invasion， and migration （F=4.783-8.893，Plt;0.05）.

ConclusionLINC00657 is highly expressed in CRC cells， which can promote the proliferation， invasion， and migration of cancer cells by regulating the miR-26b/MALT1 axis.

［KEY WORDS］colorectal neoplasms; RNA， long noncoding; mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation 1 protein; cell proliferation; neoplasm invasiveness

結(jié)直腸癌（CRC）是消化道常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率呈逐年上升之勢［1］。我國CRC新發(fā)人數(shù)占所有新發(fā)惡性腫瘤的9.9%［2］。CRC發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，因此，進(jìn)一步探索CRC的發(fā)病機(jī)制，對尋找其治療靶點(diǎn)有重要意義。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是長度超過200個(gè)核苷酸的RNA，在表觀遺傳調(diào)控等方面起到重要作用，在人體各個(gè)組織中均有表達(dá)［3］。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA與細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞周期、凋亡和自噬等密切相關(guān)，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展［3］。lncRNA有望成為CRC在內(nèi)的多種惡性腫瘤的生物標(biāo)志物。 LINC00657是近年來發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA，在CRC細(xì)胞系和組織中高表達(dá)，過表達(dá)LINC00657可促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖和侵襲［4］。血清LINC00657高表達(dá)與CRC病人不良生存預(yù)后有關(guān)［5］。lncRNA可作為一種競爭性內(nèi)源性RNA與微小RNA（microRNA，簡稱miRNA）相互作用，進(jìn)而調(diào)控信使RNA（mRNA）的表達(dá)。微小RNA-26b（miR-26b）在多種癌癥中發(fā)揮抑癌基因作用［6-7］，過表達(dá)miR-26b可以抑制CRC細(xì)胞的增殖和侵襲［8］。黏膜相關(guān)組織淋巴瘤異位基因1（MALT1）是miR-26b下游基因，miR-26b可負(fù)調(diào)控MALT1的表達(dá)進(jìn)而抑制腫瘤進(jìn)展［9］。本文分析LINC00657靶向調(diào)控miR-26b/MALT1對CRC細(xì)胞增殖、侵襲以及遷移的影響，為LINC00657在CRC中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

正常腸上皮細(xì)胞（NCM460）以及CRC細(xì)胞系（HT29、HCT116和SW620）購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。將細(xì)胞培養(yǎng)于含胎牛血清的改良Eagle培養(yǎng)液（DMEM）中，并加入10 g/L青霉素-鏈霉素，培養(yǎng)條件為37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2。細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代。

shRNA-LINC00657、miR-26b inhibitor、miR-26b mimics、攜帶有MALT1基因的過表達(dá)重組載體pcDNA-MALT1均購于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、CCK-8試劑盒、Transwell小室均購于上海炎怡生物科技有限公司。Lipofect AMINETM 2000試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒、凝膠快速制備試劑盒均購于日本寶生物工程株式會社。兔抗人MALT1多克隆抗體、GAPDH抗體均購于美國Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同細(xì)胞LINC00657相對表達(dá)量檢測 采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測正常腸上皮細(xì)胞（NCM460，a組）、CRC細(xì)胞系（HT29，b組；HCT116，c組；SW620，d組）的LINC00657表達(dá)水平。用TRIzol法提取細(xì)胞RNA，隨后反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，反應(yīng)條件為37 ℃、15 min，85 ℃、15 s。以cDNA為模板，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃、10 min，95 ℃、30 s，60 ℃、15 s，72 ℃，20 s。LINC00657引物及其序列見表1。用2－△△Ct法計(jì)算LINC00657相對表達(dá)量。

1.2.2 沉默LINC00657對HT29細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響 將細(xì)胞分為shRNA-CON組（轉(zhuǎn)染shRNA-CON，a組）和shRNA-LINC00657組（轉(zhuǎn)染shRNA-LINC00657，b組），并嚴(yán)格按照Lipofect AMINETM 2000試劑盒步驟進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。采用1.2.1的RT-PCR方法檢測兩組細(xì)胞的LINC00657表達(dá)水平。采用CCK-8檢測細(xì)胞增殖：嚴(yán)格按照CCK-8試劑盒說明進(jìn)行操作，取對數(shù)生長期細(xì)胞，以每孔1×104個(gè)細(xì)胞密度接種于96孔板；待細(xì)胞貼壁后，分別于培養(yǎng)24、48、72、96 h時(shí)加入10 μL的CCK-8溶

液；用酶標(biāo)儀檢測光密度（OD）值，反映細(xì)胞增殖能力；實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲和遷移：嚴(yán)格按照Transwell試劑盒的說明書進(jìn)行操作。遷移實(shí)驗(yàn)：將細(xì)胞密度調(diào)整為1.5×108/L，取200 μL細(xì)胞懸液加入Transwell上室；向下室中加入600 μL培養(yǎng)液，培養(yǎng)2 h后棄去培養(yǎng)液，用棉簽擦去上室中未遷移細(xì)胞，加入甲醇固定10 min；隨后用1 g/L結(jié)晶紫染色15 min，顯微鏡下（放大40倍）觀察細(xì)胞形態(tài)并計(jì)數(shù)細(xì)胞。

侵襲實(shí)驗(yàn)：用細(xì)胞培養(yǎng)液將基質(zhì)膠（Matrigel）稀釋15倍，隨后加入Transwell上室，37 ℃培養(yǎng)4 h；后續(xù)步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證LINC00657、miR-26b和MALT1的作用關(guān)系 用StarBase工具預(yù)測LINC00657和miR-26b的結(jié)合位點(diǎn)，預(yù)測miR-26b和MALT1的結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)預(yù)測結(jié)果，設(shè)計(jì)并且合成結(jié)合位點(diǎn)的野生型（WT）和突變型（MT）序列。①分別將結(jié)合位點(diǎn)的野生型序列（MT-LINC00657）及突變型序列（WT-LINC00657）插入熒光素酶報(bào)告基因載體（Pgl3-basic），分別與過表達(dá)靶基因質(zhì)粒（miR-26b mimics）或陰性對照共轉(zhuǎn)染HEK239細(xì)胞，分別檢測陰性對照組（a組）與LINC00657沉默組（shRNA-LINC00657組，b組）miR-26b表達(dá)水平。②分別將結(jié)合位點(diǎn)的野生型序列（MT-miR-26b）及突變型序列（WT-miR-26b）插入熒光素酶報(bào)告基因載體（Pgl3-basic），分別與過表達(dá)靶基因質(zhì)粒（pcDNA-MALT1）或陰性對照共轉(zhuǎn)染HEK239細(xì)胞，分別檢測陰性對照組與miR-26b抑制組（miR-26b inhibitor組，c組）MALT1表達(dá)水平。最后檢測熒光素酶相對活性。

1.2.4 上調(diào)miR-26b/MALT1對HT29細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響 ①轉(zhuǎn)染和分組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟嚴(yán)格按照Lipofect AMINETM 2000試劑盒進(jìn)行，將細(xì)胞隨機(jī)分為CON組（不轉(zhuǎn)染，a組）、shRNA-LINC00657組（僅轉(zhuǎn)染shRNA-LINC00657，b組）、shRNA-LINC00657+miR-26b inhibitor組（轉(zhuǎn)染shRNA-LINC00657和miR-26b inhibitor，c組）、shRNA-LINC00657+MALT1組（細(xì)胞同時(shí)轉(zhuǎn)染shRNA-LINC00657和過表達(dá)載體pcDNA-MALT1，d組）。②RT-PCR檢測MALT1 mRNA表達(dá)水平：引物及其序列見表2。③Western blot檢測MALT1蛋白表達(dá)水平：細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑，在冰上裂解30 min后離心10 min，應(yīng)用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。隨后加入上樣緩沖液，并煮沸5 min，應(yīng)用SDS-PAGE分離蛋白并將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，應(yīng)用50 g/L的脫脂牛奶封閉1 h。加入MALT1抗體（1∶500）以及GAPDH抗體（1∶1 000），孵育過夜。洗膜3次后，加入羊抗兔IgG抗體（1∶5 000，美國Sigma公司），孵育1 h后洗膜3次，最后進(jìn)行ECL顯色。④采用CCK-8檢測細(xì)胞增殖，采用Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲和遷移。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以±s形式表示，兩組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)；多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)；重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量方差分析，兩兩比較用LSD檢驗(yàn)。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)" 果

2.1 CRC細(xì)胞系LINC00657表達(dá)水平

CRC細(xì)胞系（包括HT29、HCT116和SW620）LINC00657表達(dá)水平的總體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=30.267，Plt;0.001）。LSD兩兩比較結(jié)果顯示，HT29、HCT116和SW620的LINC00657表達(dá)水平均高于正常腸上皮細(xì)胞（NCM460），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均lt;0.05）。見圖1。

統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.123～18.456，Plt;0.05）。重復(fù)測量方差分析顯示，隨著時(shí)間延長兩組細(xì)胞增殖活力均升高（F時(shí)間=10.002，Plt;0.05），組間總體差異有顯著性（F組間=6.897，Plt;0.05），時(shí)間和組間交互作用同樣顯著（F時(shí)間×組間=4.001，Plt;0.05），LSD兩兩比較發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)48、72、96 h時(shí)shRNA-CON組細(xì)胞增殖活力均高于shRNA-LINC00657組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。見圖2。

2.3 LINC00657靶向調(diào)控miR-26b介導(dǎo)MALT1的表達(dá)

用StarBase工具預(yù)測LINC00657和miR-26b的結(jié)合位點(diǎn)。見圖3A。將WT-LINC00657插入熒光素酶報(bào)告基因載體，過表達(dá)miR-26b后熒光素酶的活性下降（t=5.674，Plt;0.05）。見圖3B。沉默LINC00657后，miR-26b表達(dá)水平升高（t=8.123，Plt;0.05）。見圖3C。以上結(jié)果提示，miR-26b是LINC00657的靶基因。用StarBase工具預(yù)測miR-26b和MALT1的結(jié)合位點(diǎn)見圖3D。將WT-miR-26b插入熒光素酶報(bào)告基因載體，過表達(dá)miR-26b后熒光素酶活性下降（t=7.009，Plt;0.05）。見圖3E。抑制miR-26b后，MALT1表達(dá)水平升高（t=11.120，Plt;0.05）。見圖3F。提示MALT1是miR-26b的靶基因。

2.4 上調(diào)miR-26b/MALT1對HT29細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的影響shRNA-LINC00657組、shRNA-LINC00657+miR-26b-inhibitor組、shRNA-LINC00657+MALT1組及CON組的MALT1蛋白及基因表達(dá)水平、細(xì)胞侵襲、細(xì)胞遷移的總體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.230～17.231，Plt;0.05）。兩兩比較顯示，與CON組相比，沉默LINC00657表達(dá)可以抑制HT29細(xì)胞中MALT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平，差異有顯著性（P均lt;0.05）。轉(zhuǎn)染shRNA-LINC00657+miR-26b-inhibitor或者shRNA-LINC00657+MALT1過表達(dá)載體后，MALT1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平較shRNA-LINC00657組明顯上調(diào)（Plt;0.05）。見圖4A、B。

重復(fù)測量方差分析顯示，隨著時(shí)間延長4組細(xì)胞增殖活力均升高（F時(shí)間=29.897，Plt;0.05），組間總體比差異有顯著性（F組別=4.783，Plt;0.05），時(shí)間和組別的交互作用同樣有顯著性（F時(shí)間×組別=3.897，Plt;0.05）。兩兩比較結(jié)果顯示，與CON組相比較，細(xì)胞培養(yǎng)48、72、96 h時(shí)沉默LINC00657可明顯抑制HT29細(xì)胞的增殖（Plt;0.05）。轉(zhuǎn)染shRNA-LINC00657+miR-26b-inhibitor或shRNA-LINC00657+MALT1過表達(dá)載體后，HT29細(xì)胞的增殖力較shRNA-LINC00657組高（Plt;0.05）。見圖4C。

與CON組相比較，沉默LINC00657可以顯著抑制HT29細(xì)胞的侵襲和遷移（P均lt;0.05）。轉(zhuǎn)染shRNA-LINC00657+miR-26b-inhibitor或者shRNA-LINC00657+MALT1過表達(dá)載體后，HT29

細(xì)胞的侵襲和遷移力較shRNA-LINC00657組高（P均lt;0.05）。見圖5。

3 討" 論

lncRNA作為競爭性內(nèi)源性RNA與miRNA相互作用，進(jìn)而調(diào)控mRNA表達(dá)，在CRC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［10］。有研究發(fā)現(xiàn)，LINC00657高表達(dá)與乳癌［11］和胰腺癌［12］等發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本文研究結(jié)果顯示，CRC細(xì)胞系中LINC00657表達(dá)水平升高，與既往報(bào)道一致［4，13］。另外，沉默LINC00657可以抑制HT29細(xì)胞的增殖、侵襲以及遷移，這提示LINC00657參與CRC發(fā)生。

LINC00657在腫瘤中的作用機(jī)制目前尚未完全明確。已有研究顯示，LINC00657高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，并抑制凋亡［11，14］。在CRC中，LINC00657高表達(dá)可通過促進(jìn)肝素酶（HPSE）基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)CRC細(xì)胞侵襲和遷移［4］。另外，LINC00657高表達(dá)也能通過激活PI3K/AKT通路促進(jìn)直腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲［13］。

LINC00657可通過miRNA/mRNA軸促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，例如，LINC00657高表達(dá)通過miR-26b-5p/COMMD8軸促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展［14］；通過miR-424/PD-L1軸促進(jìn)肝細(xì)胞癌進(jìn)展［15］。本研究通過生物信息學(xué)分析表明，LINC00657和miR-26b有結(jié)合位點(diǎn)，miR-26b和MALT1有結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了miR-26b是LINC00657的靶基因，MALT1是miR-26b的靶基因。已有研究表明，miR-26b參與CRC進(jìn)展［16］，并且MALT1也是CRC的治療靶點(diǎn)［17］。為了進(jìn)一步證實(shí)沉默

LINC00657通過上調(diào)miR-26b/MALT1對HT29細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的影響，本文研究對HT29細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染shRNA-LINC00657+miR-26b-inhibitor或者轉(zhuǎn)染shRNA-LINC00657+MALT1過表達(dá)載體后，細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力較僅轉(zhuǎn)染shRNA-LINC00657的細(xì)胞高。以上結(jié)果提示，LINC00657通過上調(diào)miR-26b/MALT1調(diào)控CRC細(xì)胞行為。

綜上所述，LINC00657在CRC細(xì)胞中高表達(dá)，可通過調(diào)控miR-26b/MALT1軸促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。LINC00657可能成為CRC治療靶點(diǎn)。本研究也存在一些局限性，例如未檢測CRC組織LINC00657的表達(dá)水平及其與病人生存預(yù)后的關(guān)系。未來需要開展臨床和基礎(chǔ)研究，進(jìn)一步探尋LINC00657在CRC中的作用機(jī)制。

［參考文獻(xiàn)］

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（本文編輯 牛兆山）