小桐子YABBY全基因組家族成員的鑒定、表達和可變剪接分析

張作勝, 龔明, 吳丹丹, 楊宇, 劉麗宵, 王莎莎

小桐子全基因組家族成員的鑒定、表達和可變剪接分析

張作勝, 龔明, 吳丹丹, 楊宇, 劉麗宵, 王莎莎*

(云南師范大學生命科學學院, 生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心, 云南省生物質能與環(huán)境生物技術重點實驗室, 昆明 650500)

為發(fā)掘能源植物小桐子()的YABBY轉錄因子，以最新公布的小桐子基因組序列為參考，在全基因組層面鑒定出5個亞家族的7個基因，同一亞家族的成員具有相似的氨基酸序列、基因結構和保守基序組成。YAB2和FIL/YAB3亞家族的2個旁系同源基因對(/、/)具有良好的共線性關系，表明片段復制或全基因組復制是小桐子YABBY家族擴張的主要方式。純化選擇是進化的主要動力，而YAB2亞家族成員可能在進化中經(jīng)歷了更明顯的功能分化?；虮磉_模式和蛋白互作預測分析表明JcYAB2B和JcYAB3可能在種子的發(fā)育過程中起到重要的調(diào)控作用；同時，細胞分裂素、干旱或高鹽脅迫處理抑制了大多數(shù)JcYABs成員的基因表達。此外，轉錄組測序結合qRT-PCR分析表明，低溫處理有效誘導和的基因表達模式發(fā)生變化，并伴隨著新的、截短的可變剪接轉錄本的動態(tài)積累。因此，推測JcYABs可能通過剪接體的功能競爭或功能互補參與低溫響應的調(diào)節(jié)，這些結果有助于更好地了解YABBY家族成員的功能分化并闡明可變剪接如何調(diào)控小桐子低溫響應的分子機制。

小桐子; YABBY基因家族; 可變剪接; 生物信息學; 基因表達

YABBY轉錄因子屬鋅指蛋白超家族，是植物特有的小基因家族，成員均由2個高度保守的結構域組成，即N-端的鋅指結構域(Cys2-Cys2型)和C-端的YABBY結構域(具螺旋-環(huán)-螺旋基序)，被認為與DNA特異性結合有關[1]。自1999年首次報道以來[2]，基因已在多種植物中得到分離和功能研究，被認為廣泛參與植物的多項生命進程，如器官發(fā)生和極性建立、果實成熟、激素信號和非生物脅迫響應等[3–4]。

模式植物擬南芥()有6個基因，被分為5個亞家族，分別是CRABS CLAW (CRC)、 FILAMENTOUS FLOWER (FIL)/ YABBY3 (YAB3)、INNER NO OUTER (INO)、YABBY2 (YAB2)和YABBY5 (YAB5)，在器官發(fā)育中起不同作用并存在一定的功能冗余[5]?？偟膩碚f，所有AtYABBYs均可通過促進遠軸表面的細胞分化參與側生器官近-遠軸極性的建立，其中AtFIL/AtYAB1、AtYAB2、AtYAB3和AtYAB5共同調(diào)控營養(yǎng)器官如葉片的發(fā)育[5]，而AtCRC和AtINO則主要參與花器官的形成，如心皮、蜜腺[2]和胚珠的發(fā)育[6]。番茄()有9個基因，具有與擬南芥同源基因相似的組織表達模式但存在明顯的功能差異。以YAB2亞家族為例，主要在開花和果實發(fā)育中調(diào)節(jié)心皮數(shù)量[7]，而則可能影響果皮細胞的發(fā)育命運并調(diào)控果實的成熟[8]。在單子葉植物中，水稻()的YABBY家族由8個成員構成，其中OsDL和OsYAB1分別作為AtCRC和AtYAB2的直系同源物，前者主要調(diào)控葉片主脈形成、心皮發(fā)育和花分生組織的決定[9–10],后者可參與赤霉素生物合成的反饋調(diào)節(jié)[11], 但尚未證明二者功能與側生器官的極性形成有關。OsYAB2在種子落粒中起關鍵作用[12]，而()、()、()則是維持所有生殖分生組織正確功能所必需的[13]。此外，前人[14–15]通過在擬南芥中異源表達先后證實了小麥()的TaYAB1和TaYAB2均參與葉片的極性建立，Strable等[16]則證實玉米()的2個CRC同源物drooping leaf1 (drl1)和drooping leaf2 (drl2)是花分生組織決定和花器官發(fā)育所必需的。

另一方面，表達分析表明干旱、高鹽和ABA等處理下棉花() YABBY家族的多數(shù)成員均下調(diào)表達[17]，大豆() GmYABBY3、GmYABBY10和GmYABBY16雖為誘導表達，但在擬南芥中異源表達證實GmYABBY10作為負調(diào)因子參與干旱和高鹽脅迫響應[18]。熒光素酶活性分析顯示番茄SlYABBY2b可直接與(吲哚乙酸酰胺合成酶基因)的啟動子結合抑制其轉錄[19]，而VvYABBY4則可作為轉錄激活因子影響葡萄()的種子發(fā)育和果實形態(tài)建成[20]。這些均表明YABBY家族在種子植物生長發(fā)育過程中的功能相對保守，但參與激素或環(huán)境脅迫響應的作用方式及家族成員的功能分化仍有待探索。

可變剪接(alternative splicing, AS)是一種廣泛存在于真核生物的mRNA前體(pre-mRNA)加工方式, 通過調(diào)節(jié)不同mRNA剪接體的穩(wěn)定性、運輸、定位和翻譯，維持細胞內(nèi)功能性和非功能性轉錄本之間的穩(wěn)態(tài)和平衡[21]，或調(diào)節(jié)編碼蛋白的分子特征和功能，是增加轉錄組和蛋白組結構與功能多樣性的重要機制，在晝夜節(jié)律、成花轉變、表型變異、發(fā)育調(diào)控以及脅迫響應中起重要作用[22]。但目前有關植物基因的可變剪接研究還未見報道。

小桐子()是大戟科(Euphorbiaceae)麻瘋樹屬具有巨大開發(fā)潛力的能源植物樹種，其種子含油量平均可達34.4%，是加工生物柴油的優(yōu)質原料[23]。小桐子屬典型的喜溫冷敏型植物[24]，低溫冷害是限制其種子產(chǎn)量、地理分布和產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要環(huán)境因素?；诨蚣易逶诜N子植物生長發(fā)育和逆境響應的前期研究，本研究根據(jù)最新公布的小桐子基因組組裝和轉錄組測序數(shù)據(jù)[25–26]，在全基因組層面對基因家族成員的理化性質、結構特征、進化關系和表達模式進行系統(tǒng)分析，揭示了不同成員在低溫脅迫下的轉錄及可變剪接變化, 為其在小桐子的遺傳改良和抗逆分子育種的潛在應用奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 小桐子YABBY家族的成員鑒定和理化性質分析

從NCBI網(wǎng)站提取小桐子基因組和蛋白質序列用于構建本地數(shù)據(jù)庫(RJC1_Hi-C, BioProject: PRJ NA601606)，采用2種方法從小桐子全基因組中查找基因。首先自Pfam數(shù)據(jù)庫獲取YABBY基因(PF04690.15)的隱馬爾科夫模型(hidden Markov model)，用HMMER軟件(v3.2.2)的hmmsearch程序在小桐子蛋白質數(shù)據(jù)庫中搜索候選YABBY蛋白(E- value<0.001)；同時以擬南芥的全部6個YABBY蛋白(下載自擬南芥數(shù)據(jù)庫TAIR)作為參考序列，對小桐子蛋白數(shù)據(jù)庫進行BLAST檢索(E-value<10–5)。經(jīng)去除冗余序列、過濾可變剪接體獲得候選序列, 提交至NCBI CDD數(shù)據(jù)庫(Conserved Domains Database)驗證保守結構域，最終獲得基因家族成員(s)。ExPASy在線程序被用于蛋白理化性質分析，亞細胞定位和磷酸化修飾位點分別以Plant-mPLoc server (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)和GPS 5.0軟件進行預測。

1.2 系統(tǒng)發(fā)育、蛋白基序組成和基因結構分析

利用Clustal Omega對小桐子、擬南芥、葡萄、水稻和玉米YABBY家族成員的氨基酸序列進行多重比對，并通過MEGA X以鄰接法(neighbor-joining, NJ)構建無根系統(tǒng)發(fā)育樹(參數(shù)設置：P-distance模型, complete deletion, bootstrap 1 000次重復)，并依據(jù)與擬南芥同源物的進化關系對家族成員進行命名。WEB LOGO (http://weblogo.threeplusone.com)和MEME suite (https://meme-suite.org/meme/)分別用于創(chuàng)建保守結構域(C2C2鋅指域和YABBY域)的序列標識圖和注釋保守基序(參數(shù)設置：氨基酸殘基數(shù)6～100 aa，基序數(shù)量15)，并以MPI Bioinformatics Toolkit (https:// toolkit.tuebingen.mpg.de)的REPPER工具對保守域的二級結構進行預測。最后以Gene Structure Display Server (GSDS, v2.0, http://gsds.gao-lab.org)在線工具繪制基因結構圖。為全面展示基因及編碼蛋白的結構特征，本文自NCBI、小桐子JCDB數(shù)據(jù)庫[26]提取的全部轉錄本用于基因結構及蛋白基序分析。

1.3 染色體定位、共線性和選擇壓力分析

從NCBI基因組數(shù)據(jù)庫下載小桐子基因組gff3注釋文件，結合高密度連鎖圖譜[27]獲取基因的染色體位置信息，用MapGene2Chrom (v2.0, http://mg2c.iask.in/ mg2c%5Fv2.0/)繪制基因的染色體分布圖。共線性分析基于蛋白序列的本地blast (參數(shù)設置: E-value<10–5, num_alignments 5)和基因位置信息，以TBtools內(nèi)置的MCScanX程序完成[28]。經(jīng)OrthoFinder程序查找同源基因對，KaKs_Calculator 2.0軟件根據(jù)自然梯度(natural gradient descent, NG)法計算非同義替換率(non-synonymous substitution rate, Ka)和同義替換率(synonymoussubstitution rate, Ks)值, 以Ka/Ks評估同源基因對的進化選擇壓力[29]。

1.4 啟動子順式作用元件和蛋白互作網(wǎng)絡預測分析

提取各基因編碼區(qū)起始ATG上游2.0 kb的基因組序列提交至PlantCARE數(shù)據(jù)庫(http://bioinfor matics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)，用于統(tǒng)計基因啟動子區(qū)順式作用元件的數(shù)量和種類；以STRING網(wǎng)站(https://string-db.org)預測蛋白間的互作關系，以基因為節(jié)點、以連線展示互作關系，最后依據(jù)可信度分值選擇前20% (90對)互作關系以Cytoscape軟件(v3.8.2)加以可視化。

1.5 基于轉錄組數(shù)據(jù)的表達模式分析

1.6 植物材料與低溫處理

供試小桐子種子采收自云南省元謀縣，經(jīng)消毒后置于浸濕的濾紙上浸種18 h，轉入26 ℃、75%相對濕度的人工氣候箱中暗萌發(fā)7 d，此后轉移至營養(yǎng)土中生長至兩葉一心期[31]。選取健康均一的幼苗轉入12 ℃低溫鍛煉并分別于0 (對照)、6、12、24和48 h后收獲第2片(形態(tài)學頂端)真葉，經(jīng)液氮速凍后于–80 ℃保存，用于總RNA提取。每個處理設置3組生物學重復，每個重復取自3株獨立幼苗。

1.7 低溫脅迫下的基因表達模式分析

葉片組織總RNA的提取按照RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司, 北京)完成。選擇高質量的RNA樣品1g, 經(jīng)PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser for RealTime試劑盒反轉錄(寶日醫(yī), 大連)獲得第一鏈cDNA。qRT-PCR反應采用TB Green?? II試劑盒(寶日醫(yī), 大連)，每10L反應體系中包含5L TB GreenII (2×)、上/下游引物(10mol/L)各0.4L、cDNA模板稀釋液1L和ddH2O 3.2L。反應由Roche LightCycler?96 System實時熒光定量PCR儀完成。反應程序為: 95 ℃預變性30 s；然后95 ℃變性10 s，57 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，共45個循環(huán)；最后95 ℃ 5 s，60 ℃ 60 s,97 ℃15 s。以2–△△CT法計算相對表達量，以基因(GenBank登錄號XM_012230660.3)作為內(nèi)參。每組實驗均設置3個技術重復、2～3組生物學重復, 以SPSS軟件(v26.0)進行顯著性分析(ANOVA，單因素分析)，以<0.05表示顯著差異。

1.8 轉錄組測序和可變剪接分析

小桐子幼苗的第2片真葉被用于RNA-seq測序(Illumina HiSeq 4000平臺，NCBI登錄號: PRJNA66 1688)，用rMATS軟件(v4.0.1)檢測可變剪接事件[32]。以SnapGene軟件分析同一基因不同mRNA剪接體的結構，根據(jù)RNA-seq預測的AS位點兩端設計特異性引物，經(jīng)高保真酶(LA Taq, 寶日醫(yī), 大連)擴增和測序驗證后，以半定量RT-PCR (Green Taq Mix, 諾唯贊，南京)同時檢測全長轉錄本和可變剪接體在低溫脅迫下的豐度變化。以基因(GenBank登錄號XM_ 012230243.3)為內(nèi)參對cDNA樣本均一化，以電泳條帶的灰度分析評估轉錄變化。

2 結果和分析

2.1 YABBY基因家族成員的鑒定

綜合利用本地BLAST和hmmsearch工具，首先在小桐子全基因組中共查找到12條候選YABBY蛋白。經(jīng)去除冗余序列、可變剪接體過濾和保守結構域確認，最終鑒定出7個基因(s), 并依據(jù)其在進化上與模式植物擬南芥中同源蛋白的親緣關系進行命名。從表2可見，JcYAB2B是最小的成員，僅由162個氨基酸殘基組成，分子量為18.32 kD, 而最大的JcINO則包含284個氨基酸殘基，分子量為32.18 kD。JcYABs蛋白的等電點為6.83～9.34，亞細胞定位預測所有成員均定位于細胞核。

2.2 JcYABs的系統(tǒng)進化、蛋白基序及其基因結構分析

選擇模式植物擬南芥、玉米、水稻和葡萄的YABBY蛋白用于構建系統(tǒng)發(fā)育樹(NJ法)，結果表(圖1)明，5種植物的41個YABBY成員可分為5個亞家族，其中YAB5亞家族僅由雙子葉植物來源的YABBY蛋白構成。YAB5、INO、CRC亞家族各包含1個JcYAB成員，這與其他雙子葉植物一致。此外，JcYAB1、JcYAB3同屬FIL/YAB3亞家族, 而YAB2亞家族也包含2個成員JcYAB2A、JcYAB2B，但值得注意的是，大多數(shù)JcYABs與葡萄的同源蛋白聚在同一支，而JcYAB2B似乎與單子葉植物的同源蛋白有更近的系統(tǒng)發(fā)育關系。

表1 本研究所用引物信息

對小桐子與擬南芥的YABBY同源蛋白進行多重序列比對，結果表明(圖2: A), 位于N-端的鋅指結構域保守度相對較低，且各成員在二級結構組成上也存在差異，主要的保守結構包括3個較小的片層，中間以1個短-螺旋間隔存在(, 圖2: B, C)。位于C-端約40個氨基酸殘基構成的結構域存在于所有成員中，具高的保守性，不僅包括潛在的核定位信號(nuclear localization signal, NLS)，二級結構預測也顯示該區(qū)域存在2個高度保守、較長的-螺旋元件(圖2: B, C)。

圖1 小桐子YABBY家族成員的系統(tǒng)進化分析。Jc: 小桐子; Os: 水稻; At: 擬南芥; Zm: 玉米; Vv: 葡萄。下同

表2 小桐子YABBY家族成員的理化性質和基因結構

從圖2: D可見，在注釋到的15個基序中，Motif 1、Motif 3 (YABBY結構域)及Motif 2 (鋅指域)存在于所有JcYAB蛋白(含可變剪接體)中，且同一亞家族成員的基序構成高度一致，如Motif 6、Motif 10和Motif 11為CRC亞家族所特有，而INO亞家族的2個成員均含有特異性的Motif 9和Motif 12。唯一的例外是JcYAB2B，在進化上屬YAB2亞家族,但保守基序組成卻與YAB5亞家族成員完全一致,并缺失了JcYAB2A與AtYAB2共有的、緊鄰YABBY結構域的特征性小基序Motif 14 (LKLDGNN/KK), 這與我們的系統(tǒng)發(fā)育分析結果一致。

基因結構分析表明,s基因長度為2 271 ()～5 365 bp ()，由6～7個內(nèi)含子組成，外顯子平均長度為91.60 bp，與擬南芥(92.63 bp)十分接近。YABBY結構域的編碼區(qū)均位于第3～6個外顯子，尤其外顯子4和5在所有成員中的長度完全一致，分別為49、76 bp。JcCRC的3個可變剪接轉錄本(～)在外顯子3的5′端存在6～33 nt的缺失，而JcINO.2僅在外顯子5的5′端缺失3 nt，但這均不影響編碼蛋白的保守基序組成(圖2: D)。另一方面，基因內(nèi)含子長度差異極大，其中內(nèi)含子4的相對最小(84～179 bp)，而位于N-端鋅指結構域編碼區(qū)間隔的內(nèi)含子1長度差異最大(118～2 448 bp)，暗示內(nèi)含子對JcYABs家族進化和成員功能分化的潛在意義。

2.3 JcYABs的染色體定位、共線性和選擇壓力分析

根據(jù)Wu等[27]公布的小桐子高密度基因連鎖圖譜, 7個s基因定位至11個連鎖群(linkage group, LG)中的6個(表2)，呈明顯的不均勻分布，其中和均定位于LG8，而其余基因分別定位于LG2、LG6、LG7、LG9和LG11。MCScanX共線性分析表明，小桐子基因家族中不存在串聯(lián)復制事件，、和屬散在復制, 其余4個均來自片段復制或全基因組復制(segmental duplication/WGD)，其中//為共線性基因對(圖3: A)?；贠rthoFinder的同源性分析也證實//分別為來自FIL/YAB3和YAB2正交群的2個旁系同源基因對，其Ka/Ks分別為0.17、0.22 (均遠小于1，表3)，表明這2個亞家族在進化中受到強烈的純凈選擇。

圖2 小桐子與擬南芥YABBY蛋白的序列比對(A)、保守度(B)、保守結構域的二級結構預測(C)和基因結構(D, 紅色方框示不同轉錄本的差異)

表3 小桐子YABBY家族同源基因對的Ka/Ks

圖3 JcYABs基因的染色體定位和啟動子順式作用元件。A: 染色體定位，2個共線性基因對以紅色虛線相連; B: 擬南芥、葡萄的YABBY同源基因的5′ UTR結構; C: 順式作用元件。

2.4 JcYABs基因啟動子順式作用元件分析

首先從NCBI基因組數(shù)據(jù)庫獲取擬南芥、葡萄的YABBY同源基因的基因組DNA和全長mRNA序列, 其5′ UTR均無內(nèi)含子(圖3: B)，基于此對s基因潛在啟動子區(qū)域(起始密碼子上游2.0 kb)的順式作用元件進行查找, 其順式作用元件可歸為4類(圖3: C)，其中光響應元件的豐度最高且分布于全部s基因的啟動子區(qū)域(8～21個)，其次是激素(包括脫落酸、水楊酸、赤霉素和生長素)和防御脅迫響應元件。值得注意的是，HD-Zip 1和GCN4 Motif分別作為參與葉肉細胞或內(nèi)皮細胞分化的重要調(diào)控元件，僅存在于2個“生殖型”基因和的啟動子中。含較多的激素響應元件，包括2個TCA-element (水楊酸響應)、2個P-box (赤霉素響應)、1個TGA-element (生長素響應)和1個ABRE (脫落酸響應)，暗示其在小桐子生長發(fā)育調(diào)控中的潛在功能。典型的防御脅迫響應元件，如低溫響應元件LTR (low-temperature responseveness)、干旱誘導元件MBS (MYB binding site involved in drought-inducibility)則主要存在于、和，表明這些“營養(yǎng)型”基因可能是小桐子非生物脅迫響應中的重要調(diào)節(jié)因子。

2.5 JcYABs的表達模式

基因的表達模式是功能預測的重要參考，從圖4: A可見，和分別僅在花器官(花序、花芽)和幼葉中表達，具明顯的組織表達特異性(T值分別為0.96、0.93)。其余s的組織表達特異性則較低(T值0.41～0.62)，幾乎在所有的組織器官中均可表達，其中和在至少3種組織(如莖尖、幼葉、花芽)中具有遠高于其他成員的轉錄豐度，可能是參與營養(yǎng)器官形成與發(fā)育的重要成員。這些差異化的表達模式暗示s基因在小桐子生長發(fā)育過程中的功能多樣性。

圖4: B為在小桐子種子發(fā)育階段(14～45 DPA)的表達模式變化，在整個階段維持相對穩(wěn)定的表達，而和多數(shù)時候幾乎不表達，其劇烈的表達上調(diào)主要歸因于二者極低的本底表達。在關鍵的胚乳干物質積累期(29～41 DPA)強烈誘導，在35 DPA時可達發(fā)育初期(14 DPA)的20.1倍。與此相反，和的轉錄水平則分別在29和35 DPA后持續(xù)下降至對照(14 DPA)的7.7%、8.4%，而的轉錄水平則隨種子發(fā)育持續(xù)下降，到41 DPA后幾乎檢測不到，我們推測和可能分別是小桐子種子發(fā)育的正調(diào)節(jié)和負調(diào)節(jié)因子。

圖4 JcYABs基因的表達模式(公開的RNA-seq數(shù)據(jù))。A: 組織器官; Sd: 種子; SA: 莖尖; YL: 幼葉; In: 花序; FB: 花芽; St: 莖; Rt: 根; B: 種子發(fā)育階段(授粉后14～45 d); C: 激素處理; GA: 赤霉素; BA: 6-芐基腺嘌呤; CTK: 細胞分裂素; p2, p4, p22: CTK分別處理2、4、22 h; D, E: 干旱脅迫; F: 高鹽脅迫。

2.6 植物激素與非生物脅迫下的表達模式

順式作用元件分析表明，s基因對植物激素和非生物脅迫存在差異性的轉錄響應。對小桐子腋芽(莖部節(jié)間)的轉錄組數(shù)據(jù)分析可知，僅的轉錄受到赤霉素GA3或6-BA的顯著影響但效應相反,顯示2種激素調(diào)節(jié)表達的拮抗性作用(圖4: C)。另一方面，細胞分裂素對JcYABs家族的轉錄抑制效應在花序分生組織中普遍存在。經(jīng)1 mmol/L 6-BA處理后，除持續(xù)下調(diào)外，其余s 在處理2 h后明顯下調(diào)(-16.88～-2.63倍)并持續(xù)至處理后4 h (p4)，至處理后22 h，此抑制效應基本消失甚至在個別成員轉為誘導表達，如(2.02倍)和(4.19倍)，這暗示JcYABs可能作為小桐子莖部分支和成花誘導的負調(diào)節(jié)因子起作用。

從圖4: D, F可見，對短期干旱(1～7 d)的響應模式與高鹽脅迫(100 mmol/L NaCl，2 h～7 d)類似，根系和葉片組織中的、和均無顯著響應。2種脅迫分別抑制和在葉片中的轉錄，而2個“生殖型”YABBY成員和的抑制表達主要發(fā)生在根系(約為對照的5%)。另一方面，長期干旱脅迫下、和在根系和葉片中呈相反的響應模式, 但顯著的脅迫誘導表達效應僅出現(xiàn)在極個別根系樣品中(圖4: E)。

2.7 JcYABs在低溫脅迫下的轉錄和可變剪接變化模式

小桐子是典型的冷敏植物，低溫是限制其生長發(fā)育、地理分布和種子產(chǎn)量的主要環(huán)境因子。對經(jīng)12 ℃處理的葉片進行qRT-PCR分析(圖5),、、和均不同程度地受到低溫的誘導，其中的誘導效應最為明顯且持續(xù)至48 h, 達對照的2.25倍。相反,和則在低溫處理24 h內(nèi)持續(xù)下調(diào)，分別下降至對照的15.91%、50.21%，之后有不同程度的恢復。此外, 雖同為共線性同源基因對，/和/表達量的皮爾遜相關系數(shù)卻分別為-0.44和0.77，這表明JcYABs家族的不同成員在小桐子的低溫響應中存在一定的功能分化。

綜合Hi-seq高通量轉錄組測序和半定量RT-PCR分析，初步揭示s基因在低溫處理小桐子葉片中的可變剪接(AS)變化模式，結果表明和均可通過可變剪接產(chǎn)生1條新的轉錄本(圖6: A, B)。根據(jù)二者在NCBI數(shù)據(jù)庫已有的注釋信息，我們將新AS型轉錄本分別命名為。對新轉錄本及其編碼區(qū)的結構分析可知,屬“第1個外顯子可變剪接(alternative firstexon, AFE)”類型，其推測的蛋白產(chǎn)物與相比缺失N-末端的第1～30個氨基酸，從而引起motif2和C2C2鋅指域的部分缺失(圖6: C, 圖2: D)。則為“外顯子跳躍(exon skipping, ES)”型可變剪接事件，原轉錄本的第5外顯子缺失引起編碼序列中第123位Lys突變?yōu)锳sn及之后的移碼突變，造成motif 1和YABBY結構域的大段缺失(圖6: C, 圖2: D)。2個新轉錄本均隨著低溫處理時間的延長在小桐子葉片中顯著積累，且在24 h時相對豐度達到最高, 隨后有所下降，且低溫對的轉錄誘導更為明顯(圖6: D)，這暗示低溫脅迫可能通過不同剪接體間的相對豐度變化調(diào)節(jié)小桐子的低溫抗性。

圖5 JcYABs基因在12 ℃低溫脅迫下的表達模式(qRT-PCR)

2.8 JcYABs蛋白的互作網(wǎng)絡預測分析

蛋白互作對轉錄因子的活性調(diào)節(jié)及作用機制十分重要，基于STRING數(shù)據(jù)庫中的互作關系預測了JcYABs蛋白的互作網(wǎng)絡(圖7)，轉錄因子ANT、KANADI似乎是小桐子YABBY蛋白互作的中心, 暗示他們可能通過形成大的轉錄因子復合體共同調(diào)控下游基因的表達。一個與MAPK途徑密切相關的LRR型受體ERECTA可與JcINO、JcCRC和JcYAB JcYAB1發(fā)生互作，而磷酸化修飾位點預測分析也表明這3個JcYAB蛋白均含有至少5個MAPK潛在作用位點。此外，6個生長素相關蛋白(如SAUR20、ARG7)僅與JcYAB5存在互作，而JcYAB2B的互作調(diào)節(jié)相對獨立于其他成員，表明該成員在作用機制上也存在特異性。這可為深入探索小桐子YABBY家族轉錄因子的分子功能提供新的思路。

圖6 JcYABs基因可變剪接體的鑒定和低溫響應。A: 可變剪接事件引起JcYAB2A轉錄本和推定的蛋白序列變化; B: 可變剪接事件引起JcYAB2B轉錄本和推定的蛋白序列變化; C: 可變剪接事件對編碼蛋白保守結構域的影響; D: JcYAB2A/2B本底與新可變剪接轉錄本在低溫下的積累模式；*和紅色虛線框均表示不同轉錄本和蛋白產(chǎn)物的差異。

圖7 JcYABs蛋白互作網(wǎng)絡預測

3 結論和討論

基因編碼一組植物特異性轉錄因子，主要參與葉片、莖和花器官的分化與發(fā)育，目前其功能研究已在擬南芥、番茄、水稻等植物中廣泛開展，但在能源植物小桐子中還未見報道。本研究在小桐子基因組中鑒定出7個基因，在5個亞家族中的成員分布與擬南芥基本一致。同一亞家族的JcYABs成員具有相似的結構特征，包括2個保守結構域(鋅指域、YABBY結構域)的氨基酸組成、蛋白基序排列、基因結構、外顯子數(shù)量乃至部分外顯子長度都是高度保守的。已有研究表明C-X2-C-X9- P-X11-C-X2-C基序是形成C2C2型鋅指結構域的核心元件，在小桐子和棉花的YABBY蛋白中均存在[17]。此外JcYAB蛋白的YABBY結構域在序列保守度高于N-端的鋅指域，含有2個位置上相鄰、較長的-螺旋結構，這與Siegfried等[33]的報道一致。這表明同一亞家族的成員可能來自一個共同的祖先并具有保守的生物學功能。

基因復制是基因家族擴張的主要推動力，其中片段復制、串聯(lián)復制和轉座事件被認為是植物主要的進化模式[34]?；蚬簿€性分析表明小桐子的FIL/YAB3和YAB2亞家族似乎保留了基因復制產(chǎn)生的旁系同源基因，/基因對較高的Ks值(1.62)顯示其復制與分化時間遠早于/[35], 可能來自于小桐子基因組經(jīng)歷的古老的全基因復制事件(同源基因對Ks=1.56)[27]，結合二者在蛋白基序組成上的差異，我們推測JcYAB2亞家族成員在進化中經(jīng)歷了更為明顯的功能分化。此外，系統(tǒng)發(fā)育分析表明FIL/YAB3和YAB2具有明顯高于其余亞家族的基因數(shù)量，主要歸因于單子葉植物玉米和水稻中的亞家族擴張[36]。YAB5亞家族僅包含雙子葉植物來源的YABBY成員，這與之前的報道[3,17]一致, 而該亞家族是在單子葉植物進化過程中發(fā)生丟失還是在單子葉、雙子葉植物分化后才出現(xiàn)的，還有待進一步研究。

小桐子是一種生產(chǎn)種子油的重要能源植物，種子產(chǎn)量是其產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要保障，其種子發(fā)育階段的轉錄分析可為胚胎發(fā)生、種子成熟與品質評價提供重要信息。施用外源性植物生長調(diào)節(jié)劑(如6-BA)增加雌花和/或兩性花的數(shù)量是提升小桐子種子產(chǎn)量的可選措施[37]。本研究表明6-BA對JcYAB家族的轉錄抑制效應在花序分生組織中普遍存在，推測JcYABs可能作為負調(diào)節(jié)因子參與花器官發(fā)育、兩性花誘導和雌雄花比例控制[38]。已有研究表明發(fā)育后期(授粉29 d后)是小桐子種子貯存物質(三酰甘油為主)合成與積累的關鍵時期[39]，盡管本研究中近一半基因的轉錄(、和)隨種子發(fā)育持續(xù)下降，但卻在發(fā)育后期顯著上調(diào)，可能是通過轉錄調(diào)控網(wǎng)絡調(diào)節(jié)胚胎發(fā)生和代謝轉換的重要環(huán)節(jié)。

對開花植物而言，種子是來自胚珠的最重要的生殖器官，Kelley等[40]指出()和基因家族是擬南芥胚珠珠被發(fā)育和遠軸細胞命運決定的核心調(diào)節(jié)因子。盡管目前尚無直接證據(jù)證實KAN與YABBY家族的協(xié)同功能源自蛋白的直接互作[41]，但KAN家族編碼含GRAP結構域的MYB轉錄因子，對擬南芥突變株(/)的功能研究表明，其不同成員間(～)存在功能冗余, 可能是基因的上游轉錄抑制因子[42]。Stahle等[43]以酵母雙雜交證實AtFIL、AtYAB3和AtYAB5均可與LEUNIG (LUG)發(fā)生互作，后者編碼1個富含WD重復的轉錄抑制因子，可通過抑制花同源異型基因()的轉錄參與花器官的發(fā)育[44]。本研究的蛋白互作預測分析表明KAN可能是小桐子YABBY蛋白互作的中心，KAN4與JcINO、JcYAB1和JcYAB3均可能發(fā)生直接互作，而LUG則特異性地與JcYAB1和JcCRC存在互作，顯示這3個JcYAB成員在小桐子生殖發(fā)育中的潛在功能。

除在植物形態(tài)發(fā)生和器官發(fā)育的保守功能外,近年對棉花、葡萄等植物的研究均證實YABBY家族成員具有顯著脅迫響應特異性，Peng等[45]指出3個基因的轉錄受4 ℃低溫誘導，并可與生長素或其他激素的互作參與構樹()在低溫下的生長發(fā)育調(diào)節(jié)。本研究表明小桐子基因在干旱和高鹽脅迫下多為下調(diào)表達，卻不同程度受低溫誘導，尤以的誘導效應最為明顯，而其旁系同源基因則呈現(xiàn)低溫下的轉錄抑制，這在菠蘿()的家族中同樣存在[46]。此外，蛋白互作預測顯示雖同為YAB2亞家族成員但僅JcYAB2A可與轉錄因子KAN2互作，這與我們對該亞家族成員的功能分化預測相符，未來可借助酵母雙雜交、雙熒光素酶等系統(tǒng)進一步驗證YABBY轉錄因子形成轉錄抑制復合物調(diào)節(jié)下游靶基因的分子機制。

可變剪接是增加真核生物轉錄組和蛋白組多樣性的重要轉錄后基因表達調(diào)控機制[47]，盡管有關基因可變剪接的研究還未見報道，但本研究綜合RNA-seq查找和qRT-PCR驗證，表明和均可產(chǎn)生1條新的、受低溫顯著誘導積累的可變剪接轉錄本。低溫對的轉錄誘導更為明顯，與該基因在低溫脅迫下的轉錄抑制正相反，這與Li等[48]對茶樹()低溫適應下可變剪接的研究結果一致。我們推測JcYABs可能存在全長和剪接體的功能互補或功能競爭，維持功能型和非功能型轉錄本間的穩(wěn)態(tài)和平衡[21,49], 調(diào)節(jié)小桐子的低溫抗性。然而，此類“截短的”翻譯產(chǎn)物是否產(chǎn)生且活性如何，或轉錄本是否在翻譯初期即被無義介導的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay, NMD)機制清除，還有待深入探索。

綜上所述，盡管YABBYs被報道能夠參與植物的多種生長發(fā)育和脅迫響應過程，但有關其在植物低溫脅迫響應中的功能目前仍知之甚少。本研究在能源植物小桐子基因組中鑒定出分屬5個亞家族的7個基因，在基因結構、蛋白組成、進化分析等生物學分析的基礎上，通過轉錄響應、可變剪接模式和蛋白互作預測，揭示了不同成員在生長發(fā)育和脅迫響應等方面的潛在功能差異，并初步明確了YAB2亞家族的2個成員JcYAB2A和JcYAB2B的明顯功能分化，為今后基因的功能解析和小桐子抗逆性基因資源的挖掘利用提供參考信息。

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Genome-wide Characterization, Expression Profiles and Alternative Splicing Events ofFamily Genes in

ZHANG Zuosheng, GONG Ming, WU Dandan, YANG Yu, LIU Lixiao, WANG Shasha*

(Key Laboratory of Biomass Energy and Environmental Biotechnology of Yunnan Province, Engineering Research Center of Sustainable Development and Utilization of Biomass Energy, Ministry of Education, School of Life Sciences, Yunnan Normal University,Kunming 650500, China)

In order to explore the YABBY transcription factor of, sevengenes from five subfamilies were identified at the genome-wide level based on the newly published genome sequence of. Members of the same subfamily had similar amino acid sequence, gene structure and conserved motifs. Two pairs of paralogs from YAB2 (/) and FIL/YAB3 (/) subfamily showed good collinearity, indicating that segmental duplication/whole genome duplication was the primary cause ofgene family expansion. Purifying selection might be the main impetus during evolution, while candidates of YAB2 subgroup underwent more significant functional divergence. The expression patterns together with protein-protein interaction prediction suggested that JcYAB2B and JcYAB3 might play crucial roles in seed development, meanwhile the transcription of mostwere remarkably repressed under exogenous cytokinin, drought or salinity stress. In addition, RNA sequencing and qRT-PCR analysis confirmed that the paralogous gene pair/exhibited differential cold-responsive transcription in leaves, and their newly identified transcripts were both dynamically accumulated during cold treatment. Therefore, it was speculated thatmight participate in the regulation of low temperature response through functional competition or functional complementarity of spliceosome. These would help to understand the evolution of YABBY family, and elucidate how AS events play a crucial regulatory role in cold response of.

; YABBY family gene; Alternative splicing; Bioinformatics; Gene expression

10.11926/jtsb.4570

2021-11-17

2022-03-11

國家自然科學基金項目(31860062, 31460182)資助

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31860062, 31460182).

張作勝，男，碩士研究生。E-mail: 3048937351@qq.com

通訊作者Corresponding author.E-mail: sasha_wng@163.com