貴州省不同產(chǎn)區(qū)茶葉中7種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

劉 佳，趙昌燕，蔡 滔*，龐宏宇

（1.貴州省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，貴陽 550001;2.貴州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與健康學(xué)院，貴陽 550001）

中國是茶葉的搖籃，同時(shí)也是世界上茶葉產(chǎn)量和消費(fèi)量最大的國家，在中國按加工工藝和發(fā)酵程度，茶葉主要分為六大類：綠茶、白茶、青茶、紅茶、黑茶和黃茶[1]。茶樹喜愛濕熱的生長環(huán)境，貴州省屬于亞熱帶季風(fēng)性濕潤氣候，雨量充沛，雨熱同期，四季分明，加上貴州省多山多丘陵的地勢，非常適宜大面積種植，近幾年茶園面積增長迅速。然而大規(guī)模茶樹種植過程中離不開農(nóng)藥的使用，因此農(nóng)藥殘留問題難以避免[2-3]。由于茶農(nóng)不合理地使用化學(xué)農(nóng)藥，導(dǎo)致茶葉中農(nóng)藥殘留超標(biāo)，嚴(yán)重影響了茶產(chǎn)品的質(zhì)量與安全，也制約和限制了我國茶葉的對(duì)外貿(mào)易。因此，提升茶葉的農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)，對(duì)于保障茶葉食品安全具有重大意義。

由于茶葉中含有多種有機(jī)酸、咖啡因、游離糖、兒茶素、色素、鋅、硒、錳和其他微量物質(zhì)[4]，在農(nóng)藥殘留檢測過程中這些成分通常會(huì)產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，根據(jù)不同的影響效果又可分為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)和基質(zhì)減弱效應(yīng)[5]。若在分析過程中未考慮基質(zhì)效應(yīng)，計(jì)算待測物在實(shí)際樣品中的含量時(shí)會(huì)產(chǎn)生較大的誤差，從而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，研究評(píng)價(jià)不同產(chǎn)區(qū)茶葉中農(nóng)藥基質(zhì)效應(yīng)是非常有必要且意義重大。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是檢測和分析農(nóng)藥殘留最常用的方法。它們具有高靈敏度、高通量和準(zhǔn)確定量的優(yōu)點(diǎn)[6-9]。然而，在液質(zhì)分析中大多數(shù)農(nóng)藥表現(xiàn)出基質(zhì)減弱效應(yīng)，這也是液質(zhì)分析的主要缺點(diǎn)之一。由于茶葉樣品基質(zhì)復(fù)雜，在檢測過程中會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的基質(zhì)效應(yīng)，需要通過前處理對(duì)其進(jìn)行凈化。固相萃取[10]、液液萃取[11]、基質(zhì)固相分散萃取[12]等是在茶葉農(nóng)殘檢測中傳統(tǒng)的前處理方法，常需多次凈化步驟，操作繁瑣且費(fèi)時(shí)。QuEChERS前處理法具有經(jīng)濟(jì)環(huán)保、操作簡單、適用范圍廣的特點(diǎn)[13]，在茶葉中農(nóng)藥多殘留檢測中應(yīng)用最為廣泛。

本試驗(yàn)基于QuEChERS前處理結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，以茶樹種植大省貴州省不同種植區(qū)的紅茶、綠茶、白茶和黑茶為研究基質(zhì)，在低、中、高3種不同添加水平下考察了克百威、啶蟲脒、乙酰甲胺磷、噻蟲嗪、氧樂果、辛硫磷和苯醚甲環(huán)唑的基質(zhì)效應(yīng)，并進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，旨在提高茶葉中農(nóng)藥殘留檢測的精度，為茶葉中多種農(nóng)藥殘留檢測提供補(bǔ)充和參考，為保障茶葉品質(zhì)提供重要技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

克百威、啶蟲脒、乙酰甲胺磷、噻蟲嗪、氧樂果、辛硫磷和苯醚甲環(huán)唑，7種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液均為1 000 μg/mL，農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心。

甲醇、乙腈（色譜純），賽默飛世爾科技公司；純凈水，娃哈哈集團(tuán)有限公司；QuEChERS茶葉前處理提取包和凈化包，安捷倫公司；有機(jī)相微孔濾膜（0.2 μm），島津儀器公司。

電子天平（0.01 g）、移液槍，梅特勒托利多公司；多管渦旋振蕩器，杭州米歐儀器有限公司；冷凍離心機(jī)，德國安本德；LC-MS/MS（AB SCIEX QTRAP 5500）、液相色譜柱（2.6 μm，C18100 mm×2.1 mm），美國飛諾美公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.2.1 農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確吸取1.00 mL農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液分別于10.00 mL容量瓶中，甲醇定容，得到各農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。避光4℃保存，保存期為半年。

分別準(zhǔn)確移取1.00 mL各單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于25 mL容量瓶中，甲醇定容，得到混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。于4℃避光保存，保存期為3個(gè)月。

1.2.2 基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

用各個(gè)空白茶葉樣品的提取液配制成不同濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 樣品的前處理

1.3.1 樣品采集

從貴州省的幾大茶葉主產(chǎn)區(qū)：黔東南州、遵義市、銅仁市、安順市、都勻市和黔南州選取深受消費(fèi)者喜愛且遠(yuǎn)銷國內(nèi)外的紅茶、綠茶、白茶和黑茶共65個(gè)樣品作為本次試驗(yàn)用樣品。

1.3.2 樣品前處理

稱取2 g茶葉試樣（精確至0.01 g）于50 mL塑料離心管中，加入10 mL水渦旋混勻，靜置30 min，加入15 mL乙腈、QuEChERS茶葉前處理提取包及陶瓷均質(zhì)子，蓋上蓋子放入多管渦旋振蕩器2 500 r/min振蕩5 min。4 200 r/min離心5 min。吸取8 mL上清液加到15 mL的QuEChERS茶葉凈化管中，渦旋振蕩1 min，4 200 r/min離心5 min。準(zhǔn)確吸取2 mL上清液過微孔濾膜裝入進(jìn)樣瓶中。每份樣品做2個(gè)平行。

1.3.3 加標(biāo)試驗(yàn)

精確稱取5 g茶葉樣品，添加一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，靜置30 min后，參照1.3.2節(jié)進(jìn)行樣品前處理。每份樣品做2個(gè)平行。

1.4 樣品的測定

1.4.1 高效液相色譜條件

色譜柱：C18，100 mm×2.1 mm；流動(dòng)相A：甲醇；流動(dòng)相B：0.05%甲酸水溶液，流速為0.300 mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：2 μL。流動(dòng)相梯度條件見表1。

1.4.2 液相色譜質(zhì)譜分析條件

離子源類型：電噴霧離子源；掃描方式：正離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測：每種農(nóng)藥分別選擇2個(gè)離子，所有待測參數(shù)的子離子按照出峰順序，分時(shí)段分別檢測。每種農(nóng)藥的保留時(shí)間、母離子、子離子及質(zhì)譜參數(shù)，參見表2。

表2 茶葉中7 種農(nóng)藥殘留LC-MS/MS 分析條件

1.5 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)用MultiQuant軟件和Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算和分析?；|(zhì)效應(yīng)（ME）按照式（1）計(jì)算。

式中：A1和A2分別為乙腈和茶葉樣品中農(nóng)藥的峰響應(yīng)值。-20%≤ME＜0為弱基質(zhì)抑制效應(yīng)；-50%≤ME＜-20%之間為中等基質(zhì)抑制效應(yīng)；ME＜-50%為強(qiáng)基質(zhì)抑制效應(yīng)；0＜ME≤20%為弱基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，在20%＜ME≤50%之間為中等基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；ME＞50%為強(qiáng)基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；ME=0為無基質(zhì)效應(yīng)。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 加標(biāo)回收率

在添加水平為0.20、0.40 mg/kg和1.00 mg/kg下進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)樣設(shè)置1個(gè)平行樣，結(jié)果詳見表3。結(jié)果顯示，乙酰甲胺磷和氧樂果的純?nèi)芤簶?biāo)準(zhǔn)溶液定量回收率明顯偏低，添加水平為0.20 mg/kg時(shí)，回收率為30%左右，而當(dāng)使用基質(zhì)標(biāo)校正后回收率有非常明顯的提升，達(dá)到60%以上；啶蟲脒、克百威、苯醚甲環(huán)唑和辛硫磷的純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液定量回收率與其對(duì)應(yīng)的基質(zhì)標(biāo)定量回收率沒有明顯的變化；噻蟲嗪的回收率經(jīng)過基質(zhì)標(biāo)校正后略有提升。

表3 7 種農(nóng)藥在茶葉中的加標(biāo)回收率統(tǒng)計(jì)

2.2 茶葉整體基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

研究隨機(jī)選取了貴州省4大類65個(gè)不同茶葉基質(zhì)，其中綠茶、紅茶和白茶各20個(gè)、黑茶5個(gè)。考察乙酰甲胺磷、啶蟲脒、克百威、苯醚甲環(huán)唑、氧樂果、辛硫磷、噻蟲嗪共7種農(nóng)藥在QuEChERS前處理下采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）進(jìn)行測定時(shí)的茶葉中的基質(zhì)效應(yīng)。7種農(nóng)藥在茶葉中整體基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)情況如圖1所示。由于基質(zhì)成分的差異，不同農(nóng)藥在不同茶葉基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)存在一定差異，但在同一大類基質(zhì)上也表現(xiàn)出一定的基質(zhì)效應(yīng)趨勢。7種農(nóng)藥在茶葉中產(chǎn)生基質(zhì)抑制效應(yīng)占比72%，基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)占比28%。其中強(qiáng)基質(zhì)抑制效應(yīng)占比25%；中等基質(zhì)抑制效應(yīng)占比18%；弱基質(zhì)抑制效應(yīng)占比29%；強(qiáng)基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)占比0.2%；中等基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)占比2.8%；弱基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)占比25%。說明在不同茶葉基質(zhì)中，LC-MS/MS測定不同農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)主要以基質(zhì)抑制效應(yīng)為主，而不同農(nóng)藥在茶葉基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)強(qiáng)弱存在差異。

圖1 7 種農(nóng)藥在茶葉中整體基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

2.3 不同農(nóng)藥在茶葉中的基質(zhì)效應(yīng)分析

規(guī)定基質(zhì)效應(yīng)在-20%～20%之間為弱基質(zhì)抑制（增強(qiáng)）效應(yīng)，在-50%～-20%和20%～50%之間為中等基質(zhì)抑制（增強(qiáng)）效應(yīng)，超出±50%為強(qiáng)基質(zhì)抑制（增強(qiáng)）效應(yīng)。研究結(jié)果顯示，7種農(nóng)藥在茶葉基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)影響程度均不相同，具體的基質(zhì)效應(yīng)情況詳見圖2。7種農(nóng)藥在茶葉中均存在基質(zhì)效應(yīng)，但不同農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)差異較大。乙酰甲胺磷和氧樂果在茶葉中主要表現(xiàn)為強(qiáng)基質(zhì)抑制效應(yīng)和中等基質(zhì)抑制效應(yīng)；啶蟲脒、克百威、苯醚甲環(huán)唑和辛硫磷在茶葉中主要表現(xiàn)為弱基質(zhì)效應(yīng)；噻蟲嗪在茶葉中主要表現(xiàn)為中等基質(zhì)抑制和弱基質(zhì)抑制效應(yīng)。

圖2 7 種農(nóng)藥在65 種茶葉中的基質(zhì)效應(yīng)情況

2.4 不同種類茶葉基質(zhì)效應(yīng)分析

試驗(yàn)結(jié)果顯示，乙酰甲胺磷在紅茶和黑茶中表現(xiàn)出明顯的強(qiáng)基質(zhì)抑制效應(yīng)；在綠茶和白茶中表現(xiàn)出強(qiáng)基質(zhì)抑制效應(yīng)和中等基質(zhì)抑制效應(yīng)。啶蟲脒和克百威在紅茶、綠茶和白茶中表現(xiàn)出弱基質(zhì)抑制和弱基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；在黑茶中表現(xiàn)為弱基質(zhì)抑制（表4）。由此可推斷，不同種類的茶葉基質(zhì)對(duì)農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)有較大的影響。

表4 7 種農(nóng)藥在不同茶葉基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)

3 討論與結(jié)論

運(yùn)用QuEChERS前處理方法，結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，對(duì)貴州省的紅茶、綠茶、黑茶和白茶在不同添加水平下對(duì)克百威、啶蟲脒、乙酰甲胺磷、噻蟲嗪、氧樂果、辛硫磷和苯醚甲環(huán)唑的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，采用LC-MS/MS測定7種農(nóng)藥在茶葉中的基質(zhì)效應(yīng)主要以基質(zhì)抑制效應(yīng)為主。不同農(nóng)藥在不同茶葉中均存在基質(zhì)效應(yīng)差異；乙酰甲胺磷和氧樂果在茶葉中主要表現(xiàn)為強(qiáng)基質(zhì)抑制效應(yīng)，啶蟲脒、克百威、苯醚甲環(huán)唑和辛硫磷主要表現(xiàn)為弱基質(zhì)效應(yīng)，噻蟲嗪主要表現(xiàn)為中等基質(zhì)抑制效應(yīng)。茶葉的種類對(duì)7種農(nóng)藥在茶葉中的基質(zhì)效應(yīng)影響較大。

按照加工工藝將茶葉分成紅茶（全發(fā)酵茶）、綠茶（不發(fā)酵茶）、白茶（部分發(fā)酵茶）和黑茶（后發(fā)酵茶）。由于綠茶中含有很多的兒茶酚類物質(zhì)，隨著發(fā)酵程度的增加這些物質(zhì)在發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)化成茶紅素和茶黃素類物質(zhì)[14],結(jié)合7種農(nóng)藥在不同種類茶葉中的不同基質(zhì)效應(yīng)，可以推測，隨著不同的發(fā)酵過程中兒茶素類物質(zhì)及其氧化物的變化，茶葉的基質(zhì)效應(yīng)也會(huì)產(chǎn)生一定的變化。

綜上所述，茶葉樣品基體復(fù)雜，含有大量的生物堿、茶多酚、糖類、有機(jī)酸、類脂類、色素、蠟質(zhì)等大分子物質(zhì)，貴州省復(fù)雜的地理?xiàng)l件使得不同產(chǎn)地的茶葉在經(jīng)緯度和海拔高度、日照強(qiáng)度和氣候條件等自然環(huán)境均不相同，這可能會(huì)影響茶葉中各組成成分的差異，進(jìn)而導(dǎo)致不同地域的茶葉對(duì)同一農(nóng)藥產(chǎn)生不同的基質(zhì)效應(yīng)。

不同農(nóng)藥在不同的茶葉中所表現(xiàn)的基質(zhì)效應(yīng)及強(qiáng)度是不同的，因此在日常檢驗(yàn)檢測工作中，應(yīng)當(dāng)根據(jù)具體的茶葉種類、產(chǎn)地，并結(jié)合不同的測定濃度、待測農(nóng)藥種類合理地選擇茶葉基質(zhì)，避免造成較大的檢測誤差。