擬輪枝鐮孢與玉米籽粒互作的差異基因篩選及代謝通路分析

渠清，劉寧，鄒金鵬，張雅璇，賈慧，孫蔓莉，曹志艷，董金皋

擬輪枝鐮孢與玉米籽粒互作的差異基因篩選及代謝通路分析

1河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071001；2河北省植物生理與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華北作物改良與調(diào)控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071001；3河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河北保定 071001

【目的】擬輪枝鐮孢（）引起的玉米穗腐病是我國(guó)玉米產(chǎn)區(qū)發(fā)生嚴(yán)重的病害之一，論文旨在了解病原菌與玉米籽?；プ鬟^(guò)程中的基因表達(dá)差異，為揭示病原菌的致病機(jī)制和玉米抗病機(jī)制提供依據(jù)。【方法】對(duì)擬輪枝鐮孢侵染玉米籽粒0、4、12和72 h的樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，之后采用生物信息學(xué)分析，分別以玉米和擬輪枝鐮孢基因組為參考，以|log2FC|≥1，-adjust＜0.05為閾值篩選互作過(guò)程中玉米和擬輪枝鐮孢的差異表達(dá)基因，利用GO和KEGG對(duì)其進(jìn)行功能注釋及富集分析。Goatools軟件分析植物-病原互作、MAPK途徑和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)差異基因的表達(dá)變化，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）方法對(duì)測(cè)序差異基因進(jìn)行驗(yàn)證。【結(jié)果】在互作4、12和72 h后擬輪枝鐮孢分別有140、400和1 945個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，有9、302和1 784個(gè)基因下調(diào)表達(dá)；玉米分別有293、692 和1 426個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，320、482和153個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。GO和KEGG富集分析顯示，侵染早期擬輪枝鐮孢在細(xì)胞間隙生長(zhǎng)，差異基因主要富集在RNA生物合成、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)成分、脂肪酸生物合成、蛋白質(zhì)代謝、碳水化合物代謝、生物過(guò)程和代謝過(guò)程等通路中。擬輪枝鐮孢早期侵染觸發(fā)了玉米活性氧（ROS）爆發(fā)，差異基因主要富集在對(duì)活性氧、過(guò)氧化氫的反應(yīng)，幾丁質(zhì)酶、單加氧酶活性，木質(zhì)素代謝過(guò)程等相關(guān)通路中。侵染后期擬輪枝鐮孢繼續(xù)在籽粒中定殖及擴(kuò)展，差異基因主要富集在碳水化合物和細(xì)胞壁多糖分解代謝過(guò)程、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化還原酶活性等功能通路中。玉米主要通過(guò)苯丙素、木質(zhì)素、類黃酮生物合成，MAPK 信號(hào)通路、植物-病原互作和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑差異基因大量表達(dá)響應(yīng)病原菌侵染。隨機(jī)選取6個(gè)玉米和6個(gè)擬輪枝鐮孢的差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR分析，基因表達(dá)規(guī)律與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致，證實(shí)了RNA-seq的準(zhǔn)確性?！窘Y(jié)論】在病原菌侵染早期，擬輪枝鐮孢在細(xì)胞間隙生長(zhǎng)，觸發(fā)玉米活性氧爆發(fā)，相關(guān)通路差異基因表達(dá)；侵染中后期，病原菌以淀粉為營(yíng)養(yǎng)素，繼續(xù)在籽粒中定殖及擴(kuò)展，玉米通過(guò)苯丙素、木質(zhì)素及幾丁質(zhì)酶的生物合成等方面的相關(guān)基因表達(dá)響應(yīng)擬輪枝鐮孢侵染，同時(shí)植物-病原互作、MAPK途徑和激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑參與抗擬輪枝鐮孢侵染。

擬輪枝鐮孢；玉米穗腐?。晦D(zhuǎn)錄組；植物-病原互作；基因表達(dá); 差異表達(dá)基因

0 引言

【研究意義】玉米穗腐病是由包括鐮孢菌和霉菌在內(nèi)的多種病原菌侵染玉米果穗引起的重要病害，在我國(guó)多個(gè)玉米產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生。其中擬輪枝鐮孢（）是玉米穗腐病的主要致病菌之一，在我國(guó)多個(gè)地區(qū)玉米穗腐病致病真菌中所占比例最大[1]。該病害除了降低玉米產(chǎn)量外，擬輪枝鐮孢還產(chǎn)生有毒的次級(jí)代謝產(chǎn)物——伏馬毒素，嚴(yán)重影響玉米質(zhì)量。伏馬毒素可分為伏馬毒素B1（FB1）、B2（FB2）和B3（FB3）3種，其中FB1含量最多且毒性最強(qiáng)[2-3]，其不僅可毒害動(dòng)物，造成馬白頭軟化癥、豬肺水腫和大鼠肝癌，還與人類癌癥有關(guān)[4-5]，嚴(yán)重影響食品及飼料安全。目前對(duì)玉米穗腐病的防治主要以種植抗病品種為主，但玉米與病原菌互作過(guò)程中植物抗病應(yīng)答機(jī)制和病原菌的致病機(jī)制仍不清楚，有待于進(jìn)一步深入解析其相互作用機(jī)理，為抗病分子育種提供參考?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物與病原真菌互作過(guò)程中，真菌可通過(guò)侵染墊、附著胞、吸器等侵染結(jié)構(gòu)幫助其成功入侵寄主，造成植物感染[6]。鐮孢菌沒(méi)有穿透宿主細(xì)胞的特殊結(jié)構(gòu)，如附著胞或吸器，但其孢子可通過(guò)植物的自然孔口或者傷口進(jìn)入宿主細(xì)胞完成侵入[7]。此外，還可產(chǎn)生一系列細(xì)胞壁降解酶，不僅能夠消化植物細(xì)胞壁的纖維素、木聚糖和果膠的聚合物并以此作為真菌的重要營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，還能通過(guò)降解植物蠟質(zhì)層、角質(zhì)層和細(xì)胞壁而導(dǎo)致宿主發(fā)病[8]，從而完成入侵和病原體傳播。在互作過(guò)程中，真菌還會(huì)產(chǎn)生毒素。真菌釋放堿性蛋白導(dǎo)致酶活性發(fā)生變化，受到伏馬毒素FB1污染的谷物種子表現(xiàn)出胚乳降解、淀粉顆粒周圍缺少蛋白質(zhì)基質(zhì)的性狀，這種毒素通過(guò)積累有毒鞘脂中間產(chǎn)物破壞植物和動(dòng)物的質(zhì)膜[9]。這些中間產(chǎn)物破壞了鞘脂的從頭合成，抑制了神經(jīng)酰胺合成酶[10]，因此，破壞了細(xì)胞信號(hào)和功能，改變了細(xì)胞凋亡和復(fù)制。植物擁有復(fù)雜的免疫系統(tǒng)，可以保護(hù)其免受病原菌的侵害，包括病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP）觸發(fā)免疫（pattern-triggered immunity，PTI）和效應(yīng)器觸發(fā)免疫（effector-triggered immunity，ETI）[11]。PTI和ETI觸發(fā)信號(hào)級(jí)聯(lián)，包括細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的改變、活性氧（reactive oxygen species，ROS）及次級(jí)信號(hào)分子的產(chǎn)生等。鈣結(jié)合蛋白可以檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的增加，作為第二信使調(diào)控下游基因表達(dá)，在植物抗病中發(fā)揮重要作用。同時(shí)ROS生成速率的快速增加也是植物應(yīng)對(duì)病原體侵染的基本反應(yīng)，稱為“氧化爆發(fā)”[12]。ROS能夠激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級(jí)聯(lián)途徑，上調(diào)特定應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)[13]。植物激素在調(diào)節(jié)植物對(duì)各種生物和非生物脅迫的反應(yīng)所涉及的發(fā)育過(guò)程和信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中同樣發(fā)揮著重要作用[14]。大量研究顯示，植物產(chǎn)生的乙烯（ET）、水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）在介導(dǎo)植物抗病反應(yīng)中起主要作用。當(dāng)病原菌侵染時(shí)，這些植物激素的合成相關(guān)基因表達(dá)水平增加，又進(jìn)一步誘導(dǎo)和加強(qiáng)了植物免疫反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同病害的抵抗[15-17]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本課題組前期對(duì)我國(guó)多個(gè)省份玉米果穗的穗腐病病原菌進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)擬輪枝鐮孢的分離頻率最高，同時(shí)通過(guò)熒光標(biāo)記菌株研究多種鐮孢菌侵染玉米果穗的效能，發(fā)現(xiàn)擬輪枝鐮孢在侵染玉米果穗中表現(xiàn)出競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)[18]。目前對(duì)擬輪枝鐮孢侵染玉米籽粒過(guò)程中，不同抗/感玉米品種響應(yīng)病原菌侵染相關(guān)過(guò)程的轉(zhuǎn)錄分析較多[19-20]，但對(duì)宿主與病原菌雙方互作過(guò)程的進(jìn)程開展系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄水平研究較少?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】分別以單獨(dú)培養(yǎng)的擬輪枝鐮孢和未接菌的玉米籽粒為對(duì)照，利用高通量轉(zhuǎn)錄測(cè)序技術(shù)對(duì)擬輪枝鐮孢侵染玉米籽粒4、12和72 h的樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析互作過(guò)程中玉米和擬輪枝鐮孢雙方的差異基因表達(dá)情況，明確擬輪枝鐮孢與玉米互作的生物學(xué)過(guò)程，以期為揭示寄主和病原菌互作及穗腐病抗性機(jī)理提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2020—2022年在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)完成。

1.1 供試材料

供試植物：玉米品種為自交系B73，種子由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)科學(xué)院劉新芳老師饋贈(zèng)。玉米B73種植于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)東校區(qū)溫室，行間距為60 cm，株間距為30 cm，正常管理。

供試病原菌：供試病原菌為擬輪枝鐮孢Fv7600，菌株由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)顧沁老師饋贈(zèng)，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素與植物分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。接種于PDA（potato dextrose agar）培養(yǎng)基，于25℃黑暗培養(yǎng)。

1.2 病原菌接種

將PDA平板上活化后的擬輪枝鐮孢用直徑為6 mm的打孔器打取菌盤，接種到羧甲基纖維素鈉（CMC）液體培養(yǎng)基中25℃黑暗振蕩培養(yǎng)5—7 d后，三層無(wú)菌紗布過(guò)濾，無(wú)菌水稀釋成1×106個(gè)/mL的孢子懸浮液備用。待自交系玉米B73人工授粉21 d后，用1 mL注射器針頭蘸取擬輪枝鐮孢孢子懸浮液針刺玉米籽粒接種[21]。分別于接種后0 h（mock）、4 h（Fv4）、12 h（Fv12）和72 h（Fv72）后取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)接種3個(gè)果穗作為生物學(xué)重復(fù)。同時(shí)使用PDA培養(yǎng)基上25℃黑暗培養(yǎng)72 h的擬輪枝鐮孢（Fv）作為真菌的對(duì)照。所有樣品取樣后立即在液氮中冷凍，-80℃下儲(chǔ)存，以提取RNA。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

1.3.1 RNA提取、文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是基于Illumina Novaseq 6000 測(cè)序平臺(tái)，對(duì)真菌菌絲、玉米籽粒和互作時(shí)期的玉米籽粒樣品轉(zhuǎn)錄出來(lái)的所有mRNA進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序試驗(yàn)采用Illumina TruseqTMRNA sample prep Kit方法進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，具體如下：使用Trizol法分別提取真菌菌絲、玉米籽粒和互作玉米樣品總RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳分析所提取的總RNA的完整性及是否存在DNA污染，使用NanoDrop2000（Thermo Fisher Scientific）和Agilent 2100 Nano（Fisher Scientific）儀器分析總RNA的質(zhì)量和完整性。構(gòu)建了15個(gè)RNA文庫(kù)（分別命名為Mock、Fv、Fv4、Fv12和Fv72，每處理3個(gè)重復(fù)）。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序由上海美吉生物處理完成。使用Novaseq 6000測(cè)序平臺(tái)獲得原始數(shù)據(jù)，通過(guò)對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，得到高質(zhì)量的數(shù)據(jù)并對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)以及質(zhì)量評(píng)估，質(zhì)控后得到 clean reads。將質(zhì)控后的clean reads分別與玉米和擬輪枝鐮孢的參考基因組比對(duì)。使用StringTie軟件對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行拼接組合，對(duì)拼接之后的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。數(shù)據(jù)已上傳NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，SRA登錄號(hào)為PRJNA735336。

1.3.2 差異表達(dá)基因（DEG）的篩選 利用RSEM表達(dá)定量軟件分別對(duì)基因和轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，定量指標(biāo)為TPM，即以轉(zhuǎn)錄本的條數(shù)為計(jì)算單位，使用轉(zhuǎn)錄本的條數(shù)代替拼接片段數(shù)。使用DESeq2軟件以mRNA的-adjust＜0.05&|log2FC|≥1為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)讀取clean reads進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，獲得差異表達(dá)的mRNA（DEG）。以歸一化處理后的log2FC的值繪制熱圖。

1.3.3 差異表達(dá)基因GO和KEGG富集分析 采用Goatools軟件，F(xiàn)isher 精確檢驗(yàn)的方法對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行基因本體論GO富集分析以及京都基因和基因組百科全書KEGG富集分析，從而獲得差異基因主要GO功能和KEGG富集通路。當(dāng)經(jīng)過(guò)校正的值（value）＜0.05時(shí)，認(rèn)為此GO功能和KEGG功能存在顯著富集。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）驗(yàn)證

隨機(jī)選取6個(gè)玉米的差異表達(dá)基因和6個(gè)擬輪枝鐮孢的差異表達(dá)基因，對(duì)其進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。使用RNA提取試劑盒提取總RNA（北京聚合美生物科技有限公司），采用cDNA PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser第一鏈合成試劑盒（寶生物工程（大連）有限公司）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將其作為模板，使用Super EvaGreen qPCR Master Mix 試劑盒（US EVERBRIGHT INC 公司）進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，玉米使用作為內(nèi)參基因，擬輪枝鐮孢使用作為內(nèi)參基因，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。20 μL qPCR反應(yīng)體系：SYBR Mix 10 μL、正反向引物各0.4 μL、cDNA模板1 μL、ROX 1 μL和ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性 2 min；95℃變性5 s，60℃退火30 s，45個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用檢驗(yàn)法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果評(píng)估

對(duì)接種擬輪枝鐮孢后0、4、12和72 h的玉米籽粒樣品和培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d的擬輪枝鐮孢進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。本研究構(gòu)建了15個(gè)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)，其中包括5個(gè)樣本，每個(gè)樣本有3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。15個(gè)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的測(cè)序結(jié)果顯示，在去除reads中的接頭序列、低質(zhì)量片段和N率（N表示不確定堿基信息）較高序列及長(zhǎng)度過(guò)短序列后，總共獲得1 169 261 200 clean reads。接菌后0 h的樣品（Mock）分別獲得了51 110 882、50 311 356和44 387 490 clean reads。真菌菌絲樣品（Fv）的3個(gè)重復(fù)數(shù)據(jù)顯示，分別獲得了45 922 668、49 966 126和40 694 544 clean reads。接菌后4 h的樣品（Fv4）獲得了101 474 514、95 247 160和83 492 592 clean reads。接菌后12 h的樣品（Fv12）獲得了102 019 788、106 427 588和106 395 294 clean reads。接菌后72 h的樣品（Fv72）獲得了107 478 816、103 103 634和81 228 748 clean reads（表2）。將各樣品的clean reads分別比對(duì)到玉米B73和擬輪枝鐮孢的基因組上，玉米中的比對(duì)率介于91.63%—95.46%。由于接菌時(shí)間較短，大部分為玉米籽粒的樣品，籽粒中擬輪枝鐮孢帶菌量和所占比例相對(duì)較少，雖然互作樣品的數(shù)據(jù)比對(duì)到真菌基因組的比對(duì)率較低，但真菌的對(duì)照比對(duì)到擬輪枝鐮孢基因組的比對(duì)率均在95%以上，所有文庫(kù)的Q30均在93.59%以上。因此，測(cè)序得到的數(shù)據(jù)是可靠的，并且可以用于后續(xù)的分析。

表1 本研究所用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR引物信息

表2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

-：未比對(duì) Not blast

2.2 互作過(guò)程中擬輪枝鐮孢和玉米籽粒中差異表達(dá)的基因

2.2.1 擬輪枝鐮孢中差異表達(dá)的基因 選擇TPM＞1作為基因表達(dá)的衡量標(biāo)準(zhǔn)，以PDA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)3 d的菌絲（Fv）為對(duì)照，接種擬輪枝鐮孢4 h（Fv4）、12 h（Fv12）和72 h（Fv72）的樣本計(jì)算基因表達(dá)情況，結(jié)果顯示（圖1-A），F(xiàn)v中有10 618個(gè)基因表達(dá)，F(xiàn)v4、Fv12和Fv72中分別有2 193、5 249和9 844個(gè)基因表達(dá)，各處理間共同表達(dá)的基因數(shù)為1 736。與Fv相比，F(xiàn)v4、Fv12和Fv72中分別有5、33和422個(gè)獨(dú)特表達(dá)的基因。為了鑒定參與擬輪枝鐮孢侵染玉米籽粒的相關(guān)基因，進(jìn)一步篩選了試驗(yàn)組和對(duì)照組之間差異表達(dá)的基因。共篩選出4 152個(gè)差異基因，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)共同差異表達(dá)的有42個(gè)基因，F(xiàn)v4和Fv12 共同差異表達(dá)的有6個(gè)基因，F(xiàn)v4和Fv72共同差異表達(dá)的有55個(gè)基因，F(xiàn)v12和Fv72 共同差異表達(dá)的有283個(gè)基因（圖1-B）。同F(xiàn)v相比，F(xiàn)v4、Fv12和Fv72分別有140、400和1 945個(gè)差異基因上調(diào)表達(dá)，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)共同上調(diào)表達(dá)的有38個(gè)差異基因，F(xiàn)v4和Fv12共同上調(diào)表達(dá)的有4個(gè)差異基因，F(xiàn)v4和Fv72共同上調(diào)表達(dá)的有47個(gè)差異基因，F(xiàn)v12和Fv72共同上調(diào)表達(dá)的有151個(gè)差異基因（圖1-C）。Fv4、Fv12和Fv72分別有9、302和1 784個(gè)差異基因下調(diào)表達(dá)，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)共同下調(diào)表達(dá)的有4個(gè)差異基因，F(xiàn)v4和Fv12共同下調(diào)表達(dá)的有2個(gè)差異基因，F(xiàn)v12和Fv72共同下調(diào)表達(dá)的有94個(gè)差異基因（圖1-D）。結(jié)果顯示，與在培養(yǎng)基中單獨(dú)培養(yǎng)相比，擬輪枝鐮孢侵染玉米籽粒的早期差異表達(dá)基因較少，菌絲以營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的方式在玉米籽粒中生長(zhǎng)，但隨著時(shí)間延長(zhǎng)，基因表達(dá)出現(xiàn)顯著差異，不僅激活大量基因的表達(dá)，同時(shí)抑制了相當(dāng)數(shù)量的基因表達(dá)。

2.2.2 玉米中差異表達(dá)的基因 選擇TPM＞1作為基因表達(dá)的衡量標(biāo)準(zhǔn)，以接種無(wú)菌水（mock）為對(duì)照，接種擬輪枝鐮孢4 h（Fv4）、12 h（Fv12）、72 h（Fv72）的樣本計(jì)算基因表達(dá)情況，結(jié)果顯示（圖2-A），對(duì)照處理中有19 706個(gè)基因表達(dá)，F(xiàn)v4、Fv12和Fv72玉米籽粒中分別有20 173、20 657和20 169個(gè)基因表達(dá)，各處理間共同表達(dá)的基因數(shù)為18 743。與mock相比，F(xiàn)v4、Fv12和Fv72玉米籽粒中分別有160、484和535個(gè)獨(dú)特表達(dá)的基因。為了鑒定玉米籽粒抵御擬輪枝鐮孢侵染的相關(guān)基因，進(jìn)一步篩選了試驗(yàn)組和對(duì)照組之間差異表達(dá)的基因。共篩選出2 778個(gè)差異基因，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)共同差異表達(dá)的有64個(gè)基因，F(xiàn)v4和Fv12共同差異表達(dá)的有226個(gè)基因，F(xiàn)v4和Fv72共同差異表達(dá)的有69個(gè)基因，F(xiàn)v12和Fv72共同差異表達(dá)的有165個(gè)基因（圖2-B）。同未接菌的玉米籽粒相比，F(xiàn)v4、Fv12和Fv72分別有293、692和 1 426個(gè)差異基因上調(diào)表達(dá)，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)共同上調(diào)表達(dá)的有39個(gè)差異基因，F(xiàn)v4和Fv12共同上調(diào)表達(dá)的有73個(gè)差異基因，F(xiàn)v4和Fv72共同上調(diào)表達(dá)的有21個(gè)差異基因，F(xiàn)v12和Fv72共同上調(diào)表達(dá)的有144個(gè)差異基因（圖2-C）。Fv4、Fv12和Fv72分別有320、482和153個(gè)差異基因下調(diào)表達(dá)，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)共同下調(diào)表達(dá)的有10個(gè)差異基因，F(xiàn)v4和Fv12共同下調(diào)表達(dá)的有111個(gè)差異基因，F(xiàn)v4和Fv72共同下調(diào)表達(dá)的有29個(gè)差異基因，F(xiàn)v12和Fv72共同下調(diào)表達(dá)的有11個(gè)差異基因（圖2-D）。結(jié)果顯示，擬輪枝鐮孢侵染后玉米籽粒更多的基因顯示表達(dá)上調(diào)的趨勢(shì)，且隨著侵染時(shí)間延長(zhǎng)上調(diào)表達(dá)基因的個(gè)數(shù)迅速增加。

A：樣本間基因表達(dá)的維恩圖Venn of gene expression among samples；B：接種4、12和72 h擬輪枝鐮孢中差異基因的維恩圖Venn of DEGs in F. verticillioides after inoculation at 4, 12 and 72 h；C：接種4、12和72 h后擬輪枝鐮孢中上調(diào)表達(dá)差異基因的維恩圖Venn of up-regulated DEGs in F. verticillioides after inoculation at 4, 12 and 72 h；D：接種4、12 和72 h后擬輪枝鐮孢中下調(diào)表達(dá)差異基因的維恩圖Venn of down-regulated DEGs in F. verticillioides after inoculation at 4, 12 and 72 h

A：樣本間基因表達(dá)的維恩圖Venn of gene expression among samples；B：接種4、12和72 h玉米中差異基因的維恩圖Venn of DEGs in maize after inoculation with F. verticillioides at 4, 12 and 72 h；C：接種4、12和72 h后玉米中上調(diào)表達(dá)差異基因的維恩圖Venn of up-regulated DEGs in maize after inoculation with F. verticillioides at 4, 12 and 72 h；D：接種4、12和72 h后玉米中下調(diào)表達(dá)差異基因的維恩圖Venn of down-regulated DEGs in maize after inoculation with F. verticillioides at 4, 12 and 72 h

2.3 差異表達(dá)基因的代謝通路分析

2.3.1 擬輪枝鐮孢的差異表達(dá)基因及富集分析 對(duì)互作過(guò)程中擬輪枝鐮孢的差異基因進(jìn)行了GO富集分析（表3）。侵染4 h時(shí)擬輪枝鐮孢差異基因較少，主要富集在RNA生物合成、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)成分等功能通路中。侵染12 h后擬輪枝鐮孢差異基因主要富集在肽生物合成和代謝過(guò)程、蛋白質(zhì)代謝、碳水化合物代謝、生物過(guò)程和代謝過(guò)程等功能通路中。侵染72 h后擬輪枝鐮孢的差異基因主要富集在碳水化合物和細(xì)胞壁多糖分解代謝過(guò)程、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化還原酶活性等功能通路中。

在KEGG富集分析中，侵染4 h擬輪枝鐮孢的差異基因主要富集在脂肪酸生物合成通路中（圖3-A），侵染12 h擬輪枝鐮孢的差異基因主要富集在核糖體途徑中（圖3-B），侵染72 h擬輪枝鐮孢的差異基因大量增加，主要富集在類固醇生物合成、淀粉和蔗糖代謝、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化及精氨酸、脯氨酸、色氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和苯丙氨酸等氨基酸的代謝通路中（圖3-C）。

2.3.2 玉米的差異表達(dá)基因及富集分析 對(duì)侵染后不同時(shí)間點(diǎn)的玉米差異基因進(jìn)行了GO富集分析（表4）。接菌4 h后玉米的差異基因主要富集在對(duì)活性氧、過(guò)氧化氫的反應(yīng)、幾丁質(zhì)酶、單加氧酶活性等相關(guān)通路中。接菌12 h后玉米的差異基因主要富集在對(duì)過(guò)氧化氫、非生物刺激的反應(yīng)，木質(zhì)素代謝過(guò)程及幾丁質(zhì)酶活性等相關(guān)通路中。病原菌侵染72 h后，差異基因主要富集在苯丙素、木質(zhì)素、脂質(zhì)生物合成過(guò)程，水楊酸、茉莉酸、活性氧代謝過(guò)程，幾丁質(zhì)酶和苯丙氨酸解氨酶活性等相關(guān)通路中。

KEGG富集分析結(jié)果顯示，接菌后4 h玉米的差異基因主要富集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、苯丙素生物合成、MAPK信號(hào)通路中（圖4-A）。接菌后12 h玉米的差異基因主要富集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工、苯丙素生物合成、二苯醚類、二芳庚烷類和姜辣素生物合成、淀粉與蔗糖代謝等通路中（圖4-B）。接菌后72 h玉米的差異基因主要富集在苯丙素、二苯醚類、二芳庚烷類和姜辣素生物合成、類黃酮生物合成、MAPK 信號(hào)通路、植物-病原互作和植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑中（圖4-C）。

2.4 玉米響應(yīng)擬輪枝鐮孢侵染的抗病通路

進(jìn)一步分析玉米響應(yīng)擬輪枝鐮孢侵染中的抗病通路，包括植物-病原互作、MAPK途徑和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)3條途徑。植物-病原互作通路中，玉米響應(yīng)擬輪枝鐮孢侵染的差異表達(dá)基因分別在接菌后不同時(shí)間點(diǎn)響應(yīng)病原菌侵染（圖5）。聚類分析將該途徑的差異基因分為兩種類型，首先編碼玉米CaMCML的基因、、在接菌早期就出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，這可能是由細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度發(fā)生快速變化引起的；而其他基因主要是在病原菌侵染12或72 h時(shí)表達(dá)開始上調(diào)，但均為72 h表達(dá)量最高。例如呼吸爆發(fā)氧化酶Rboh（）在接菌12 h 就開始表達(dá)上調(diào)，72 h表達(dá)水平最高；WRKY33 轉(zhuǎn)錄因子（、）在接菌12 h后就開始上調(diào)表達(dá)，而其他WRKY33 轉(zhuǎn)錄因子（、、）在72 h表達(dá)迅速達(dá)到最大。同樣在侵染后期表達(dá)高的基因還有鈣依賴蛋白質(zhì)激酶CDPK的基因（、）、誘導(dǎo)植物系統(tǒng)性抗性的基因PR1（、、）。

MAPK級(jí)聯(lián)是受體/傳感器下游高度保守的信號(hào)模塊，可將細(xì)胞外刺激轉(zhuǎn)化為真核生物的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)。植物MAPK信號(hào)通路在植物抵御病原體侵染的信號(hào)傳遞中起著關(guān)鍵作用。玉米抗擬輪枝鐮孢侵染過(guò)程中，MAPK信號(hào)通路差異基因熱圖分析發(fā)現(xiàn)除了個(gè)別基因（）下調(diào)外，其他基因均表現(xiàn)為在72 h才出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)（圖6），例如MAPK信號(hào)途徑中維持活性氧穩(wěn)態(tài)的OXI1基因（）和MPK3/6基因（），在接菌后72 h均上調(diào)表達(dá)。

表3 擬輪枝鐮孢侵染玉米不同時(shí)間點(diǎn)差異表達(dá)基因的 GO富集分析

BP：生物學(xué)進(jìn)程Biological process； MF：分子功能Molecular function； CC：細(xì)胞組分Cellular component。表4同The same as Table 4

植物應(yīng)對(duì)各種生物和非生物脅迫中，植物激素發(fā)揮著重要作用。轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示，玉米受到擬輪枝鐮孢侵染后不同的激素信號(hào)響應(yīng)了病原菌的侵染，而且各通路中不同基因存在前后差異（圖7）。例如同樣是茉莉酸（JA）信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因JAZ（），在病菌侵染12 h后就檢測(cè)到持續(xù)的顯著上調(diào)，而在接菌后72 h JAZ的另外3個(gè)基因（、、）才發(fā)生表達(dá)上調(diào)。水楊酸（SA）信號(hào)通路中參與抗病的PR1基因（、、）在接菌后72 h上調(diào)表達(dá)。同樣在后期72 h發(fā)生上調(diào)的還包括乙烯通路中EIN3基因（）和ERF1/2基因（、）。這表明茉莉酸信號(hào)通路的觸發(fā)較早，而水楊酸信號(hào)通路和乙烯通路的觸發(fā)是發(fā)生在接菌后72 h。其他受影響的信號(hào)通路基因還包括油菜素內(nèi)酯通路和脫落酸通路相關(guān)基因，也參與了植物-病原互作過(guò)程。

圖4 接種擬輪枝鐮孢不同時(shí)間點(diǎn)后玉米中差異表達(dá)基因KEGG代謝通路富集分析

表4 玉米響應(yīng)擬輪枝鐮孢侵染不同時(shí)間點(diǎn)差異表達(dá)基因的GO富集分類

圖5 玉米中植物-抗病通路差異表達(dá)基因

圖6 玉米中MAPK信號(hào)通路差異表達(dá)基因

圖7 玉米中植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑差異表達(dá)基因

2.5 差異基因的qRT-PCR驗(yàn)證

利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)隨機(jī)選取的6個(gè)玉米的差異表達(dá)基因和6個(gè)擬輪枝鐮孢的差異表達(dá)基因在接種擬輪枝鐮孢72 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)驗(yàn)證（圖8）。結(jié)果顯示，玉米響應(yīng)病原菌侵染的植物-病原互作途徑中鈣依賴蛋白激酶CDPK基因（、），茉莉酸介導(dǎo)的信號(hào)通路中JAZ基因（），植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中GH3 基因（、）和MAPK信號(hào)途徑中WRKY 33轉(zhuǎn)錄因子（）在接種擬輪枝鐮孢72 h后上調(diào)表達(dá)。在擬輪枝鐮孢中，參與脂質(zhì)生物合成的，參與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝的羥基類固醇脫氫酶基因（），類固醇生物合成途徑中的和，幾丁質(zhì)合酶基因（）和淀粉與蔗糖代謝途徑中的在接種擬輪枝鐮孢72 h后上調(diào)表達(dá)。以上12個(gè)差異基因的表達(dá)趨勢(shì)和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致，表明RNA-seq分析結(jié)果可靠。

圖8 qRT-PCR驗(yàn)證擬輪枝鐮孢侵染玉米籽粒72 h后基因表達(dá)情況

3 討論

由擬輪枝鐮孢引起的玉米穗腐病嚴(yán)重影響玉米產(chǎn)量及品質(zhì)，擬輪枝鐮孢產(chǎn)生的伏馬毒素對(duì)人、畜有毒害作用。由于化學(xué)農(nóng)藥防治穗腐病效果不佳，玉米抗性種質(zhì)資源相對(duì)匱乏，因此明確玉米-擬輪枝鐮孢互作中雙方的調(diào)控過(guò)程變得更加迫切。唐科志等[22]利用轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，紅橘被鏈格孢菌橘致病型（tangerine pathotype）侵染后，基礎(chǔ)代謝遭到嚴(yán)重破壞，病程相關(guān)蛋白（PR）上調(diào)表達(dá)響應(yīng)病原菌侵染。乙烯防御信號(hào)通路差異基因顯著富集應(yīng)對(duì)病原菌侵染。滕彩玲等[23]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，揭示了馬蜂柑響應(yīng)黃龍病菌（‘Liberibacter asiaticus’）侵染不同時(shí)期的生物學(xué)過(guò)程。史毅等[24]利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析匍匐翦股穎對(duì)立枯絲核菌（）的抗性，明確了病原菌侵染過(guò)程中寄主抑制病原菌擴(kuò)散的抗病機(jī)制。

3.1 擬輪枝鐮孢侵染玉米籽粒的主要機(jī)制

在玉米-擬輪枝鐮孢互作過(guò)程中，對(duì)不同玉米抗/感品種響應(yīng)病原菌侵染的轉(zhuǎn)錄分析較多[19-20]，本文利用RNA高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)擬輪枝鐮孢侵染玉米不同時(shí)期進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析玉米和擬輪枝鐮孢雙方差異表達(dá)基因的功能。首先發(fā)現(xiàn)，侵染初期擬輪枝鐮孢只有少量差異基因主要富集在核糖體生物合成、細(xì)胞壁及脂肪酸生物合成途徑中。脂肪酸可以通過(guò)調(diào)控菌絲的生長(zhǎng)和無(wú)性孢子的產(chǎn)生來(lái)調(diào)控真菌的生長(zhǎng)和發(fā)育[25-27]。這表明與在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌絲相比，剛進(jìn)入植物中的擬輪枝鐮孢生長(zhǎng)狀態(tài)與其相似，接菌后4 h仍在細(xì)胞間隙生長(zhǎng)，還未侵入植物細(xì)胞內(nèi)。但此時(shí)玉米的差異表達(dá)基因富集在活性氧、過(guò)氧化氫的反應(yīng)等方面，表明擬輪枝鐮孢在細(xì)胞間隙的生長(zhǎng)已經(jīng)觸發(fā)了活性氧爆發(fā)。在植物免疫系統(tǒng)中，活性氧的產(chǎn)生是植物早期抗病反應(yīng)之一，起著至關(guān)重要的作用，不僅直接降低微生物的生存能力，還產(chǎn)生觸發(fā)其他免疫反應(yīng)的信號(hào)[28-30]。而且通過(guò)對(duì)植物-病原互作通路分析發(fā)現(xiàn)，CaMCML的基因、、在接菌后4 h上調(diào)表達(dá)，表明這種識(shí)別及反應(yīng)是由細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度發(fā)生快速變化引起的。

在接菌12 h后擬輪枝鐮孢開始出現(xiàn)大量的差異表達(dá)基因，富集在蛋白質(zhì)和碳水化合物代謝、木聚糖酶活性、幾丁質(zhì)結(jié)合相關(guān)通路，表明這段時(shí)間病菌生長(zhǎng)旺盛，同時(shí)病菌產(chǎn)生降解植物細(xì)胞壁半纖維素結(jié)構(gòu)的水解酶，從而破壞植物細(xì)胞。此時(shí)真菌侵染已經(jīng)開始在玉米籽粒的細(xì)胞中定殖及生長(zhǎng)[31]，而作為觸發(fā)宿主PTI的細(xì)胞壁組分幾丁質(zhì)合成也增加。此時(shí)玉米的差異表達(dá)基因進(jìn)一步集中在苯丙素生物合成、木質(zhì)素和幾丁質(zhì)酶通路中，說(shuō)明植物感知到真菌的侵染后通過(guò)木質(zhì)化，形成病原菌入侵的第一道屏障，生物合成苯丙素等植物抗毒素。同時(shí)通過(guò)合成幾丁質(zhì)酶降解真菌的細(xì)胞壁幾丁質(zhì)成分，破壞擬輪枝鐮孢細(xì)胞壁的同時(shí)產(chǎn)生的低聚物誘發(fā)了玉米PTI，因此在后續(xù)72 h，玉米中包括植物-病原互作、MAPK途徑和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在內(nèi)的多種途徑基因均表現(xiàn)為顯著上調(diào)。而接菌72 h后，擬輪枝鐮孢的差異基因主要富集在類固醇生物合成，淀粉和蔗糖代謝途徑中，碳水化合物和細(xì)胞壁多糖分解代謝過(guò)程，表明此時(shí)病菌開始大量利用植物細(xì)胞中的蔗糖和淀粉作為繁殖及進(jìn)一步侵染的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。此時(shí)，玉米中與苯丙素生物合成和代謝相關(guān)的基因上調(diào)。苯丙素可在植物中通過(guò)促進(jìn)木質(zhì)素沉積和類黃酮類植物抗毒素合成，對(duì)病原體感染作出反應(yīng)[32-34]。

3.2 不同代謝通路介導(dǎo)的植物防御反應(yīng)

在互作72 h時(shí)，玉米中包括植物-病原互作、MAPK途徑和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在內(nèi)的抗病過(guò)程中大量差異基因較侵染前期相比顯著上調(diào)。MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括植物防御激素的生物合成、信號(hào)傳遞、活性氧生成、氣孔關(guān)閉、防御基因激活、植保素生物合成、細(xì)胞壁強(qiáng)化和超敏反應(yīng)（HR）細(xì)胞死亡[35]。與其他植物激素在抗病中的報(bào)道一樣，茉莉酸、水楊酸、乙烯等不同的激素信號(hào)通路也參與了植物與病原菌的互作，例如多個(gè)茉莉酸途徑關(guān)鍵基因JAZ、乙烯通路的EIN3和ERF1/2 基因。筆者發(fā)現(xiàn)在植物-病原互作途徑中，等多個(gè)及上調(diào)表達(dá)，表明它們參與了玉米的抗病。報(bào)道顯示，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物抗病中發(fā)揮重要作用，而且可以調(diào)節(jié)PR1等編碼病程相關(guān)蛋白基因的表達(dá)以及茉莉酸、水楊酸等植物激素信號(hào)途徑[36-37]。擬南芥中，WRKY33基因缺失突變體對(duì)灰葡萄孢（）和鏈格孢的敏感性增強(qiáng)，同時(shí)導(dǎo)致水楊酸水平升高而茉莉酸水平下調(diào)[38]。此外，BIRKENBIHL等[39]研究表明，WRKY33可直接靶向參與水楊酸、乙烯、茉莉酸等信號(hào)和鈣調(diào)素生物合成的基因。因此本研究中多個(gè)在接菌后持續(xù)上調(diào)可能在調(diào)節(jié)抗病相關(guān)過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。

4 結(jié)論

擬輪枝鐮孢先在玉米細(xì)胞間隙生長(zhǎng)，后侵入細(xì)胞完成定殖，并利用宿主的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)一步擴(kuò)展。而玉米早期ROS爆發(fā)，后續(xù)通過(guò)幾丁質(zhì)酶參與的PTI、木質(zhì)化、抗毒素合成抵抗病菌侵入，最終MAPK、植物激素等多種抗病相關(guān)通路基因均被激活?；プ麟p方差異基因的挖掘?yàn)檫M(jìn)一步研究抗擬輪枝鐮孢玉米穗腐病提供了依據(jù)。

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Screening of Differential Genes and Analysis of Metabolic Pathways in the Interaction betweenand Maize Kernels

QU Qing1,2, LIU Ning2,3, ZOU JinPeng2,3, ZHANG YaXuan3, JIA Hui3, SUN ManLi2,3, CAO ZhiYan2,3, DONG JinGao2,3

1College of Life Sciences, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, Hebei;2Hebei Key Laboratory ofPlant Physiology and Molecular Pathology/State Key Laboratory of North China Crop Improvement and Regulation, Baoding 071001, Hebei;3College of Plant Protection, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, Hebei

【Objective】 Maize ear rot caused byis one of the most serious diseases in maize producing areas in China. The objective of this study is to understand the differences in gene expression during the plant-pathogen interaction at different stages, and to provide a basis for pathogenic mechanism of the pathogen infection and resistance mechanism of maize.【Method】Illumina platform was used to sequence the transcriptome of maize kernels infected withat0, 4, 12, and 72 h.The differentially expressed genes (DEGs) of maize andwere screened with |log2FC|≥1,-adjust＜0.05 as threshold and clean reads were compared with genome of maize and, separately. Functional annotation and enrichment analysis of DEGs were carried out by using GO and KEGG databases. Goatools software was used to analyze the expression changes of genes related to plant-pathogen interaction, MAPK signaling pathway and plant hormone signal transduction pathway. Sequencing results were verified by quantitative real-time PCR (qRT-PCR).【Result】A total of 140, 400 and 1 945 DEGs were up-regulated and 9, 302, and 1 784 DEGs were down-regulated inafter 4, 12 and 72 h interaction, respectively. A total of 293, 692, and 1 426 DEGs were up-regulated and 320, 482, and 153 DEGs were down-regulated in maize after 4, 12 and 72 h interaction, respectively. GO and KEGG enrichment analysis of DEGs showed thatgrew in intercellular space at the early stage of pathogen infection. The DEGs were enriched in RNA biosynthesis, cell wall structural component, fatty acid biosynthesis, protein metabolism, carbohydrate metabolism, biological process, and metabolic process. reactive oxygen species (ROS) was triggered in maize at the early stage of infection. The DEGs were enriched in response to ROS, hydrogen peroxide, chitinase activity, monooxygenase activity, lignin metabolism. At the later stage of infection,colonized and expanded in maize, and the DEGs were enriched in carbohydrate and cell wall polysaccharide catabolic process, transmembrane transport and oxidoreductase activity. Maize responded to pathogen infection through phenylpropanoid, lignin, flavonoid biosynthesis, MAPK signaling pathway, plant-pathogen interaction and plant hormone signal transduction. Six DEGs of maize and six DEGs ofwere randomly selected for qRT-PCR. The results were consistent with those of transcriptome sequencing, which confirmed the accuracy of RNA-seq.【Conclusion】at the early stage of infection,grew in the intercellular space, triggering ROS outbreak in maize and the expression of related pathway differential genes. At the middle and late stages of infection, the pathogen further colonized and expanded in maize with starch as nutrient. Maize responded to the infection ofthrough biosynthesis of phenylpropanoid, lignin and chitinase. Meanwhile, plant-pathogen interaction, MAPK signaling pathway, and plant hormone signal transduction were involved in the resistance to the infection of.

; maize ear rot; transcriptome; plant-pathogen interaction; gene expression; differentially expressed gene (DEG)

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.06.006

2022-10-27；

2022-11-23

國(guó)家玉米產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-02）、華北作物改良與調(diào)控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自主科研項(xiàng)目（NCCIR2020ZZ-12）、河北省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（20326502D）

渠清，E-mail：qu_qing@126.com。通信作者曹志艷，E-mail：caozhiyan@hebau.edu.cn。通信作者董金皋，E-mail：shmdjg@hebau.edu.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）