Optochin試驗(yàn)和膽汁溶解試驗(yàn)及MALDI-TOF MS在肺炎鏈球菌鑒定中的應(yīng)用價(jià)值*

金優(yōu)萍，徐麗慧，余道軍，張衛(wèi)英

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與信息工程學(xué)院，杭州310053；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，杭州310006)

肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)是臨床常見(jiàn)的機(jī)會(huì)性致病菌，可定植于鼻咽部，常可引起肺炎、中耳炎、化膿性腦膜炎、敗血癥等疾病[1]。WHO在2014年報(bào)告中指出肺炎是全球第四大死因[2]，對(duì)老年和兒童群體都構(gòu)成嚴(yán)重疾病負(fù)擔(dān)[3-5]。

肺炎鏈球菌感染的病原學(xué)診斷有賴(lài)于臨床微生物實(shí)驗(yàn)室分離鑒定肺炎鏈球菌。目前不同級(jí)別醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室鑒定肺炎鏈球菌所采用的方法不盡相同，部分三級(jí)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室都配備了基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)儀，而基層實(shí)驗(yàn)室還是以?shī)W普托辛(Optochin)試驗(yàn)為主并輔以膽汁溶解試驗(yàn)，且不同鑒定方法的檢測(cè)性能研究報(bào)道較少。分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展為確認(rèn)肺炎鏈球菌提供了更多可能。近年來(lái)有學(xué)者通過(guò)對(duì)鏈球菌屬細(xì)菌基因組高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)SPN0001檢測(cè)肺炎鏈球菌的敏感性和特異性達(dá)到100%，可作為肺炎鏈球菌分子鑒定的特異性標(biāo)記[6]。

因此，本研究以SPN0001檢測(cè)陽(yáng)性為肺炎鏈球菌判定標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)疑似肺炎鏈球菌的282株α溶血鏈球菌用上述3種鑒定方法進(jìn)行檢測(cè)分析，并綜合評(píng)價(jià)其應(yīng)用價(jià)值，探討適合臨床微生物實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的準(zhǔn)確快速鑒定肺炎鏈球菌的方法。

1 材料與方法

1.1菌株來(lái)源與復(fù)蘇 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科2015—2019年臨床分離疑似肺炎鏈球菌的α溶血鏈球菌共計(jì)282株(20%甘油肉湯中-70 ℃保存)。菌株復(fù)蘇時(shí)轉(zhuǎn)種至哥倫比亞血瓊脂平板(鄭州安圖生物公司)，置于35 ℃、5%CO2培養(yǎng)16～18 h。用肺炎鏈球菌ATCC 49619為質(zhì)控菌株。

1.2試劑與儀器 PCR試劑包括10×buffer、dNTPs混合液和Ex taq酶(TaKaRa公司)，SPN0001引物(上游5′-AATATCTGAAGATGCTCATTCTACAATT-3′，下游5′-ATAAGGTTTACCGTCAATAATACGCAG-3′)[6]由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司合成，100～2 000 bp DNA marker(上海生工生物公司)，Optochin藥敏紙片(含量5 μg，直徑6 mm，Oxoid公司)。凝膠成像儀、瓊脂糖凝膠電泳儀(Bio-Rad公司)，5%CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)，MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀(德國(guó)Bruker Daltonics公司)。

1.3分子生物學(xué)鑒定 282株α溶血鏈球菌分別以煮沸法(100 ℃ 10 min)提取核酸，行PCR檢測(cè)。擴(kuò)增體系共25 μL，包括無(wú)菌水18.4 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTPs混合液2 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，Taq酶0.1 μL，模板1 μL。擴(kuò)增參數(shù)：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)； 72 ℃ 10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物行15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀上觀察電泳結(jié)果。隨機(jī)分別選取肺炎鏈球菌特異性靶標(biāo)基因SPN0001檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性者5株及檢測(cè)結(jié)果陰性11株菌株，用細(xì)菌16S rRNA為靶標(biāo)基因的引物行PCR檢測(cè)[7]，PCR條件同SPN0001，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海鉑尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后變性在3730測(cè)序分析儀(美國(guó)ABI公司)上進(jìn)行Sanger雙脫氧終止測(cè)序法測(cè)序分析。用16S rRNA測(cè)序比對(duì)(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)結(jié)果對(duì)肺炎鏈球菌特異性標(biāo)記物SPN0001檢測(cè)的準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4Optochin試驗(yàn) 282株α溶血鏈球菌和質(zhì)控菌株復(fù)蘇后取單個(gè)菌落劃線(xiàn)法接種于血平板上，在35 ℃、5%CO2中培養(yǎng)18～24 h，用紙片法行Optochin試驗(yàn)。Optochin藥敏紙片抑菌圈≥14 mm判定為敏感(Opts)，抑菌圈<14 mm或抑菌圈中出現(xiàn)菌落者判定為耐藥(Optr)[8]。

1.5膽汁溶解試驗(yàn) 菌株復(fù)蘇后以平板法進(jìn)行膽汁溶解試驗(yàn)。取實(shí)驗(yàn)室自配10%去氧膽酸鈉溶液5 μL，滴加于被測(cè)菌的菌落上，置35 ℃培養(yǎng)15～30 min后觀察結(jié)果。以“菌落消失”判為膽汁溶解試驗(yàn)陽(yáng)性，反之為陰性[8]。

1.6MALDI-TOF MS鑒定 菌株復(fù)蘇后用無(wú)菌吸頭挑取單個(gè)菌落，直接均勻涂布于MALDI靶板。同時(shí)用已知蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)2孔作為校準(zhǔn)。待干燥后，每孔加入基質(zhì)液1 μL，干燥后用MALDI-TOF MS儀進(jìn)行檢測(cè)，分值2.3～3.0為高置信的種水平鑒定；分值2.0～<2.3為確定的屬水平鑒定，可能的種水平鑒定；分值1.7～<2.0為可能的屬水平鑒定；分值0.0～<1.7為不可靠的鑒定[9]。采用鑒定分值≥2.0且取分值最高者為鑒定結(jié)果。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行。采用行×列隊(duì)卡方檢驗(yàn)比較Optochin試驗(yàn)、膽汁溶解試驗(yàn)及MALDI-TOF MS在鑒別α溶血鏈球菌的差異。采用配對(duì)卡方檢驗(yàn)比較任意2種方法在鑒別α溶血鏈球菌中的差異。雙側(cè)檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1分子生物學(xué)鑒定 以SPN0001為檢測(cè)靶標(biāo)行PCR擴(kuò)增獲得154 bp擴(kuò)增產(chǎn)物，以16S rRNA為靶標(biāo)行PCR獲得928 bp擴(kuò)增產(chǎn)物，見(jiàn)圖1。282株α溶血鏈球菌中，234株SPN0001陽(yáng)性菌株，48株SPN0001陰性菌株。以簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣法抽取5株SPN0001陽(yáng)性菌株，經(jīng)16S rRNA測(cè)序確認(rèn)為肺炎鏈球菌(100%)；11株SPN0001陰性菌株經(jīng)16S rRNA測(cè)序指向α溶血的非肺炎鏈球菌(98%～100%)，包括假肺炎鏈球菌或緩癥鏈球菌 8株、口腔鏈球菌2株、血鏈球菌1株。

注：1，DNA marker(100～2 000 bp)；2，SPN0001陽(yáng)性(154 bp)；3，16S rRNA PCR產(chǎn)物(928 bp)；4，SPN0001陰性。

2.2Optochin試驗(yàn) 282株α溶血鏈球菌中213株為Opts，69株為Optr。234株肺炎鏈球菌中Opts和Optr分別為204株和30株，肺炎鏈球菌Optochim的耐藥率為12.82%；48株非肺炎鏈球菌中有9株Opts菌株。其檢測(cè)敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值見(jiàn)表1。

2.3膽汁溶解試驗(yàn) 282株α溶血鏈球菌中235株表現(xiàn)為膽汁溶解試驗(yàn)陽(yáng)性，47株表現(xiàn)為膽汁溶解試驗(yàn)陰性。其檢測(cè)敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值見(jiàn)表1、表2。

2.4MALDI-TOF MS鑒定 282株α溶血鏈球菌中247株被鑒定為肺炎鏈球菌，其余35株為非肺炎鏈球菌(緩癥鏈球菌 25株、口腔鏈球菌6株、血鏈球菌和副溶血鏈球菌各2株)。234株肺炎鏈球菌的MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果均為肺炎鏈球菌。但還有13株非肺炎鏈球菌MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果也顯示為肺炎鏈球菌。其檢測(cè)敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值見(jiàn)表1。

2.5組合試驗(yàn)鑒定肺炎鏈球菌 MALDI-TOF MS組合膽汁溶解試驗(yàn)的鑒定性能同單獨(dú)膽汁溶解試驗(yàn)，但優(yōu)于MALDI-TOF MS組合Optochin試驗(yàn)的鑒定性能。Optochin試驗(yàn)組合膽汁溶解試驗(yàn)或MALDI-TOF MS的鑒定性能優(yōu)于單獨(dú)Optochin試驗(yàn)。見(jiàn)表2。

2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 Optochin試驗(yàn)、膽汁溶解試驗(yàn)及MALDI-TOF MS 3種方法對(duì)282株α溶血鏈球菌鑒定結(jié)果的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.381，P<0.05)。通過(guò)配對(duì)卡方檢驗(yàn)分析，Optochin試驗(yàn)與膽汁溶解試驗(yàn)對(duì)282株α溶血鏈球菌鑒定結(jié)果的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=104.476，P=0.000)；膽汁溶解試驗(yàn)與MALDI-TOF MS對(duì)282株α溶血鏈球菌鑒定結(jié)果的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=199.798，P=0.000)；MALDI-TOF MS與Optochin試驗(yàn)對(duì)282株α溶血鏈球菌鑒定結(jié)果的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=114.198，P=0.000)。

表1 Optochin試驗(yàn)和膽汁溶解試驗(yàn)及MALDI-TOF MS對(duì)282株α溶血鏈球菌的鑒定結(jié)果

表2 不同肺炎鏈球菌鑒定試驗(yàn)組合對(duì)282株α溶血鏈球菌的鑒定結(jié)果

3 討論

肺炎鏈球菌是臨床重要的病原菌，由于其與假肺炎鏈球菌、緩癥鏈球菌、口腔鏈球菌等非肺炎鏈球菌在進(jìn)化關(guān)系上緊密[10]，以及鏈球菌物種之間發(fā)生水平基因轉(zhuǎn)移[11]，使其許多表型和分子特征相似，導(dǎo)致臨床難以準(zhǔn)確鑒定肺炎鏈球菌。臨床實(shí)驗(yàn)室常用的鑒定肺炎鏈球菌鑒定試驗(yàn)有Optochin試驗(yàn)和膽汁溶解試驗(yàn)[12]，近年來(lái)采用MALDI-TOF MS鑒定肺炎鏈球菌的實(shí)驗(yàn)室越來(lái)越多。本研究選擇以分子生物學(xué)方法檢測(cè)SPN0001陽(yáng)性為肺炎鏈球菌判定標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)以上3種方法鑒定肺炎鏈球菌的檢測(cè)性能進(jìn)行對(duì)比研究。

Optochin是一種奎寧衍生的抗菌藥物，通過(guò)結(jié)合H+-ATPase的F0部分的c亞單位，阻止其螺旋變構(gòu)，導(dǎo)致H+無(wú)法被泵出而形成胞內(nèi)pH降低以及電荷紊亂而導(dǎo)致細(xì)菌死亡[13]。Optochin試驗(yàn)已成為鑒定肺炎鏈球菌的主要方法[12]。但隨著對(duì)α溶血鏈球菌的了解增加，發(fā)現(xiàn)部分假肺炎鏈球菌可表現(xiàn)為Opts[14]，因此不能單憑Optochin敏感性試驗(yàn)確認(rèn)肺炎鏈球菌，另一方面，已有報(bào)道肺炎鏈球菌H+-ATPase的F0部分的c亞單位和a亞單位的堿基突變導(dǎo)致對(duì)Optochin產(chǎn)生耐藥[15]，因此其敏感性和特異性均值得重新評(píng)價(jià)。本研究中有部分非肺炎鏈球菌表現(xiàn)為Optochin敏感，其是否為假肺炎鏈球菌有待進(jìn)一步鑒定。而肺炎鏈球菌對(duì)Optochin耐藥的機(jī)制是否存在上述堿基突變需要進(jìn)一步確證。

膽汁溶解試驗(yàn)是以脫氧膽酸鹽溶解鏈球菌細(xì)胞壁，由于肺炎鏈球菌存在自溶素基因lytA，表現(xiàn)為該試驗(yàn)陽(yáng)性。膽汁溶解試驗(yàn)作為傳統(tǒng)的鑒定肺炎鏈球菌方法，其優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確度高[16]，本研究中其敏感性和特異性分別為100%和97.92%，與其他研究者對(duì)膽汁溶解試驗(yàn)的評(píng)價(jià)較一致[17]。但在判斷結(jié)果方面，客觀性較MALDI-TOF MS和Optochin試驗(yàn)差[18]，結(jié)果需要有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室人員做出正確的判斷，因此，限制了膽汁溶解試驗(yàn)在臨床實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用。但膽汁溶解試驗(yàn)仍作為鑒定肺炎鏈球菌的首選和推薦方法，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)每年定期進(jìn)行相關(guān)人員培訓(xùn)以及判讀的人員比對(duì)工作，盡量減少人員主觀判讀的差異性。有研究者提出測(cè)定膽汁溶解試驗(yàn)新方法，即通過(guò)測(cè)量鏈球菌懸浮液濁度下降程度判定試驗(yàn)結(jié)果，可有效避免主觀判讀[17]。但該方法需要一定量的菌落，且不便于大樣本批量操作。也有文獻(xiàn)報(bào)道MALDI-TOF MS聯(lián)合膽汁溶解試驗(yàn)的方法，將膽汁溶解結(jié)果以MALDI-TOF MS測(cè)定分值進(jìn)行判斷，可有效消除膽汁溶解試驗(yàn)在實(shí)際應(yīng)用中受到的主觀判斷結(jié)果的局限性[19]，又能方便大批量樣本的操作?？梢詫⒃摲椒ㄟM(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證，在實(shí)際工作中推廣使用。

MALDI-TOF MS基于細(xì)菌豐富的肽和小蛋白質(zhì)經(jīng)MALDI-TOF MS轉(zhuǎn)換成獨(dú)特質(zhì)荷比信號(hào)所構(gòu)成的該細(xì)菌特征峰譜進(jìn)行快速鑒定[20]。 有研究者總結(jié)了MALDI-TOF MS鑒定肺炎鏈球菌的敏感性為99%，但是緩癥鏈球菌和口腔鏈球菌極容易被鑒定為肺炎鏈球菌[21]。同樣，本研究結(jié)果顯示MALDI-TOF MS鑒定肺炎鏈球菌的敏感性高達(dá)100%，且操作方便、結(jié)果判讀客觀，因此可以作為肺炎鏈球菌鑒定的篩選方法，但其特異性只有72.92%，因此鑒定為非肺炎鏈球菌的結(jié)果可靠，而對(duì)鑒別為肺炎鏈球菌的結(jié)果需要進(jìn)一步用其他方法進(jìn)行確認(rèn)。

本研究結(jié)果表明MALDI-TOF MS鑒定快速且敏感性為100%，而膽汁溶解試驗(yàn)的敏感性為100%、特異性為97.92%，Optochin試驗(yàn)的檢測(cè)性能有限，因此在檢測(cè)策略上，MALDI-TOF MS組合膽汁溶解試驗(yàn)鑒定肺炎鏈球菌優(yōu)于MALDI-TOF MS組合Optochin試驗(yàn)。因此，如果實(shí)驗(yàn)室能規(guī)范應(yīng)用膽汁溶解試驗(yàn)，則可以在日常鑒定肺炎鏈球菌時(shí)，先用MALDI-TOF MS進(jìn)行初篩，對(duì)于初篩陽(yáng)性再行膽汁溶解試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，以提高肺炎鏈球菌鑒定效率和可靠性。如果實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有MALDI-TOF MS，且膽汁溶解試驗(yàn)判定結(jié)果可靠的前提下，建議可行膽汁溶解試驗(yàn)快速、準(zhǔn)確、低成本地鑒定肺炎鏈球菌。對(duì)于有條件的實(shí)驗(yàn)室，采用基于肺炎鏈球菌SPN0001為靶基因的分子生物學(xué)方法鑒定肺炎鏈球菌結(jié)果更為準(zhǔn)確，因?yàn)榉窝祖溓蚓鶶PN0001基因具有高度保守性和特異性的特點(diǎn)。而隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，今后可能會(huì)有更優(yōu)的方法實(shí)現(xiàn)高通量、快速、準(zhǔn)確鑒定肺炎鏈球菌。