不同種子處理方法下長枝木霉T6菌株對小油菜促生作用及生理特性的影響

郭彩蘋，張 祿，孫晨曦，馬耀杰，李昕冉，景 濤，徐秉良，張樹武

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室，甘肅 蘭州 730070)

小油菜(BrassicachinensisL.)又名上海青、青梗菜和青菜等[1]，由于其具有口感爽脆、富含維生素、生長周期短及一年四季皆可種植等優(yōu)點[2]，已成為我國種植面積和范圍最廣的蔬菜之一[3]。但是近年來小油菜種植模式單一、化學(xué)肥料使用種類單一及其過量使用[4]，導(dǎo)致連作障礙、土壤板結(jié)和酸化等一系列問題[5]，使得種子發(fā)芽率降低，幼苗生長勢降低，甚至嚴(yán)重影響小油菜口感和品質(zhì)。因此，如何提高種子發(fā)芽率、幼苗生長勢及育苗效率等成為目前種植小油菜急需解決的問題。

木霉菌(Trichodermaspp.)是一類廣泛存在于各個生態(tài)系統(tǒng)中的真菌[6]，其不僅具有重要的生防價值，還具有促進(jìn)植物生長、改善植物生長環(huán)境、提高植物產(chǎn)量及其產(chǎn)品質(zhì)量等功能[7]。賀字典等[8]研究表明，溶磷木霉菌tang-10-11能夠?qū)⒗苯犯H土壤難溶性磷轉(zhuǎn)化成速效性磷，間接促進(jìn)速效鉀和有機(jī)質(zhì)的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)了辣椒植株生長，提高辣椒維生素C和可溶性糖含量；張成等[9]發(fā)現(xiàn)棘孢木霉DQ-1分生孢子粉能夠顯著促進(jìn)黃瓜、辣椒、番茄和西瓜幼苗根系數(shù)量增多和莖稈增粗；廉華等[10]發(fā)現(xiàn)棘孢木霉菌劑能夠提高黃瓜幼苗葉綠素含量、根系活力、可溶性糖及可溶性蛋白等含量，進(jìn)而提高黃瓜產(chǎn)量和品質(zhì)；Yu 等[11]發(fā)現(xiàn)木霉菌株TaspHu1高濃度孢子懸浮液可以顯著提高番茄株高、莖粗、可溶性蛋白和可溶性糖的含量。但是，目前有關(guān)采用水瓊脂培養(yǎng)法、種子浸泡法和盆栽灌根法處理測定長枝木霉T6菌株對小油菜促生作用及生理特性影響方面的報道較少。

因此，本試驗通過種子萌發(fā)和幼苗盆栽試驗測定了長枝木霉T6菌株孢子懸浮液和發(fā)酵濾液對小油菜促生作用及生理特性的影響，分析和討論長枝木霉T6菌株對小油菜的促生效果及初步作用機(jī)制，以期為提高小油菜產(chǎn)量和品質(zhì)提供理論和實踐參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 供試菌株為長枝木霉T6菌株，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理學(xué)實驗室提供，保藏于中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號為CGMCC No.13183。

1.1.2 供試品種 小油菜品種為‘德高’，采購于甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種子有限責(zé)任公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 長枝木霉T6菌株分生孢子懸浮液配制 懸浮液參照張樹武等[12]方法配制。長枝木霉T6菌株在PDA平板培養(yǎng)6 d后，在其培養(yǎng)基中加入1滴Tween-80和5 mL無菌水配制成分生孢子懸浮液，并將其轉(zhuǎn)移到無菌離心管中，經(jīng)振蕩充分混勻后，利用血球計數(shù)板計算其濃度，最終配制濃度為1.0×107cfu·mL-1孢子懸浮液備用。

1.2.2 長枝木霉T6菌株發(fā)酵濾液制備 取1 mL濃度為1.0×107cfu·mL-1長枝木霉T6菌株孢子懸浮液加入到70 mL馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，同時取1 mL無菌水加入到70 mL馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中作為對照。將兩者置于溫度為25℃，轉(zhuǎn)速為150 r·min-1的搖床中培養(yǎng)；8 d后，將培養(yǎng)液經(jīng)8 000 r·min-1離心20 min后吸取上清液，并利用雙層濾膜過濾，加入懸浮液處理獲得的濾液即為長枝木霉T6菌株發(fā)酵濾液。每個處理和對照均重復(fù)6次。

1.2.3 長枝木霉T6菌株及其孢子懸浮液對小油菜種子活性及幼苗生長的影響 水瓊脂培養(yǎng)法：挑選飽滿健康的小油菜種子，利用75%酒精浸泡消毒2 min后，經(jīng)無菌水充分沖洗3次，用無菌吸水紙吸取多余水分后備用。將其種植于水瓊脂培養(yǎng)基一側(cè)1/3處(d=8.5 cm)，并在其對應(yīng)的另一側(cè)1/3處接種直徑為0.5 cm長枝木霉T6菌株菌餅和空白水瓊脂菌餅分別作為處理和對照。待接種后，將其分別置于25℃培養(yǎng)箱中光暗交替培養(yǎng)(16 h/8 h)。每個培養(yǎng)基中種植5粒小油菜種子，每個處理和對照均重復(fù)6次。

浸泡法：將消毒后的種子分別置于濃度為1.0×107cfu·mL-1長枝木霉T6孢子懸浮液和無菌水中浸泡2 h，分別作為處理和對照。然后，分別將處理和對照組種子置于含有一層紗布和兩層濾紙的無菌培養(yǎng)皿(d=8.5 cm)中，并置于25℃培養(yǎng)箱中光暗交替培養(yǎng)(16 h/8 h)。每個培養(yǎng)皿中種植5粒小油菜種子，每個處理和對照均重復(fù)6次。

待小油菜種子胚根長度超過種子長度一半時開始統(tǒng)計發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)，待處理7 d后測定幼苗胚根和胚芽長度及干、鮮重，并利用根系掃描儀(WinRHIZO pro LA2400)測定根系總投影面積、總根表面積、平均根系直徑、總根體積和根尖數(shù)。每個處理和對照均重復(fù)6次。

發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子總數(shù))×100

發(fā)芽指數(shù)=∑Gt/Dt

式中，Gt為t時間內(nèi)發(fā)芽數(shù),Dt為相應(yīng)發(fā)芽天數(shù)。

1.2.4 長枝木霉T6菌株發(fā)酵濾液對小油菜幼苗生理特性的影響 將飽滿、健康且經(jīng)消毒的小油菜種子種植于含有營養(yǎng)土的育苗盤中(32穴)，每穴種植5粒。種植10 d后，取20 mL長枝木霉T6菌株發(fā)酵濾液澆灌于小油菜根系周圍土壤中，對照則澆灌等體積馬鈴薯葡萄糖濾液，每個處理和對照均重復(fù)6次。然后，將其置于溫室中培養(yǎng)(培養(yǎng)溫度25℃，相對濕度RH>60%和光照16 h/8 h)，每隔2 d澆一次水，并在處理30 d后分別測定小油菜幼苗葉綠素和可溶性蛋白含量。參考陳毓荃[13]方法，采用分光光度法測定小油菜幼苗葉綠素含量；參考楊玉芳[14]和邱葵等[15]方法，采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測定小油菜幼苗可溶性蛋白含量。每個處理及對照均重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件和SPSS 21.0軟件整理分析數(shù)據(jù)，采用Duncan’s新復(fù)極差法對各處理進(jìn)行多重比較(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 水瓊脂培養(yǎng)下長枝木霉T6菌株對小油菜種子活性的影響

在水瓊脂培養(yǎng)基上，長枝木霉T6菌株對小油菜種子活性具有顯著的影響 (圖1，表1)。經(jīng)長枝木霉T6菌株處理的小油菜種子發(fā)芽整齊，幼苗生長發(fā)育良好，胚根長且粗壯(圖1B)，而對照生長勢相對較弱，胚根較短(圖1A)。與對照相比，長枝木霉T6菌株處理后的小油菜種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、幼苗胚根長度、胚芽長度、鮮重和干重的相對增長率分別為2.51%、20.55%、70.79%、21.98%、32.00%和30.00%(表1)。

注：A：對照；B：長枝木霉T6菌株處理。Note: A: control; B: Trichoderma longibrachiatum T6 strain treatment.圖1 長枝木霉T6菌株對小油菜幼苗生長的影響Fig.1 Effect of Trichoderma longibrachiatum T6 strain on the seedling of Brassica chinensis growth

表1 長枝木霉T6菌株對小油菜種子活性及幼苗形態(tài)特征的影響Table 1 Effect of Trichoderma longibrachiatum T6 strain on the seed vigor and seedlings morphological characteristics of Brassica chinensis

2.2 水瓊脂培養(yǎng)下長枝木霉T6菌株對小油菜根系發(fā)育的影響

與對照相比，長枝木霉T6菌株能夠顯著促進(jìn)小油菜根系生長發(fā)育(圖2，表2)。經(jīng)長枝木霉T6菌株處理的小油菜胚根發(fā)育良好，側(cè)根數(shù)量多且發(fā)達(dá)(圖2B)，而對照側(cè)根數(shù)量相對較少(圖2A)。長枝木霉T6菌株處理的幼苗根系總投影面積、總根表面積、平均根系直徑、總根體積和根尖數(shù)顯著高于對照，分別較對照增加58.49%、58.79%、18.18%、100.00%和77.88%(表2)。

注：A：對照；B：長枝木霉T6菌株處理。Note: A: control; B: Trichoderma longibrachiatum T6 strain treatment.圖2 長枝木霉T6菌株對小油菜根系生長發(fā)育的影響Fig.2 Effects of Trichoderma longibrachiatum T6 strain on the root growth and development of Brassica chinensis

表2 長枝木霉T6菌株對小油菜單株根系生長發(fā)育的影響Table 2 Effect of Trichoderma longibrachiatum T6 strain on the root growth and development of Brassica chinensis

2.3 浸泡處理下長枝木霉T6菌株孢子懸浮液對小油菜種子活性的影響

經(jīng)長枝木霉T6菌株孢子懸浮液浸泡處理的小油菜種子發(fā)芽速率和幼苗生長速率顯著增加，并且處理后其幼苗生長健壯，胚芽和胚根長且粗壯(圖3B)，而對照生長勢相對較弱，根系較短且側(cè)根較少(圖3A)。與對照相比，經(jīng)長枝木霉T6菌株孢子懸浮液浸泡處理的種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、幼苗胚根長度、胚芽長度、鮮重和干重的相對增長率分別為2.06%、19.60%、82.21%、43.36%、31.58%和40.00%(表3)。

注：A：對照；B：長枝木霉T6菌株孢子懸浮液處理。Note: A: control; B: Trichoderma longibrachiatum T6 spore suspension treatment. 圖3 長枝木霉T6菌株孢子懸浮液對小油菜幼苗生長的影響Fig.3 Effect of the spore suspension of Trichoderma longibrachiatum T6 on the seedling of Brassica chinensis growth

表3 長枝木霉T6孢子懸浮液對小油菜種子活性及幼苗形態(tài)特征的影響Table 3 Effects of the spore suspension of Trichoderma longibrachiatum T6 on the seed vigor and seedlings morphological characteristics of Brassica chinensis

2.4 浸泡處理下長枝木霉T6菌株孢子懸浮液對小油菜根系發(fā)育的影響

與對照相比，經(jīng)長枝木霉T6菌株孢子懸浮液浸泡處理的小油菜胚根發(fā)育良好，側(cè)根數(shù)量多且發(fā)達(dá)(圖4B)，而對照側(cè)根數(shù)量相對較少且較短(圖4A)。長枝木霉T6菌株孢子懸浮液浸泡處理后，小油菜根系總投影面積、總根表面積、平均根系直徑、總根體積和根尖數(shù)較對照分別增加44.19%、45.52%、13.04%、100.00%和28.57%(表4)。

注：A：對照；B：長枝木霉T6菌株孢子懸浮液處理。Note: A: control; B: Trichoderma longibrachiatum T6 spore suspension treatment.圖4 長枝木霉T6菌株孢子懸浮液對小油菜根系生長發(fā)育的影響Fig.4 Effects of the spore suspension of Trichoderma longibrachiatum T6 on the root growth and development of Brassica chinensis

表4 長枝木霉T6孢子懸浮液對小油菜單株根系生長發(fā)育的影響Table 4 Effects of the spore suspension of Trichoderma longibrachiatum T6 on the root growth and development of Brassica chinensis

2.5 長枝木霉T6菌株發(fā)酵濾液對小油菜幼苗葉綠素和可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

結(jié)果表明，長枝木霉T6菌株發(fā)酵濾液對小油菜幼苗葉綠素和可溶性蛋白含量具有顯著的影響。

經(jīng)長枝木霉T6菌株發(fā)酵濾液處理30 d后，小油菜幼苗葉綠素和可溶性蛋白含量均顯著增加，與對照相比，其葉綠素和可溶性蛋白含量的相對增長率分別為31.95%和11.40%(表5)。

表5 長枝木霉T6菌株發(fā)酵濾液對小油菜幼苗葉綠素和可溶性蛋白含量的影響Table 5 Effects of Trichoderma longibrachiatum T6 fermentation filtrate on the chlorophyll and soluble protein content of Brassica chinensis seedlings

3 討論與結(jié)論

前人關(guān)于利用木霉菌促進(jìn)植物生長方面的相關(guān)研究，主要集中在利用其提高植物種子發(fā)芽率、幼苗形態(tài)特性、根系生長發(fā)育及幼苗生理生化酶活性等，如Zhao等[16]研究發(fā)現(xiàn)棘孢木霉Q1能增加黃瓜根系活性進(jìn)而促進(jìn)根系生長；Elkelish等[17]發(fā)現(xiàn)哈茨木霉能通過增強(qiáng)番茄葉綠素的合成和必需營養(yǎng)元素(氮、磷和鉀)的吸收，促進(jìn)其生長；Martinez-Medina等[18]研究發(fā)現(xiàn)木霉菌通過調(diào)控激素水平來促進(jìn)甜瓜幼苗的生長。本試驗通過不同種子處理方法下測定長枝木霉T6菌株對小油菜促生作用及生理特性的影響，發(fā)現(xiàn)長枝木霉T6菌株及其孢子懸浮液能夠顯著提高小油菜種子的活性，改善幼苗根系生長發(fā)育狀況。吳利民等[19]利用不同稀釋倍數(shù)木霉發(fā)酵液浸泡番茄種子10 d后，發(fā)現(xiàn)處理后番茄種子發(fā)芽率及植株生長速度顯著提高；劉連妹等[20]研究發(fā)現(xiàn)哈茨木霉處理后番茄幼苗的株高和根長均較對照增加，與本試驗結(jié)果基本一致。此外，本試驗發(fā)現(xiàn)長枝木霉T6菌孢子懸浮液對小油菜幼苗根系干重、胚芽長度和胚根長度促生作用優(yōu)于水瓊脂培養(yǎng)法。

另外，有研究表明葉綠素和可溶性蛋白含量與植物幼苗的生長發(fā)育密切相關(guān)，并且可溶性蛋白可為植物種子萌發(fā)提供營養(yǎng)元素，是衡量種子活性的重要指標(biāo)之一[21]。本試驗發(fā)現(xiàn)長枝木霉T6菌株發(fā)酵濾液可顯著提高小油菜幼苗葉綠素和可溶性蛋白含量。張樹武等[22]發(fā)現(xiàn)不同稀釋倍數(shù)深綠木霉發(fā)酵液均能夠提高黑麥草幼苗葉綠素、可溶性蛋白含量和與抗性相關(guān)酶的活性，進(jìn)而促進(jìn)其生長；王依純等[23]發(fā)現(xiàn)3種木霉(棘孢木霉、哈茨木霉和擬康氏木霉)對黃瓜幼苗葉綠素含量、根系活力和根系總吸收面積等具有顯著提高作用。

因此，本試驗發(fā)現(xiàn)2種處理方法(水瓊脂培養(yǎng)法和種子浸泡法)下長枝木霉T6菌株及其孢子懸浮液對小油菜種子活性和根系生長發(fā)育具有較強(qiáng)的促生作用，并且其發(fā)酵濾液對小油菜葉綠素和可溶性蛋白質(zhì)含量具有顯著提高作用，但是有關(guān)不同處理方法下長枝木霉T6菌株對小油菜促生作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。