丹參葛根提取物對(duì)阿霉素引發(fā)小鼠心力衰竭的作用

張夢(mèng)瑤 張咪 韓彥弢 趙文文

［摘要］ 目的

探究丹參葛根提取物（DG）對(duì)阿霉素（DOX）引發(fā)的心力衰竭小鼠（DOX-HF小鼠）的心臟保護(hù)作用。

方法 將32只6周齡雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（A組）、模型組（B組）、低劑量給藥組（C組）和高劑量給藥組（D組），每組8只。B組、C組和D組腹腔注射DOX 4周（每周5 mg/kg），C組和D組在建模開始時(shí)每日1次灌胃DG水溶液，灌胃劑量分別為50 mg/kg和100 mg/kg；A組、B組每日灌胃相同劑量的生理鹽水。采用超聲心動(dòng)圖檢測(cè)評(píng)估心臟機(jī)械功能改變情況，蘇木精-伊紅（HE）染色和Masson染色觀察心肌組織病理學(xué)變化，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)血清中氨基末端腦鈉肽前體（NT-proBNP）、肌鈣蛋白I（cTnI）、腫瘤壞死因子（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）水平。

結(jié)果 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果顯示，與A組相比，B組左室射血分?jǐn)?shù)（EF）、左室短軸縮短率（FS）顯著下降，左室舒張末期容積（LVEDV）和左室收縮末期容積（LVESV）顯著升高；與B組相比，C組和D組EF和FS顯著升高，LVEDV和LVESV顯著下降，差異均有顯著性（F=7.66～29.30，P<0.05）。HE染色結(jié)果顯示，與A組相比，B組心肌組織結(jié)構(gòu)明顯異常，心肌細(xì)胞排列紊亂且水腫，空泡化嚴(yán)重；C組和D組心肌細(xì)胞排列輕度紊亂，可見少許空泡。Masson染色結(jié)果顯示，與A組相比，B組膠原沉積顯著增加，C組和D組膠原沉積較B組明顯減少。ELISA檢測(cè)顯示，與A組比較，B組NT-proBNP、cTnI、TNF-α和IL-6水平顯著升高，C組和D組NT-proBNP、cTnI、TNF-α和IL-6水平較B組顯著下降，差異有顯著性（F=17.54～32.59，P<0.05）。

結(jié)論 DG能夠有效保護(hù)DOX-HF小鼠的心臟功能。

［關(guān)鍵詞］ 多柔比星；心力衰竭；丹參葛根提取物；炎癥

［中圖分類號(hào)］ R969

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

［文章編號(hào)］ 2096-5532（2023）06-0894-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.202

［網(wǎng)絡(luò)出版］ https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240104.1606.003;2024-01-08 11：04：52

EFFECT OF SALVIA MILTIORRHIZA AND RADIX PUERARIAE EXTRACT ON DOXORUBICIN-INDUCED HEART FAILURE IN MICE

ZHANG Mengyao， ZHANG Mi， HAN Yantao， ZHAO Wenwen

（School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

; ［ABSTRACT］ObjectiveTo explore the cardioprotective effect of Salvia miltiorrhiza-Radix puerariae extract （DG） on mice with heart failure induced by doxorubicin （DOX-HF mice）.

MethodsIn the experiment， 32 C57BL/6J mice （6 weeks old， male） were randomly divided into four groups： control group （group A）， model group （group B）， low-dose DG group （group C）， and high-dose DG group （group D） （n=8 per group）. Mice form groups B， C， and D received an intraperitoneal injection of DOX for 4 weeks （5 mg/kg per week）. Meanwhile， mice in groups C and D were intragastrically given DG water solution once daily at the beginning of modeling with doses of 50 and 100 mg/kg， respectively. Mice in groups A and B were intragastrically given the same dose of normal saline daily. The changes in cardiac mechanical function were evaluated by echocardiography; myocardial histopathological changes were observed by hematoxylin-eosin （HE） staining and Masson staining; enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was used to measure levels of serum N-terminal pro-brain natriuretic peptide （NT-proBNP）， cardiac troponin I （cTnI）， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， and interleukin-6 （IL-6）.

ResultsEchocardiography data showed that compared with group A， group B had significantly decreased left ventricular ejection fraction and left ventricular fractional shortening and significantly increased left ventricular end-diastolic volume and left ventricular end-systolic volume. Above phenomena that occurred in group B were significantly reversed in groups C and D （F=7.66-29.30，P<0.05）. Furthermore， the data from HE staining showed that significantly abnormal myocardial tissue structure characterized by disordered and edematous myocardial cells especially with se-

rious vacuolation was observed in group B compared with group A. Meanwhile， above morphological changes were alle-

viated with DG treatment in mice from groups C and D. Besides， the data from Masson staining showed that collagen deposition was significantly increased in group B compared with group A but was significantly reduced in groups C and D compared with group B. Additionally， ELISA data showed that compared with group A， group B had significantly increased levels of serum NT-proBNP， cTnI， TNF-α， and IL-6， while these cytokines were significantly decreased in mice from groups C and D compared with those from group B （F=17.54-32.59，P<0.05）.

ConclusionDG presents

a cardioprotective effect on DOX-HF mice.

［KEY WORDS］doxorubicin; heart failure; Salvia miltiorrhiza-Radix pueraria extract; inflammation

中國(guó)的心血管疾病和癌癥發(fā)病率處于較高水平，且隨著長(zhǎng)期使用抗腫瘤藥物，其引發(fā)的心血管并發(fā)癥是多數(shù)病人死亡的重要原因，其中心力衰竭（HF）是主要的并發(fā)癥之一［1-3］。防治抗腫瘤誘發(fā)的HF是現(xiàn)階段面臨的棘手問題。HF是由于心臟結(jié)構(gòu)或功能異常導(dǎo)致心室充盈或射血能力受損的一組復(fù)雜臨床綜合征［4-6］。丹參葛根提取物（DG）源自《施今墨對(duì)藥》，丹參功效活血祛瘀，化瘀生新，鎮(zhèn)靜安神；葛根輕揚(yáng)升發(fā)，解肌退熱；兩者合用，氣血同治，相輔相成［7］。本研究通過建立阿霉素（DOX）誘導(dǎo)的HF（DOX-HF）小鼠模型，探究DG對(duì)DOX-HF小鼠的心臟保護(hù)作用，為DG應(yīng)用于抗腫瘤治療誘發(fā)的心臟病的臨床治療提供參考?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡雄性C57BL/6J小鼠32只，體質(zhì)量20～25 g，購(gòu)買于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物育種有限公司，飼養(yǎng)于青島大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，室溫（22±2）℃，濕度（60±5）%，光照/黑暗周期為12 h，

自由飲水和進(jìn)食。

1.1.2 儀器及試劑 DG購(gòu)買于南通經(jīng)緯生物科技有限公司；DOX購(gòu)自美國(guó)MCE公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒和Masson染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；氨基末端腦鈉肽前體（NT-proBNP）、肌鈣蛋白I（cTnI）、腫瘤壞死因子（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）ELISA試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；小動(dòng)物超聲系統(tǒng)（中國(guó)維勝中國(guó)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DOX-HF小鼠模型的制備以及實(shí)驗(yàn)分組

C57BL/6J小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組，每組8只，分別為對(duì)照組（A組）、模型組（B組）、低劑量給藥組（C組）、高劑量給藥組（D組）。B組、C組和D組連續(xù)4周腹腔注射DOX建立HF小鼠模型，注射劑量為每周5 mg/kg，累計(jì)劑量為20 mg/kg，A組不做處理。C組和D組在建模初始時(shí)每日灌胃給予DG提取液，灌胃劑量分別為50 mg/kg和100 mg/kg；A組和B組在建模初始時(shí)每日灌胃給予同等劑量的生理鹽水。

1.2.2 超聲心動(dòng)圖檢查 腹腔注射5 g/L戊巴比妥鈉（10 mL/kg）麻醉小鼠，采用配備MS400探頭（18～38 MHz）的Vevo 2100成像系統(tǒng)獲得心臟超聲心動(dòng)圖，檢測(cè)左室射血分?jǐn)?shù)（EF）、左室短軸縮短率（FS）、左室收縮末期容積（LVESV）和左室舒張末期容積（LVEDV）。

1.2.3 樣本采集及處理 末次灌胃結(jié)束后，禁食12 h，眼球取血，室溫靜置30 min，4 500 r/min離心15 min，吸取血清，用于生化指標(biāo)檢測(cè)。取心臟組織并迅速置于40 g/L多聚甲醛中固定48 h。

1.2.4 蘇木精-伊紅（HE）染色 心臟組織固定后，常規(guī)石蠟包埋、切片，厚度為5 μm。應(yīng)用HE染色試劑盒染色，按照說明書操作。顯微鏡下觀察各組小鼠心肌組織病理學(xué)變化。

1.2.5 Masson染色 應(yīng)用Masson染色試劑盒，操作嚴(yán)格按照說明書方法進(jìn)行，顯微鏡下觀察各組小鼠心肌纖維化情況。

1.2.6 血清中NT-proBNP、cTnI、TNF-α和IL-6水平檢測(cè) 將血清樣本從-80 ℃冰箱中取出，平衡至室溫，采用ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各指標(biāo)水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpad prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料結(jié)果以±s形式表示，多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Turkey法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)? 果

2.1 各組小鼠超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果比較

各組小鼠EF、FS、LVEDV和LVESV比較差異均有顯著性（F=7.66～29.30，P<0.05）。兩兩比較顯示，與A組相比，B組小鼠EF和FS顯著下降，LVEDV和LVESV則顯著升高（P<0.05），提示DOX-HF小鼠造模成功。與B組相比，C組和D組小鼠的EF和FS顯著升高，LVEDV和LVESV顯著下降并趨近于對(duì)照組（P<0.05）；C組和D組EF、FS、LVEDV和LVESV差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.2 各組小鼠心肌組織病理學(xué)變化

HE染色顯示，A組心肌細(xì)胞排列規(guī)整，未觀察到明顯異常病理學(xué)改變；B組心肌組織結(jié)構(gòu)明顯異常，心肌細(xì)胞排列紊亂、水腫、空泡化嚴(yán)重；C組和D組心肌細(xì)胞排列輕度紊亂，可見少許空泡（圖1）。

2.3 各組小鼠心肌纖維化比較

Masson染色結(jié)果顯示，A組存在極少的膠原沉積，心肌間質(zhì)纖維化不明顯；B組膠原沉積顯著增加，表明心肌間質(zhì)纖維化嚴(yán)重；與B組相比，C組和D組藍(lán)色膠原沉積明顯減少（圖2）。

2.4 各組小鼠血清NT-proBNP、cTnI、TNF-α和IL-6水平比較

各組小鼠血清NT-proBNP、cTnI、TNF-α和IL-6水平比較差異均有顯著性（F=17.54～32.59，P<0.05）。與A組相比，B組NT-proBNP、cTnI、TNF-α和IL-6水平顯著升高（P<0.05），C組和D組的IL-6水平顯著升高（P<0.05）。與B組比較，C組和D組NT-proBNP、cTnI、TNF-α和IL-6水平顯著下降（P<0.05）。見表2。

3 討? 論

HF是由于心臟結(jié)構(gòu)和功能異常導(dǎo)致泵功能失代償?shù)囊环N復(fù)雜臨床綜合征［8］，已成為一個(gè)嚴(yán)重的臨床和公共衛(wèi)生問題［9］。近幾十年來(lái)，隨著腫瘤病人的急劇增加，以DOX為代表的蒽環(huán)類藥物廣泛應(yīng)用，在癌癥治療過程中對(duì)病人產(chǎn)生嚴(yán)重心臟毒性限制了其進(jìn)一步應(yīng)用［10-11］。因此，尋求有效防治蒽環(huán)類藥物引發(fā)HF的治療方法尤為重要。

DG應(yīng)用始見于《施今墨對(duì)藥》，是經(jīng)典的活血化瘀配伍藥對(duì)，已被證明具有良好的心血管保護(hù)作用［12-13］。本研究通過建立DOX-HF小鼠模型探究了DG對(duì)DOX-HF的保護(hù)作用，超聲心動(dòng)圖檢測(cè)顯示，DG可以顯著提高DOX-HF小鼠心臟機(jī)械功能，相較于低劑量組，高劑量組小鼠的EF和FS有所降低，LVESV和LVEDV有所升高，更趨近于對(duì)照組小鼠，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并不能證明DG治療具有濃度依賴性。心肌細(xì)胞肥大、排列紊亂，心肌組織纖維化是HF主要病理表現(xiàn)［14-15］。本研究結(jié)果顯示，DG能夠明顯改善心肌細(xì)胞排列紊亂和細(xì)胞水腫，降低心肌組織纖維化水平。

NT-proBNP和cTnI是典型的HF診斷生物標(biāo)志物，被廣泛用于HF的預(yù)測(cè)和早期診斷［16-17］。本研究聯(lián)合檢測(cè)血清NT-proBNP和cTnI水平，探究DG對(duì)DOX-HF的改善作用，結(jié)果顯示DG可以顯著降低血清NT-proBNP和cTnI水平。

炎癥反應(yīng)是DOX引發(fā)心臟毒性的主要機(jī)制，長(zhǎng)期慢性炎癥會(huì)加速心肌纖維化以及HF進(jìn)程。TNF-α能夠誘導(dǎo)活性氧生成，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡；此外，大量的TNF-α通過激活中性神經(jīng)磷脂酶，介導(dǎo)一氧化氮合成來(lái)抑制心肌收縮力［18］。IL-6可以通過刺激GP130-STAT3信號(hào)通路促進(jìn)心肌肥大［19］，IL-6還可以促進(jìn)膠原沉積加速心室重構(gòu)［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，DG可以顯著降低DOX-HF小鼠的機(jī)體炎癥反應(yīng)，提示DG可以通過降低機(jī)體炎癥反應(yīng)來(lái)改善HF。

綜上所述，DG能夠降低DOX-HF小鼠模型炎癥反應(yīng)和心肌損傷標(biāo)志物水平，改善心臟機(jī)械功能。本文研究可為抗腫瘤治療誘發(fā)的心臟病的臨床治療提供參考。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）