P2X7受體在骨科疾病中作用的研究進(jìn)展

程實(shí) 梁晨 馬英凱 呂松岑 閆景龍

P2X7受體屬于嘌呤能受體，是P2X受體家族的成員，位于細(xì)胞表面的一種三聚體配體門控陽離子通道[1]。目前已經(jīng)證實(shí)在很多細(xì)胞類型表面都有表達(dá)，包括造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、白細(xì)胞、紅細(xì)胞、骨細(xì)胞、皮膚細(xì)胞，甚至各種惡性腫瘤細(xì)胞。同時，P2X7受體存在很多亞型。在人體中，P2X7受體變異大約有10種蛋白剪切體變化亞型；P2X7受體從A到J；P2X7受體A是保留完整長度的受體。P2X7受體B、E、G、J缺乏C末端結(jié)構(gòu)[2]。該受體的配體是ATP，介導(dǎo)Na+、K+離子內(nèi)流和Ca2+陽離子外流的快速通過[3]。激活的P2X7受體還可以使其在細(xì)胞表面的孔隙擴(kuò)大，允許非選擇性的最大900Da的有機(jī)親水性陽離子通過；帶陽性電荷的膽堿基和熒光染料，例如乙啶基[4-5]。但是，這一功能不是P2X7受體獨(dú)有的作用，P2X受體家族里其他成員也有類似的功能。

最早發(fā)現(xiàn)并證實(shí)在肥大細(xì)胞中游離或者帶有四堿基的ATP可以激活P2X7受體[6]，但是并沒有確定使P2X7受體通道激活的最佳配體ATP濃度。此受體分布廣泛，參與很多的生理和病理活動，包括炎癥的激活、炎癥因子的釋放[7]、細(xì)胞表面分子標(biāo)志物的改變、溶酶體的融合、自噬和與活性氧和氮共同參與胞內(nèi)病原菌的破壞[8]。在與骨組織相關(guān)的研究中已經(jīng)證實(shí)，P2X7受體表達(dá)在成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞中[9]。敲除P2X7受體可以減少皮質(zhì)骨膜的形成[10]。激活破骨細(xì)胞的P2X7受體，可以促進(jìn)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間鈣信號的傳導(dǎo)[11]。目前的研究認(rèn)為，P2X7受體對很多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程都具有生物學(xué)效應(yīng)，是很多疾病，包括骨科常見疾病的潛在治療靶點(diǎn)[11-12]。

1.P2X7受體對骨質(zhì)疏松具有雙重影響作用：骨質(zhì)疏松是一個常見的骨代謝相關(guān)的疾病。目前研究認(rèn)為雌激素、體內(nèi)炎癥狀態(tài)、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能的平衡狀態(tài)是發(fā)病的影響因素。P2X7受體與這些影響因素的關(guān)系密切。P2X7受體的多樣性突變增加絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[13-14]。使用P2X7受體敲除的純合子和野生型進(jìn)行比較研究證實(shí)，P2X7受體缺失會影響雌激素缺乏性骨丟失的狀態(tài)，加劇骨丟失；這個情況在P2X7受體功能多態(tài)性缺失的絕經(jīng)后婦女中可見[15]。P2X7受體是炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵因子；炎癥因子可能促進(jìn)骨質(zhì)疏松發(fā)生。P2X7受體耦合的信號通路在炎癥反應(yīng)和骨代謝調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用[16]。當(dāng)炎癥發(fā)生時，胞外的ATP濃度升高[17-18]。ATP激活P2X7受體后可介導(dǎo)NLRP3炎癥小體激活并促進(jìn)IL-1β成熟；IL-1β釋放到細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥反應(yīng)；P2X7受體可能加重這一反應(yīng)過程[16]。研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)期婦女骨質(zhì)疏松的原因可能是雌激素水平降低引起的炎癥因子水平升高[19-21]。絕經(jīng)后婦女血清中TNF-α水平增加，血清中炎癥因子水平高的者更容易患骨質(zhì)疏松，可能是高濃度水平的TNF-α促進(jìn)了破骨細(xì)胞分化[22]。而炎癥因子水平與雌激素的關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn)卵巢切除術(shù)后女性血清中IL-1和TNF-α水平升高，經(jīng)雌激素替代治療4周后，血清中白細(xì)胞介素(IL-1)和TNF-α水平下降[23]。

P2X7受體可能在雌激素缺乏造成骨質(zhì)疏松的過程中有作用。卵巢去勢手術(shù)28 d的后的小鼠與正常小鼠對比，同樣的力刺激條件下，骨細(xì)胞的Ca2+內(nèi)流數(shù)量減少。免疫熒光染色證實(shí)小鼠切除卵巢后，P2X7受體的數(shù)量下降了一半以上[24]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者的血清炎癥因子水平和P2X7受體水平高于正常水平[25-26]。雌激素替代治療后，炎癥因子的水平受到限制[27]。P2X7受體在成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞表面都有表達(dá)，承擔(dān)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間通訊的作用。成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的功能狀態(tài)對骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展具有重要的影響作用，所以，P2X7受體可通過維持破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞之間的功能平衡來改善骨質(zhì)疏松癥狀態(tài)。一旦這個平衡被打破，破骨細(xì)胞過度活躍，就會導(dǎo)致骨量丟失增加，發(fā)生骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險(xiǎn)增加。激活P2X7受體可刺激成骨細(xì)胞分化，增強(qiáng)成骨細(xì)胞礦化[28]。如果敲除P2X7受體，小鼠骨膜形成減少，骨小梁吸收增加[29]。

P2X7受體參與破骨細(xì)胞的形成，激活P2X7受體促進(jìn)骨髓造血干細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化。表達(dá)增多后可進(jìn)一步促進(jìn)RANKL表達(dá)增加，抑制P2X7受體降低TNF-α對造血干細(xì)胞的促分化作用。同時在體外的研究中發(fā)現(xiàn)，用P2X7受體拮抗劑可以抑制人血單核細(xì)胞形成破骨細(xì)胞樣細(xì)胞[30-31]。但是，P2X7受體不是破骨細(xì)胞形成必需的，其表達(dá)增加可促進(jìn)RANKL的增加，因此進(jìn)一步促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化和形成。也有研究結(jié)果表明P2X7受體促進(jìn)骨髓造血干細(xì)胞(bone marrow hematopoietic stem cell，BMHSCs)分化為更多功能性破骨細(xì)胞[19]。研究證實(shí)抑制P2X7受體可顯著降低TNF-α對血液中造血干細(xì)胞的促分化作用，減少破骨細(xì)胞的形成；因此，P2X7受體是潛在的治療骨質(zhì)疏松的靶點(diǎn)[19]。

但是，破骨細(xì)胞表面的P2X7受體作用具有雙重性。當(dāng)胞外ATP濃度達(dá)到20～200 μm的時會對破骨細(xì)胞產(chǎn)生不利影響，形成溶解性孔隙，導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡和持續(xù)的炎癥[32]。細(xì)胞外ATP濃度增加超過一定范圍后可降低骨吸收，可能與活化的P2X7受體對破骨細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用有關(guān)[33]。胞外ATP的濃度變化通過P2X7受體對破骨細(xì)胞的形成產(chǎn)生影響[16]。

研究證實(shí)P2X7受體可以通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞功能，緩解骨質(zhì)疏松狀態(tài)。P2X7受體激活后參與成骨細(xì)胞下游LPA合成與釋放、PGE2合成與釋放和ERK1/2激活，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和骨形成[34-36]。但是，胞外ATP濃度達(dá)到1 mm以上時會抑制骨礦化[37]。P2X7受體是成骨過程中不可缺少的，發(fā)揮著重要的作用[38]。P2X7受體敲除的小鼠長骨的骨膜形成下降，機(jī)械應(yīng)力條件下，成骨能力下降，與人類的成骨細(xì)胞研究結(jié)果類似[10,28]。

骨組織的P2X7受體在肌肉機(jī)械拉力刺激下會表達(dá)增加，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，具有降低骨折風(fēng)險(xiǎn)的作用。P2X7受體促進(jìn)成骨分化的作用可能和細(xì)胞的Ca2+內(nèi)流的增加有一定的相關(guān)性[39]。機(jī)械力學(xué)刺激觸發(fā)的ATP釋放可以增強(qiáng)P2X7受體介導(dǎo)的成骨分化功能；P2X7受體激動劑促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和基質(zhì)礦化[40-41]。但是P2X7受體不是介導(dǎo)該過程的必需的受體，在敲除的純合子中，機(jī)械應(yīng)力刺激也可以增加骨量，改善皮質(zhì)和骨小梁質(zhì)量[15]。

2.P2X7受體促進(jìn)骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展：骨性關(guān)節(jié)炎是一種常見的軟骨退行性改變導(dǎo)致的疾病。關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨的炎癥反應(yīng)是骨性關(guān)節(jié)炎主要病理特點(diǎn)之一[42]。近來有研究證實(shí)，P2X7受體與炎癥反應(yīng)和疼痛的關(guān)系密切[43]。

用膠原誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎模型，阻滯P2X7受體信號可能減少IL-17A的分泌，緩解肢體腫脹，減弱Ⅱ型膠原介導(dǎo)的關(guān)節(jié)損害[44]。在膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎動物模型中，使用P2X7受體抑制劑以后，可以顯著降低關(guān)節(jié)內(nèi)IL-1β、IL-6、TNF-α、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-13)、P物質(zhì)和地諾前列酮(PGE2)等炎癥因子的濃度。這些炎性因子濃度的降低可能與P2X7受體阻滯劑使用相關(guān)，緩解了骨性關(guān)節(jié)炎的疼痛[45]。P2X7受體激活后，抑制核因子(NF)-κB信號通路可以降低IL-1β、IL-6、TNF-α、MMP-13、P物質(zhì)和PGE2的濃度，緩解因P2X7受體激活引起的骨源性疼痛和炎癥反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了P2X7受體激活導(dǎo)致的疼痛和炎癥反應(yīng)作用是通過激活NF-κB信號通路發(fā)揮作用[46]。研究發(fā)現(xiàn)在抗體加脂多糖誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎動物模型的比較中，P2X7受體缺陷小鼠的發(fā)生率和嚴(yán)重程度均小于野生型小鼠；所以，P2X7受體可能是關(guān)節(jié)炎治療的潛在靶點(diǎn)[47]。骨性關(guān)節(jié)炎時，肥大細(xì)胞會分泌炎性介質(zhì)，引起膝關(guān)節(jié)疼痛。P2X7受體在這一過程中發(fā)揮促進(jìn)肥大細(xì)胞炎性介質(zhì)分泌的作用[48]。因此，P2X7受體信號通路可能是治療骨性關(guān)節(jié)炎的新靶點(diǎn)。

3.P2X7受體介導(dǎo)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展：P2X7受體參與炎癥反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎的病理過程[49]。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種病因不明的慢性自身免疫性疾病，以慢性滑膜炎癥、關(guān)節(jié)破壞和進(jìn)行性關(guān)節(jié)損傷為特征，導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形、生活質(zhì)量降低，甚至其他器官系統(tǒng)功能受損[11,44]。研究表明，P2X7受體是一個參與和調(diào)控RA炎癥的潛在的位點(diǎn)[50]。

P2X7受體的基因在1068和1513位點(diǎn)的多態(tài)性被認(rèn)為可能是RA的易感基因位點(diǎn)[51]。另外動物研究證實(shí)，P2X7受體基因SNP導(dǎo)致RA患者的P2X7受體功能的變化，可能參與了RA的發(fā)病[52]。在研究P2X7受體的變異在伊朗人群的RA發(fā)病機(jī)制中的作用顯示，P2X7受體基因的多樣性與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的易感性存在關(guān)系，新發(fā)RA的P2X7受體基因表達(dá)水平更高；因此認(rèn)為P2X7受體可能是治療RA的一個潛在藥物靶點(diǎn)[25]。研究發(fā)現(xiàn)RA患者的外周血單核細(xì)胞中P2X7受體表達(dá)量明顯增加[44]，在RA患者滑膜組織中P2X7受體表達(dá)水平升高，對診斷RA具有重要的價值[53]。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的B型滑膜細(xì)胞中表達(dá)功能性P2X7受體，可能參與調(diào)節(jié)滑膜液中IL-6的釋放[54]。RA患者受累細(xì)胞的P2X7受體水平的升高后，在脂多糖與ATP的刺激下，外周血單核細(xì)胞中IL-1β的含量明顯升高[55]。RA患者滑膜組織中IL-1β、IL-6表達(dá)水平與P2X7R水平呈正相關(guān)[53]。在RA的炎癥反應(yīng)階段，P2X7受體參與介導(dǎo)了許多細(xì)胞因子獨(dú)立的信號通路，包括甘油三酯(TG2)和組織蛋白酶通路[49,56]。P2X7受體介導(dǎo)的TG2在胞外聚積，參與到RA的病理過程中，是一個潛在的治療靶點(diǎn)[49]。

由于中性粒細(xì)胞凋亡在炎癥調(diào)節(jié)中起重要作用，P2X7受體也可能通過中性粒細(xì)胞抗凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)間接促進(jìn)RA炎癥的發(fā)生[57]。血清淀粉樣蛋白A(serum amyloid A，SAA)是一種與活動性關(guān)節(jié)炎癥相關(guān)的急性期反應(yīng)物，在RA患者的循環(huán)和組織中被發(fā)現(xiàn)升高[58]。體外實(shí)驗(yàn)表明，從RA患者血漿中純化的SAA能有效抑制膜蛋白(α-CD95)單抗誘導(dǎo)的人中性粒細(xì)胞凋亡。而P2X7受體拮抗劑氧化ATP可完全消除SAA的抗凋亡作用;這表明SAA可能通過依賴P2X7受體的機(jī)制增加中性粒細(xì)胞的存活[59]。所以,阻斷P2X7受體導(dǎo)致了中性粒細(xì)胞凋亡增加，導(dǎo)致了RA炎癥的發(fā)生。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病理過程中關(guān)鍵因素之一是IL-17A的產(chǎn)生;其來源于Th17細(xì)胞。研究證實(shí)，阻滯P2X7受體可以抑制Th17細(xì)胞產(chǎn)生IL-17A，緩解類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)腫脹程度[44]。同時，P2X7受體阻斷后，IL-1β、TGF-β1、IL-23、和IL-6的釋放也會減少，有益于緩解類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的癥狀[44]。Th17細(xì)胞的P2X7受體的表達(dá)與IL-1b、C反應(yīng)蛋白、紅細(xì)胞沉降率、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體、白蛋白、補(bǔ)體C4水平密切相關(guān)；這些數(shù)據(jù)提示Th17細(xì)胞P2X7受體表達(dá)的增加與RA患者的疾病活動性和一些炎癥介質(zhì)在功能上呈正相關(guān)[60]。

4.P2X7受體在骨關(guān)節(jié)感染性疾病中的作用因細(xì)菌不同而不一致：機(jī)體在受到病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲感染后，會引起包括免疫細(xì)胞在內(nèi)的體內(nèi)細(xì)胞釋放ATP。這些ATP會激活P2X7受體，在免疫的不同階段發(fā)揮作用[61]。P2X7受體參與介導(dǎo)細(xì)菌感染引起的免疫反應(yīng)[62]。細(xì)菌的產(chǎn)物可以導(dǎo)致炎性小體的激活，誘導(dǎo)ATP從免疫細(xì)胞中釋放，激活P2X7受體，從而參與介導(dǎo)免疫反應(yīng)[61]。

P2X7受體對單胞菌引起的感染具有免疫促進(jìn)作用。單胞菌可以刺激巨噬細(xì)胞來源的免疫細(xì)胞釋放ATP。ATP激活P2X7受體后，引起K+離子外流，NLRP3炎性小體的激活，最終誘導(dǎo)IL-1β分泌和細(xì)胞死亡[63]。單胞菌菌毛會刺激P2X7受體依賴的巨噬細(xì)胞分泌IL-1β[64]。與正常小鼠的淋巴液對比，敲除P2X7受體的轉(zhuǎn)基因小鼠的IL-17和干擾素(IFN)-γ含量較少[65]。這些都會促進(jìn)免疫細(xì)胞分泌炎癥因子，加速清除單胞菌。

P2X7受體在結(jié)核菌感染的細(xì)胞中表達(dá)增加，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞清除結(jié)核菌，是免疫調(diào)節(jié)的重要因素之一。結(jié)核菌感染的患者血液中，外周血單核細(xì)胞表面的P2X7受體表達(dá)增加[66]。多項(xiàng)研究也證實(shí)，細(xì)胞外ATP可以通過P2X7受體誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞加速清除結(jié)核桿菌，其可能的機(jī)制是誘導(dǎo)被感染細(xì)胞中磷脂酶D的活化與凋亡[56]。在體內(nèi)研究中發(fā)現(xiàn)，P2X7受體敲除的小鼠對結(jié)核桿菌的易感性因細(xì)菌菌株和毒力不同而有差異[67]。當(dāng)暴露在高毒性實(shí)驗(yàn)室結(jié)核菌株H37Rv條件下時，與正常小鼠相比，P2X7受體敲除的小鼠更容易受到感染[67]。但另一研究認(rèn)為，與野生型小鼠相比，P2X7敲除的轉(zhuǎn)基因鼠不易受到高毒性結(jié)核菌的感染[68]。最近一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)P2X7受體的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在結(jié)核菌感染過程中具有促進(jìn)作用[69]。

P2X7受體與病毒感染有一定的關(guān)系，但病毒感染不是骨科的常見的感染類型。P2X7受體是所有P2受體中與炎癥關(guān)系最密切的，在幾乎所有的先天性免疫和獲得性免疫的免疫細(xì)胞表面都有表達(dá)[61]。其中重組蛋白炎癥小體與P2X7受體關(guān)系密切，但是具體的產(chǎn)生機(jī)制不明確。P2X7受體與艾滋病(HIV)的傳播有一定關(guān)系。因?yàn)槠淇赡芡ㄟ^刺激自分泌ATP，激活P2X7受體，促進(jìn)攜帶艾滋病毒的微囊泡釋放[70]。在治療新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)的患者中，由于其與炎癥因子的密切相關(guān)性，所以P2X7受體是未來治療該疾病感染患者的一個新靶點(diǎn)[71]。

5.P2X7受體研究展望：P2X7受體是一種廣泛分布在多種細(xì)胞表面的離子通道，對體內(nèi)的多種生理過程和病理過程都發(fā)揮作用。P2X7受體越來越被認(rèn)為是一種與炎癥相關(guān)的有前景的治療靶點(diǎn)；許多P2X7受體抑制劑已被宣布在臨床試驗(yàn)中應(yīng)用[72]。許多P2X7受體拮抗劑也用于骨質(zhì)疏松癥的治療，如A-438079用于動物研究的實(shí)驗(yàn)中[73]。葛根素是葛根的主要成分，是一種異黃酮，可以通過抑制P2X7受體的表達(dá)抑制IL-1的釋放[74]。丹參酮II-A磺酸鹽(TIIAS)是丹參的主要成分，能在低摩爾濃度下完全阻斷P2X7受體介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流，從而改變離子電流，可治療一些P2X7受體相關(guān)疾病。淫羊藿可以使P2X7受體基因的表達(dá)上升，抑制骨形成，刺激成骨細(xì)胞分化，增加礦化[75]。這些藥物被認(rèn)為可以通過激活P2X7受體的功能治療骨質(zhì)疏松。

但是，未來仍然有許多問題需要更深入的研究。首先，雖然對P2X7受體介導(dǎo)的骨代謝調(diào)控進(jìn)行了許多研究，但P2X7受體在成骨細(xì)胞中的全功能作用尚未完全闡明，一直存在爭議；因此需要進(jìn)一步闡明P2X7受體功能與炎性骨丟失之間的關(guān)系。P2X7受體是骨質(zhì)疏松癥的一個新興和重要的治療靶點(diǎn)，特別是在運(yùn)動治療中，是否有可能通過運(yùn)動改善體內(nèi)炎癥，從而改善骨質(zhì)疏松癥的治療效果，還有待進(jìn)一步探討；有類似文章也指出了這個問題[16]。未來需要我們進(jìn)一步更深入的研究P2X7受體在疾病中的作用，通過臨床實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這一新靶點(diǎn)治療疾病的有效性。其次，雖然很多研究證實(shí)了P2X7受體在很多骨科疾病中發(fā)揮作用，但是由于P2X7受體的高多態(tài)性會導(dǎo)致了治療效果和研究結(jié)果的差異性。這對發(fā)揮P2X7受體的治療作用價值有巨大的影響作用。因此，需要進(jìn)一步研究確定P2X7受體發(fā)揮作用的主要功能結(jié)構(gòu)，研發(fā)靶向治療的藥物，減少非靶向治療藥物的不良反應(yīng)。更深入的了解P2X7受體的結(jié)構(gòu)和生理學(xué)功能有助于更有效的治療疾病。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突