高通量測序技術(shù)在病原體檢測中的臨床應(yīng)用進(jìn)展

盧美伊， 朱志軍， 胡開明， 朱 梅

病原體檢測對(duì)臨床診斷與治療有著重要指導(dǎo)意義。當(dāng)前臨床病原學(xué)診斷方法主要有培養(yǎng)法、鏡檢法、PCR法、免疫學(xué)方法（包括熒光法、ELISA法、層析法）和測序技術(shù)等，其中以培養(yǎng)法結(jié)果陽性為“金標(biāo)準(zhǔn)”。但依賴傳統(tǒng)方法仍有許多感染性疾病被漏診。幾乎所有的感染性疾病病原體都含有 DNA 或 RNA 基因組，因此基因組測序成為了病原體檢測的一種極佳方法。這種新興的方法正在改變臨床醫(yī)師診斷感染性疾病的方式，其應(yīng)用范圍涉及廣泛的領(lǐng)域，包括微生物組學(xué)、抗生素耐藥性[1]。測序技術(shù)的不斷發(fā)展大大提高了病原體的檢出率，本文主要討論第二代測序技術(shù)在病原體檢測方面的應(yīng)用。

1 測序技術(shù)概述

1976年，Sanger等[2-3]報(bào)道了一種測定DNA中核苷酸序列的方法，并于1977年測定了噬菌體?X174的基因組序列，自此病原體檢測進(jìn)入了基因組學(xué)時(shí)代，這種方法被稱為第一代測序技術(shù)。但其測序成本高且通量較低，嚴(yán)重影響了這一技術(shù)的大規(guī)模推廣使用。

2005年，新一代測序技術(shù)的出現(xiàn)開啟了宏基因組學(xué)領(lǐng)域。二代測序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS），也稱下一代測序技術(shù)，可以同時(shí)讀取百萬到數(shù)十億條核酸序列，理論上能夠分析一個(gè)臨床或環(huán)境樣本的所有基因序列。在隨后的十年中，在可用測序儀器激增和測序成本下降的形勢下，NGS已儼然成為檢測患者臨床樣本中的微生物并進(jìn)行分類的一個(gè)有效技術(shù)平臺(tái)[4]。毫無疑問，測序技術(shù)已經(jīng)改變了生物醫(yī)學(xué)研究，越來越多可用的生物體全基因組序列測序是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的一個(gè)有價(jià)值的工具[5]。到目前為止，許多研究都表明了NGS在臨床和公共衛(wèi)生等領(lǐng)域發(fā)揮了巨大作用，比如2019年底暴發(fā)的不明原因肺炎疫情便是借助NGS從患者肺泡灌洗液樣本中獲得了病原體基因組序列，進(jìn)而通過分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增、對(duì)比等方法確定了病原體是結(jié)構(gòu)與SARS冠狀病毒極為相似的新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）[6]。NGS已成為感染性疾病精準(zhǔn)診斷與治療的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素，有助于實(shí)現(xiàn)患者的精準(zhǔn)與個(gè)體化診療。

第三代測序技術(shù)（third generation sequencing technology）也稱單分子實(shí)時(shí)測序技術(shù)，其特點(diǎn)是讀長較長，且在進(jìn)行DNA測序時(shí)不需要經(jīng)過PCR擴(kuò)增，而是對(duì)每一條DNA分子進(jìn)行單獨(dú)測序。但就目前實(shí)際應(yīng)用來說，第二代測序技術(shù)仍處于主流地位。

2 高通量測序技術(shù)在不同感染中病原體檢測上的應(yīng)用

2.1 中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染

中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的潛在病原體很多，腦脊液（CSF）是臨床上診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的主要樣本。CSF在側(cè)腦室脈絡(luò)叢生成，存在于腦室及蛛網(wǎng)膜下腔中，盡管臨床上已有不少診斷性檢測技術(shù)，但在某些情況下仍然會(huì)遺漏一些病原體。早在2008年就有學(xué)者報(bào)道使用GSL FLX平臺(tái)，在移植術(shù)后患者的CSF中檢測出沙粒病毒的病例[7]；2013年，兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室通過PCR和Sanger測序證實(shí)了1例反復(fù)發(fā)熱、頭痛、畏光等癥狀入院的患兒CSF中鉤端螺旋體的存在，這是1例罕見的、由神經(jīng)鉤端螺旋體引起的急性發(fā)作后持續(xù)感染數(shù)月的慢性病例[8]；2016年，越南胡志明市牛津大學(xué)臨床研究中心第一次在尿液中通過深度測序檢測到乙腦病毒，隨后通過RT-PCR和血清學(xué)證實(shí)[9]。這些報(bào)道證明了宏基因組二代測序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）能夠?yàn)榕R床中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染提供有價(jià)值的診斷信息，準(zhǔn)確的診斷可以指導(dǎo)合適的靶向抗生素治療，促進(jìn)患者的最終康復(fù)。許多學(xué)者進(jìn)行了一系列小樣本量研究[10-12]，探討NGS用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的臨床價(jià)值，結(jié)果顯示mNGS的診斷靈敏度、特異度、Youden指數(shù)都較傳統(tǒng)病原學(xué)檢測高，且根據(jù)送檢CSF病原體mNGS的客觀標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分，mNGS的陽性準(zhǔn)確率隨著評(píng)分的增加呈升高趨勢。雖然mNGS已經(jīng)顯示出診斷臨床中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的能力，但是作為新一代檢測手段，它仍然不能取代培養(yǎng)法的必要性，二者的相互補(bǔ)充可進(jìn)一步提高確診率。

2.2 呼吸道感染

肺臟是人類呼吸的主要器官，肺炎是一種常見的感染。肺部感染一經(jīng)診斷通常會(huì)使用抗生素進(jìn)行治療，這便限制了傳統(tǒng)培養(yǎng)法的使用。痰液和支氣管肺泡灌洗液（BALF）是肺部感染病原體檢測的主要樣本，BALF是通過纖維支氣管鏡對(duì)深部肺段（支氣管以下的肺段、亞肺段水平）用無菌生理鹽水進(jìn)行反復(fù)灌洗、回收獲取的肺泡表面襯液樣本。因此BALF的病原學(xué)檢查在呼吸系統(tǒng)疾病（尤其是下呼吸道疾?。┑脑\斷、指導(dǎo)用藥、療效觀察及預(yù)后判斷等方面有著重要的意義。mNGS采用定量檢測的方法鑒定病原體[13]，臨床研究也證實(shí)了其相對(duì)于傳統(tǒng)方法的臨床效用[14-19]。此外，NGS的高通量和大規(guī)模測序可同時(shí)檢測出細(xì)菌、真菌、病毒，特別是對(duì)于病毒和真菌感染[20]，因此該技術(shù)在肺部混合感染上顯示出了獨(dú)特的優(yōu)勢[17]。更廣的病原體檢測譜還有利于細(xì)菌多樣性分析，臨床上下呼吸道感染通常是微生物群和宿主之間相互作用導(dǎo)致，病原體并不只是一種單一的微生物[21]，一項(xiàng)用mNGS鑒定肺炎患者呼吸道病原體的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)培養(yǎng)證實(shí)感染的個(gè)體其呼吸道微生物組的多樣性明顯較低[22]，這一研究結(jié)果提示以微生物群為切入點(diǎn)或許可以為呼吸道感染的診斷和治療指引方向。

2.3 膿腫

膿腫多由微生物感染引起，表現(xiàn)為人體各器官或系統(tǒng)的局部組織壞死，盡管醫(yī)學(xué)診療在不斷發(fā)展，但仍有很大比例的患者預(yù)后不佳，導(dǎo)致功能受限甚至殘疾（如骨關(guān)節(jié)膿腫），生活質(zhì)量低下?？焖?、準(zhǔn)確地鑒定臨床膿腫樣本中的病原菌，對(duì)臨床醫(yī)師準(zhǔn)確選擇抗菌藥物進(jìn)行治療具有重要指導(dǎo)意義。全宏基因組鳥槍法測序（wholemetagenomeshotgun sequencing，WMGS） 在 2018年被用于檢測1例布魯氏菌肝膿腫6年后臨床復(fù)發(fā)的病例，該病例血液和膿腫液培養(yǎng)陰性，但WMGS數(shù)據(jù)分析表明存在布魯氏菌[23]。NGS對(duì)微生物序列進(jìn)行無偏倚的檢測，可以在一個(gè)單一的標(biāo)準(zhǔn)化通用檢測中鑒定所有病毒、細(xì)菌和真菌，從而為膿腫患者的快速病因?qū)W診斷提供了強(qiáng)大的支持[19，24]。長遠(yuǎn)來看，該技術(shù)具有作為細(xì)菌培養(yǎng)、PCR或其他目前可用的檢測方法診斷膿腫病原菌的補(bǔ)充甚至替代的潛力。

2.4 血流感染

即使患者正在接受抗菌藥物治療，測序也可以檢測到病原體的DNA，這提高了mNGS用于診斷培養(yǎng)陰性的血流感染的可能性，如敗血癥、膿毒血癥等的診斷，且mNGS能識(shí)別更多的病原體[25-26]，特別是病毒感染，但是mNGS檢測到的病毒是致病性的還是攜帶的，目前尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[27]。在疑似血流感染的危重患者臨床診斷中，微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）方法有利于快速檢測常見的病原體和抗生素耐藥（antimicrobial resistance，AMR）基因，而mNGS檢測更適用于經(jīng)典微生物或分子診斷方法無法檢出的血流感染致病病原體[28]。

2.5 眼部感染

自上世紀(jì)90年代末以來，病原體PCR等分子診斷技術(shù)已經(jīng)改變了眼部感染的檢測方法[29]，NGS的出現(xiàn)亦引起了眼科學(xué)界的關(guān)注。在一項(xiàng)研究中，學(xué)者比較了宏基因組RNA測序（RNA-seq）和PCR檢測在診斷眼部感染方面的性能，發(fā)現(xiàn)使用RNA-seq可以準(zhǔn)確地識(shí)別疑似眼部感染患者的房水和玻璃體樣本中的常見和罕見病原體，并鑒定菌株[29]；另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)宏基因組RNA深度測序（metagenomic deep sequencing， MDS）可以準(zhǔn)確地檢測結(jié)膜炎的病原體，并在14%的病例中發(fā)現(xiàn)了Vittaforma角膜感染，突顯了其精準(zhǔn)診斷的潛力[30]。RNA測序是高度無偏性的，因此可以檢測到PCR無法識(shí)別的病毒，并可以識(shí)別非病毒病原體，如肺炎支原體和沙眼球菌，但PCR可以識(shí)別RNA-seq檢測不到的一些DNA病毒[31]。MDS可以通過生物信息學(xué)分析未培養(yǎng)的微生物的DNA/RNA，已用于臨床診斷中微生物病原體的鑒定，其中包括眼前段和后段疾病如角膜傳染病和眼內(nèi)炎，甚至用于眼內(nèi)淋巴瘤[32]。NGS有可能改善眼部感染的診斷，但實(shí)際的臨床效用還需要更多額外的研究來證實(shí)。

2.6 其他感染

除了上述器官或系統(tǒng)，NGS還可以幫助檢出感染性心內(nèi)膜炎患者切除的瓣膜中的病原菌[33]、胰腺炎患者外周血中的巨細(xì)胞病毒[34]等。這也提示臨床工作者，在診治疑似感染但傳統(tǒng)檢測為陰性或者懷疑是某些罕見感染的患者時(shí)，均可以考慮采用NGS的方法進(jìn)行協(xié)助診療。但NGS目前還存在假陽性的問題，在全面檢測樣本中微生物的同時(shí)并不能區(qū)分某些微生物是致病菌還是定植菌。

3 局限性

高通量測序技術(shù)推動(dòng)著精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展，但也表現(xiàn)出了一定的局限性，比如mNGS在診斷肺外結(jié)核中的作用不及在急性感染性疾病中的作用。Zhang等[35]的研究表明，對(duì)于少菌型肺外結(jié)核桿菌感染的病例，mNGS檢出率較低，為了獲得更豐富的結(jié)核性病原菌信息，需要更高的測序深度，而超深測序帶來的巨大測序成本和分析時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了許多醫(yī)院的承受能力。另一方面，NGS技術(shù)目前仍缺乏統(tǒng)一的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，存在假陽性率及假陰性率偏高、基因數(shù)據(jù)庫不完整、操作流程復(fù)雜繁瑣、低病原滴度水平樣本、檢測靈敏度低等問題，因此該技術(shù)尚不能作為常規(guī)檢測手段，只能作為傳統(tǒng)微生物檢測技術(shù)檢測病原體的一個(gè)重要補(bǔ)充方法。

4 結(jié)語

高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)是測序技術(shù)的一大發(fā)展，它的進(jìn)步與改良不斷適應(yīng)著當(dāng)下基礎(chǔ)、臨床以及公共衛(wèi)生等領(lǐng)域的需求。盡管現(xiàn)有的報(bào)道和研究大多數(shù)為個(gè)案報(bào)道和小樣本量研究，NGS尚存在讀長較短、缺乏公認(rèn)的判讀標(biāo)準(zhǔn)、測序結(jié)果與治療關(guān)系不明確等不足之處，但隨著測序技術(shù)及其應(yīng)用在不斷發(fā)展，較大規(guī)模的比較驗(yàn)證研究會(huì)更加完善，更多循證醫(yī)學(xué)證據(jù)完善后，高通量測序技術(shù)在病原體檢測中的臨床應(yīng)用價(jià)值將得到進(jìn)一步證實(shí)和提升。