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    黑木耳黑色素對缺鐵性貧血小鼠生理指標(biāo)及腸道菌群的影響

    2023-04-06 03:02:44楚福英李元敬
    食品科學(xué) 2023年5期
    關(guān)鍵詞:黑木耳黑色素菌群

    楚福英,王 淼,李元敬,諸 琳,雷 虹,*,馮 磊*

    (1.黑龍江大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心,黑龍江 哈爾濱 150500,2.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,黑龍江省寒地生態(tài)修復(fù)與資源利用重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150080;3.華南師范大學(xué)材料與新能源學(xué)院,廣東 汕尾 516600;4.黑龍江省林業(yè)科學(xué)院科研處,黑龍江 哈爾濱 150081)

    機體鐵元素攝入量不足或流失過多以及其他造血營養(yǎng)物質(zhì)的代謝不平衡是導(dǎo)致缺鐵性貧血(irondeficiency anemia,IDA)的主要原因[1-2]。IDA是世界上最常見的營養(yǎng)缺乏癥,它會影響人體的多個器官臟器,如肝臟、脾臟、結(jié)腸等,損害人體生理功能,嚴重影響人們的健康[3-4]??诜a鐵藥物是目前治療IDA的主要方法[5-6]。然而,大多數(shù)口服補鐵藥物副作用大,可能造成腸道損傷,進而影響胃腸道鐵元素的吸收[1,7]。因此,尋找更加安全有效的IDA治療新方法至關(guān)重要。

    黑木耳(Auricularia auricula)是我國分布廣泛且具有獨特的營養(yǎng)價值和保健功能的食用菌[8]。傳統(tǒng)中醫(yī)認為黑木耳具有養(yǎng)氣補血,治療氣血虧虛的功效,是優(yōu)質(zhì)的天然補血品,可以促進機體造血。黑木耳含有多種生物活性化合物,黑色素是其中的主要生物活性成分,其安全性高[9],且具有防輻射、抗腫瘤、抗氧化、提高機體免疫力等作用[10-11],在食品加工、化妝品開發(fā)、疾病的預(yù)防和治療等方面具有廣闊的應(yīng)用前景[12]。Wang Furong[13]和Lei[14]等的研究表明魷魚墨黑色素鐵可作為有效的潛在補鐵劑來治療IDA。

    腸道菌群及其產(chǎn)物對宿主的生長發(fā)育不可或缺,并且可以對腸道健康產(chǎn)生多方面的影響[15-16],因為腸道菌群不僅能夠調(diào)節(jié)胃腸道中的宿主生理過程,還可調(diào)節(jié)腸道外器官,如肝臟、大腦和免疫系統(tǒng)[17-19]。研究表明,IDA會使腸道菌群發(fā)生紊亂,并且低鐵條件被認為是導(dǎo)致微生物組成的重大變化的原因[20]。因此,對IDA動物腸道菌群的深入研究可能是治療IDA的關(guān)鍵。

    本研究通過構(gòu)建IDA小鼠模型,對模型組小鼠進行黑木耳黑色素灌胃實驗,記錄各組小鼠的體質(zhì)量變化,采用血細胞自動分析儀分析小鼠的血常規(guī)指標(biāo),通過高通量測序技術(shù)分析小鼠糞便微生物組成,探究黑木耳黑色素對IDA小鼠生理和腸道菌群的影響。

    1 材料與方法

    1.1 動物、材料與試劑

    45 只SPF級24 日齡雄性昆明小鼠(體質(zhì)量(14.0±1.7)g)購買自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(黑)2019-001,實驗動物使用許可證號為:SYXK(黑)2018-003。

    黑木耳(菌種保藏編號為CCTCC-HDXZ-1) 東寧黑木耳產(chǎn)業(yè)基地;鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇、乙酸乙酯、氯仿(均為分析純) 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;糞便基因組DNA提取試劑盒 生工生物工程(上海)股份有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Biologiclp粉碎機 飛利浦(珠海)有限公司;W201數(shù)控恒溫水浴鍋 上海申勝生物科技有限公司;LD15-2A高速離心機 北京醫(yī)用離新機廠;AB104-N分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;101-3A電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市通利信達儀器廠;1800i血細胞自動分析儀 日本Sysmex XT公司;N50 NanoDrop超微量分光光度計 廣州市康玨貿(mào)易有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 黑木耳黑色素的制備

    參考文獻[21]并稍作修改,從黑木耳中提取、純化黑色素。將烘干后的黑木耳經(jīng)粉碎機粉碎,過80 目篩。取25 g黑木耳粉末樣品,加入500 mL 3 mol/L鹽酸和1 L蒸餾水,70 ℃下水浴浸提1.0~1.5 h,在浸提液中加入質(zhì)量分數(shù)38.46% NaOH溶液直到有絮狀沉淀生成,充分溶解攪拌后,4 000 r/min離心10 min,取上清液,加入12 mol/L鹽酸至有黑色絮狀物出現(xiàn),4 000 r/min離心20 min,取沉淀,重復(fù)離心(4 000 r/min、20 min)2~3 次得到黑色素粗品。將黑色素粗品純化[21]后進行冷凍干燥,得到黑木耳黑色素樣品。

    1.3.2 小鼠建模與分組

    參照《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范實施手冊》[22]中的方法,選取45 只24 日齡昆明種雄性小鼠,適應(yīng)性飼喂1 周后,隨機分為2 組:對照組(15 只小鼠)、模型組(30 只小鼠)。模型組小鼠飼喂低鐵飼料、飲用超純水進行造模,造模2 周后小鼠尾部采血,采用血細胞自動分析儀測定小鼠血液中的血紅蛋白(hemoglobin,Hb)質(zhì)量濃度、紅細胞(red blood cell,RBC)計數(shù)、紅細胞比容(hematocrit,HCT)、平均紅細胞體積(mean corpuscular volume,MCV),實驗小鼠Hb質(zhì)量濃度不高于100 g/L即為造模成功。隨后將模型組小鼠隨機平均分為2 組:IDA組、IDA-M組(黑木耳黑色素治療組),每組15 只。IDA-M組灌胃200 mg/(kgmb·d)黑木耳黑色素,灌胃體積0.2 mL,IDA組灌胃0.2 mL超純水,兩組均采用低鐵飼料繼續(xù)喂養(yǎng)3 周,期間自由飲用超純水。造模和干預(yù)期間,對照組始終飼喂正常飼料并自由飲用去離子水。為避免外源鐵污染,實驗采用塑料籠體和非鐵質(zhì)籠蓋。自實驗開始,每周稱量小鼠體質(zhì)量。

    1.3.3 樣本采集

    最后1 次灌胃后,小鼠禁食不禁水24 h,收集0.5 g小鼠糞便立即裝入2 mL凍存管,-80 ℃保存,用于后續(xù)小鼠糞便微生物高通量測序分析。實驗結(jié)束時,采用眼球取血的方法收集小鼠血液,每只小鼠收集40 μL血液,加入360 μL肝素鈉生理鹽水溶液(50 μL肝素鈉注射液(2 mL 1.25萬單位)用生理鹽水定容至20 mL)用于血常規(guī)檢測。

    1.3.4 血常規(guī)指標(biāo)的測定

    采用血細胞自動分析儀檢測各組小鼠的血常規(guī)指標(biāo)(Hb質(zhì)量濃度、RBC計數(shù)、白細胞(white blood cell,WBC)計數(shù)、血小板(platelet,PLT)計數(shù)、HCT、MCV)。

    1.3.5 小鼠腸道菌群高通量測序

    取0.2 g小鼠糞便樣本,使用小鼠糞便基因組DNA提取試劑盒提取總DNA,然后使用NanoDrop超微量分光光度計檢測DNA的濃度和純度,將合格的DNA樣本保存于凍存管,經(jīng)液氮速凍后置于干冰中寄送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行高通量測序。采用Illumina Miseq PE250 /PE300進行16S rDNA測序,比較分析各組糞便菌群門和屬水平的組成,對小鼠腸道菌群進行Alpha多樣性指數(shù)分析和主成分分析(principal component analysis,PCA)。

    1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

    每組樣品重復(fù)測定3 次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)采用Excel軟件進行處理,采用Origin 2019軟件作圖,采用SPSS 23.0軟件進行t檢驗,比較組間顯著性差異,P<0.05和P<0.01分別代表差異顯著和差異極顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 IDA小鼠模型的建立

    飼喂2 周低鐵飼料進行IDA造模,造模結(jié)果如表1所示,血常規(guī)結(jié)果表明模型組小鼠的Hb質(zhì)量濃度降低至(94.30±3.84)g/L。同時,與對照組相比,模型組的RBC計數(shù)、HCT分別極顯著下降了39.1%、33.8%(P<0.01),MCV顯著下降了9.8%(P<0.05)。參照《常用醫(yī)藥研究動物模型》[23]中規(guī)定的IDA判斷依據(jù):Hb質(zhì)量濃度不高于100 g/L、RBC計數(shù)下降和MCV減小,本研究模型組小鼠表現(xiàn)出了明顯的貧血癥狀,表明本實驗造模成功。

    表1 缺鐵飲食造模結(jié)束時各組小鼠外周血液指標(biāo)結(jié)果Table 1 Routine peripheral blood indices of mice fed normal or lowiron diet for two weeks

    2.2 黑木耳黑色素對IDA小鼠體質(zhì)量的影響

    給小鼠飼喂低鐵飼料,飲用超純水2 周后,小鼠開始出現(xiàn)萎蔫不振、運動量減少、生長減緩等現(xiàn)象,灌胃黑木耳黑色素可顯著改善這一現(xiàn)象。如圖1所示,造模結(jié)束時模型組小鼠體質(zhì)量顯著低于對照組(P<0.05);黑色素干預(yù)結(jié)束時,IDA-M組的體質(zhì)量極顯著高于IDA組(P<0.01),而與對照組無顯著差異(P>0.05)。以上結(jié)果表明,黑木耳黑色素可以使IDA小鼠體質(zhì)量恢復(fù)正常水平,推測黑木耳色素干預(yù)改善了小鼠的消化功能。

    圖1 黑木耳黑色素對IDA小鼠體質(zhì)量的影響Fig.1 Effect of A.auricula melanin on body mass of IDA mice

    2.3 黑木耳黑色素對IDA小鼠血液指標(biāo)的影響

    IDA可以通過機體血象指標(biāo)的改變確定,其中主要以Hb質(zhì)量濃度、RBC計數(shù)最能反映機體是否處于IDA及其所處程度[24-25];另外,MCV和HCT也是診斷貧血的重要指標(biāo)[26];WBC計數(shù)可以反映機體的免疫功能[27];PLT可以反映機體的凝血能力[28],以上指標(biāo)均具有較高的臨床診斷評估價值。各組小鼠的血常規(guī)結(jié)果如圖2所示。灌胃黑木耳黑色素3 周后,IDA-M組小鼠的Hb質(zhì)量濃度、RBC計數(shù)、HCT、MCV相對于IDA組分別極顯著或顯著升高了93.06%(P<0.01)、72.28%(P<0.01)、65.39%(P<0.01)、18.52%(P<0.05),與對照組相應(yīng)指標(biāo)的水平相近,說明黑木耳黑色素可使IDA小鼠貧血指標(biāo)恢復(fù)正常,從而改善IDA;IDA-M組小鼠的WBC計數(shù)相對于IDA組顯著升高了68.83%(P<0.01),說明黑木耳黑色素可使IDA小鼠WBC數(shù)目恢復(fù)至正常水平,提高IDA小鼠的免疫力,降低結(jié)腸炎癥發(fā)生的概率;IDA-M組小鼠的PLT計數(shù)相對于IDA組顯著降低了32.16%(P<0.05),說明黑木耳黑色素可有效減少IDA小鼠PLT數(shù)目,從而降低血液凝固帶來的風(fēng)險。

    圖2 黑木耳黑色素對IDA小鼠血液指標(biāo)的影響Fig.2 Effect of A.auricula melanin on blood indices of IDA mice

    2.4 黑木耳黑色素對IDA小鼠腸道菌群多樣性的影響

    宿主與腸道微生物之間存在動態(tài)平衡,結(jié)腸組織損傷所引起的屏障功能喪失往往伴隨著腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變,課題組前期研究表明IDA小鼠存在腸道損傷[29],而IDA對腸道菌群的影響鮮有研究。為進一步揭示腸道菌群與IDA的關(guān)系,本研究通過高通量測序分析腸道菌群多樣性的變化。如圖3所示,IDA組小鼠的Shannon、Chao1和Ace指數(shù)均極顯著低于對照組和IDA-M組(P<0.01);IDA-M組小鼠的上述指數(shù)均恢復(fù)至正常水平;此外,低鐵飲食可導(dǎo)致Simpson指數(shù)極顯著升高(P<0.01),補充黑木耳黑色素極顯著緩解了IDA小鼠腸道菌群Simpson指數(shù)變化(P<0.01)。表明IDA會導(dǎo)致小鼠腸道菌群多樣性降低,補充黑木耳黑色素可顯著改善并恢復(fù)IDA小鼠腸道菌群多樣性。

    圖3 黑木耳黑色素對IDA小鼠腸道菌群Alpha多樣性指數(shù)的影響Fig.3 Effect of A.auricula melanin on alpha-diversity indices of intestinal flora in IDA mice

    為進一步確認黑木耳黑色素改善IDA小鼠腸道菌群失衡的現(xiàn)象,利用PCA和Venn圖分析黑木耳黑色素對IDA小鼠腸道菌群的修復(fù)作用。如圖4A所示,PCA結(jié)果表明對照組和IDA-M組位置相近,與IDA組顯著分開,說明對照組和IDA-M組的腸道菌群結(jié)構(gòu)相似度較高,且均與IDA組的菌群結(jié)構(gòu)存在明顯差異,表明黑木耳黑色素對IDA小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)具有改善作用。Venn圖可以用來統(tǒng)計樣本中共有和獨有的分類操作單元(operational taxonomic unit,OTU)的數(shù)目,直觀展現(xiàn)出不同環(huán)境樣品中OTU數(shù)目組成相似性及重疊情況[30]。由圖4B可知,3 組樣本的共有OTU數(shù)目有130 種,IDA組獨有OTU數(shù)目最少,僅174 種,灌胃黑木耳黑色素后獨有OTU數(shù)目提升至233 種。由此可見,黑木耳黑色素可以增加IDA小鼠腸道菌群的獨有OTU數(shù)目,增加腸道菌群多樣性。

    圖4 各組小鼠腸道菌群PCA圖(A)和Venn圖(B)Fig.4 Principal component analysis (PCA) plot (A) and Venn diagram (B)of gut microbiome in mice from three groups

    2.5 黑木耳黑色素對IDA小鼠腸道菌群群落組成的影響

    IDA是常見的鐵營養(yǎng)缺乏性疾病,是世界范圍內(nèi)主要的公共衛(wèi)生問題之一。研究表明,嬰幼兒IDA與腸道菌群有關(guān)[20],而且腸道菌群可通過代謝產(chǎn)物增加鐵蛋白的表達,以抑制宿主的腸道鐵吸收[31],表明腸道菌群或可作為鐵失調(diào)的治療靶點。因此IDA的防治需要更加重視腸道菌群的作用。黑木耳黑色素對IDA小鼠腸道菌群組成的影響如圖5、6所示。小鼠腸道菌群中門水平的優(yōu)勢菌門分別是擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和變形菌門(Proteobacteria),占小鼠腸道菌群的99%以上(圖5A)。當(dāng)補充黑木耳黑色素后,IDA-M組的Firmicutes和Verrucomicrobia相對豐度相對于IDA組分別明顯增加了29.72%和2 794.12%,Bacteroidetes和Proteobacteria分別明顯降低了20.80%和13.03%,與對照組相比已無明顯差異。Pereira等[32]研究也表明,Bacteroidetes、Firmicutes、Proteobacteria是補充納米鐵(III)或硫酸亞鐵前后IDA小鼠糞便微生物群中的主要菌群。Muleviciene等[20]發(fā)現(xiàn)IDA患者會腸道中Bacteroidetes和Proteobacteria富集,Verrucomicrobia相對豐度降低,與本研究結(jié)果一致。說明黑木耳黑色素可以緩解由IDA引起的主要優(yōu)勢菌門的變化,并使之恢復(fù)至正常水平。

    圖5 各組小鼠糞便樣本中主要門和屬水平菌群組成Fig.5 Composition of intestinal flora in three groups of mice at the phyla and genus levels

    屬水平上相對豐度前10 位菌屬為小鼠腸道微生物優(yōu)勢菌屬(圖5B)。由圖6可知,與對照組相比,IDA組小鼠腸道中的Akkermansia、Alistipes、未分類的屬、Falsiporphyromonas、Coprobacter相對豐度分別極顯著或高度顯著降低了97.43%(P<0.001)、54.01%(P<0.01)、59.13%(P<0.01)、91.32%(P<0.001)、98.26%(P<0.01);條件致病菌Parabacteroides相對豐度極顯著增加了433.12%(P<0.01)。補充黑木耳黑色素后,與IDA組相比,IDA-M組小鼠腸道中的Akkermansia、Alistipes、未分類的屬、Falsiporphyromonas、Coprobacter相對豐度分別顯著增加了3 080.88%(P<0.001)、216.61%(P<0.001)、104.36%(P<0.05)、521.21%(P<0.05)、6 520.00%(P<0.01);Parabacteroides相對豐度極顯著降低了89.57%(P<0.01)。最新的研究表明乳桿菌屬可感知腸道中的鐵水平,并抑制宿主的鐵吸收;而鐵失衡會導(dǎo)致腸道菌群的改變,進而改變微生物多樣性,增加病原體相對豐度并誘導(dǎo)腸道炎癥的發(fā)生發(fā)展[31]。

    圖6 黑木耳黑色素對IDA小鼠腸道屬水平差異微生物相對豐度的影響Fig.6 Effect of A.auricula melanin on relative abundance of differential intestinal microorganisms in IDA mice at the genus level

    哺乳動物腸道中的Akkermansia屬微生物均為嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila),這是一種潛在益生菌[33-34],其相對豐度與炎癥水平呈負相關(guān)[35-36];課題組前期的研究也表明IDA可引起小鼠結(jié)腸炎癥損傷[29],由此推測,與對照組小鼠相比,IDA小鼠Akkermansia muciniphila相對豐度顯著降低,而補充黑木耳黑色素后顯著提高了小鼠腸道Akkermansia muciniphila的相對豐度,表明Akkermansia muciniphila在黑木耳黑色素改善IDA過程中可能發(fā)揮重要作用,而這種作用可能與炎癥修復(fù)有關(guān)。

    Alistipes是擬桿菌門的一種革蘭氏陰性細菌,主要存在于健康人的腸道中,可代謝產(chǎn)生琥珀酸、乙酸、丙酸等短鏈脂肪酸,Dostal等[37]研究表明鐵缺乏會導(dǎo)致有益菌Alistipes相對豐度減少,與本實驗結(jié)果相似。先前的研究表明短鏈脂肪酸具有抗炎作用,由此推測Alistipes相對豐度降低會促使短鏈脂肪酸含量減少,這也可能是鐵缺乏加劇腸道損傷的原因。相反補充黑木耳黑色素顯著增加了Alistipes相對豐度,表明其在黑木耳黑色素改善IDA過程中同樣具有重要作用。Alistipes是一種從臨床樣本中分離出來的相對較新的細菌屬,盡管Alistipes在健康表型中發(fā)揮作用,但需要注意的是,Alistipe可能引起焦慮、抑郁癥等疾病[38]。因此,需要進一步有針對性地研究該屬在疾病和健康中的作用。

    本實驗結(jié)果表明IDA小鼠Falsiporphyromonas相對豐度高度顯著降低(P<0.001),補充黑木耳黑色素改善貧血狀況后Falsiporphyromonas相對豐度顯著增加(P<0.05)。目前關(guān)于Falsiporphyromonas的報道較少,有研究表明其與卟啉單胞菌屬基因序列相似度較高[39],且均為紫單胞菌科微生物。卟啉單胞菌是一種絕對需鐵菌[40],推測Falsiporphyromonas也具有相似的性質(zhì),可以通過Falsiporphyromonas相對豐度水平推測宿主的貧血狀況。

    Coprobacter菌屬可以降解膳食纖維,產(chǎn)生丙酸、丁酸等有益的短鏈脂肪酸[41],本實驗結(jié)果表明補充黑木耳黑色素極顯著提高了Coprobacter的相對豐度。Parabacteroides是人體核心菌群之一,Noble等[42]研究表明高糖飲食會導(dǎo)致Parabacteroides水平升高,而Parabacteroides水平越高,記憶缺陷則越明顯。本實驗結(jié)果表明缺鐵會導(dǎo)致Parabacteroides水平升高,補充黑色素則會顯著逆轉(zhuǎn)Parabacteroides的相對豐度,表明該菌在黑色素改善IDA的過程中起到與黑色素相反的作用。然而,Wang Kai等[43]的研究揭示了腸道共生菌Parabacteroides distasonis在調(diào)節(jié)糖脂代謝方面是一種潛在的新型抗代謝綜合征益生菌。因此,需要根據(jù)特定條件來判定Parabacteroides是否為致病菌。以上結(jié)果表明,補充黑木耳黑色素顯著提高有益菌的相對豐度,降低有害菌的相對豐度,表明腸道菌群在參與黑木耳黑色素改善貧血過程中具有重要作用,但其具體作用機制還有待進一步研究。

    3 結(jié) 論

    本實驗結(jié)果表明黑木耳黑色素可增加IDA小鼠體質(zhì)量,改善和恢復(fù)IDA小鼠貧血癥狀指標(biāo)Hb質(zhì)量濃度、RBC計數(shù)、HCT、MCV、WBC計數(shù)、PLT計數(shù),增加有益菌Akkermansia、Alistipes等菌屬相對豐度,降低條件致病菌Proteobacteria的相對豐度??傊?,黑木耳黑色素干預(yù)能夠恢復(fù)和改善IDA癥狀,腸道菌群可能在其中發(fā)揮重要作用,未來研究可以采用菌群剔除、糞菌移植并結(jié)合代謝組學(xué)技術(shù),進一步分析腸道菌群在黑木耳黑色素治療IDA中發(fā)揮作用的機制。

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