硒酸化乳清分離蛋白抗前列腺癌細(xì)胞活性

殷春雁，張 男，林 潔*，李燦鵬,*

（1.云南大學(xué)化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院，云南 昆明 650091；2.西南林業(yè)大學(xué)材料與化學(xué)工程學(xué)院，云南 昆明 650224；3.云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650091）

逐年上升的癌癥發(fā)生率和相關(guān)的死亡率令全人類(lèi)擔(dān)憂(yōu)[1]。隨著腫瘤細(xì)胞對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)療法和放射療法產(chǎn)生更強(qiáng)的抗性，含硒化合物的抗癌作用逐漸成為研究焦點(diǎn)[2-3]。含硒化合物包括無(wú)機(jī)硒（亞硒酸鹽、硒酸鹽）和有機(jī)硒化合物，兩者均表現(xiàn)出良好的抗癌作用。例如，無(wú)機(jī)硒中，亞硒酸鹽和亞硒酸鈉能較好地抵抗前列腺癌[4-5]、乳腺癌[6]、肺癌[7]、肝癌[8]、膀胱癌[9]、惡性膠質(zhì)瘤[10]、骨肉瘤[11]。有機(jī)硒中，硒代蛋氨酸[12]、甲基硒代半胱氨酸[13]、硒代半胱氨酸[14]、硒代胱氨酸[15]對(duì)各種癌細(xì)胞均具有良好的抑制作用。然而，體內(nèi)研究表明，無(wú)機(jī)硒化合物的毒性強(qiáng)于有機(jī)硒[10,16]。適中劑量（0.3～0.5 mg Se/kgmb）和飲食劑量（0.01 mg Se/kgmb）的亞硒酸鹽在體內(nèi)代謝為硒化物（Se2-），然后整合到蛋白質(zhì)中形成硒蛋白[17]。高劑量（＞0.5 mg Se/kgmb）的亞硒酸鹽會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性和遺傳毒性[2,18-21]，遺傳毒性可能導(dǎo)致基因突變，不應(yīng)長(zhǎng)期攝入高劑量的亞硒酸鹽[22]。然而，有機(jī)硒（如硒代氨基酸）在體內(nèi)能夠非特異地整合到蛋白質(zhì)中形成硒蛋白（如谷胱甘肽過(guò)氧化物酶）或代謝為低分子質(zhì)量的化合物[23]，更容易隨飲食攝入并在組織中保留[22,24-25]，并且表現(xiàn)出低細(xì)胞毒性和非遺傳毒性[15,22,25]。綜上所述，若將無(wú)機(jī)硒整合到蛋白質(zhì)中使之轉(zhuǎn)變?yōu)橛袡C(jī)硒蛋白，則可能兼具抗癌作用、低細(xì)胞毒性和非遺傳毒性的特點(diǎn)。干燥加熱法是一種新型、高效、綠色、環(huán)保、安全的食品改性方法[26-30]?；诖?，本實(shí)驗(yàn)以亞硒酸鈉和乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）為研究對(duì)象，采用干燥加熱法制備硒酸化乳清分離蛋白（selenated whey protein isolate，Se-WPI），并檢測(cè)Se-WPI對(duì)前列腺癌細(xì)胞的作用，旨在初步發(fā)掘可能會(huì)對(duì)癌癥具有預(yù)防、治療作用的功能食品。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

雄性昆明小鼠（體質(zhì)量（20±2）g）由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滇）2015-0004；使用許可證號(hào)：SYXK（滇）K2021-0002。

人前列腺癌細(xì)胞株LNCaP（CRL-1740）、DU145（HTB-81）均購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞資源中心。

WPI（蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)90%） 德國(guó)Müller公司；亞硒酸鈉（Na2SeO3）、二甲基硒 上海晶純?cè)噭┯邢薰尽?/p>

堿性蛋白酶（200 U/mg）、胃蛋白酶（USP級(jí)，1∶30 000）、胰凝乳蛋白酶（USP級(jí)，1 500 U/mg）上海源葉生物科技有限公司；鏈霉蛋白酶（7 000 U/g）上海阿達(dá)瑪斯試劑有限公司；改良型RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶（USP級(jí)，1∶2 500）溶液（1×） 美國(guó)HyClone公司；胎牛血清 美國(guó)Gibco公司；結(jié)晶紫、蘇木精-伊紅染色試劑盒、20 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、聚賴(lài)氨酸、層黏連蛋白、纖連蛋白、基底膜基質(zhì) 上海碧云天生物科技有限公司；Cell Counting Kit-8（CCK 8） 日本同仁化學(xué)研究所；BCA蛋白定量試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；多聚甲醛 無(wú)錫耐思生命科技股份有限公司；細(xì)胞DNA含量（細(xì)胞周期）即時(shí)檢測(cè)試劑盒江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）-Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒 美國(guó)BD公司；Caspase 3活力檢測(cè)試劑盒英國(guó)Abcam公司；Millicell細(xì)胞培養(yǎng)小室 北京明陽(yáng)科華生物科技有限公司；實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DZF-6050型真空干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；TG46離心機(jī) 長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司；DK-98-II型1KW萬(wàn)用電爐 天津泰斯特儀器有限公司；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇醫(yī)療儀器廠(chǎng)；T6新世紀(jì)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；F4500型熒光光度計(jì) 日本日立公司；CK40-F200倒置顯微鏡 日本Olympus公司；酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；Astell 040高壓滅菌鍋 日本Hirayama公司；血球計(jì)數(shù)板 上海求精生化試劑儀器有限公司；C6流式細(xì)胞儀 美國(guó)BD公司；半自動(dòng)生化分析儀 合肥金浩峰生物科技有限公司；Avance DRX500核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）儀 美國(guó)Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 干燥加熱法制備硒酸化乳清分離蛋白

采用Li Canpeng等[27-28]提出的干燥加熱法制備Se-WPI。配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2% WPI溶液，加入等質(zhì)量Na2SeO3，調(diào)節(jié)pH值為3.0，將上述溶液冷凍干燥72 h獲得固體，繼續(xù)在80 ℃干燥加熱24 h后溶解到適量蒸餾水中，置于截留分子質(zhì)量10 kDa透析袋中，在蒸餾水中透析48 h，以除去粗產(chǎn)品中所含未反應(yīng)的Na2SeO3，冷凍干燥，得到Se-WPI。以未作任何處理的天然WPI和干燥加熱但未經(jīng)硒酸化的乳清分離蛋白（dry heating whey protein isolate，DH-WPI）作為對(duì)照樣品。

1.3.2 Se-WPI中有機(jī)硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

Se-WPI中總硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定：采用2,3-二氨基萘熒光法[31]測(cè)定，稱(chēng)取20 mg Se-WPI于凱氏分解瓶中，分別加入高氯酸、濃硝酸、體積分?jǐn)?shù)30%過(guò)氧化氫溶液各1 mL，電爐上400 ℃加熱4 h使其分解完全，至瓶中溶液呈無(wú)色透明停止加熱，冷卻，加入2 mL去離子水，沸水浴煮沸20 min，冷卻后定容至10 mL。1 000 μg/mL硒標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)稀釋后配制硒質(zhì)量濃度依次為0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以硒質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算Se-WPI中總硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)（Set）。

Se-WPI中無(wú)機(jī)硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定：4 mL離心管中加入Se-WPI樣品5～6 mg，加入2 mL蒸餾水，再加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液，5 000 r/min離心20 min。取3 mL上清液于凱氏分解瓶中，其余步驟與總硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定相同，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算Se-WPI中無(wú)機(jī)硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)（Sei）。

有機(jī)硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)（Seo）按式（1）計(jì)算。

1.3.377Se-WPI的制備及77Se-NMR分析

參照Duddeck[32]的方法，準(zhǔn)確稱(chēng)量20 mg硒粉（77Se），加入3 mL體積分?jǐn)?shù)30%的硝酸溶液，沸水浴中加熱30 min后，用酒精燈加熱至白色結(jié)晶物生成，然后加入2 mL蒸餾水和60 mg WPI，調(diào)節(jié)pH值至3.0，冷凍干燥，將冷凍干燥后的產(chǎn)物在80 ℃下加熱24 h，然后溶解于4 mL蒸餾水中，6 000 r/min離心30 min，重復(fù)2～3 次，收集沉淀和上清液。上清液冷凍干燥，回收77Se。

將沉淀溶解在適量蒸餾水中，于0.3 mol/L NaCl溶液中透析24 h，再于蒸餾水中透析48 h，冷凍干燥，得到77Se-WPI。將77Se-WPI樣品15 mg溶于1 mL D2O中，然后將溶液裝入核磁管中。用融封法將二甲基硒封入毛細(xì)管中，再將該毛細(xì)管裝入核磁管中作為內(nèi)標(biāo)。采用NMR儀掃描得到77Se-NMR譜圖，掃描參數(shù)：溫度4 ℃、延遲時(shí)間范圍0.01～15 s。

1.3.4 Se-WPI中硒酸根穩(wěn)定性的測(cè)定

將一定質(zhì)量Se-WPI樣品溶解于50 mmol/L pH 7.0的Tris-HCl緩沖溶液中，使其終質(zhì)量濃度為2 mg/mL。用Britton-Robinson廣域緩沖溶液（H3PO4-HAc-H3BO3溶液，各溶質(zhì)濃度均為0.04 mol/L）和0.2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)樣品溶液至不同pH值（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11）。將調(diào)節(jié)pH值后的所有樣品溶液于37 ℃水浴24 h。取出蛋白樣品溶液，按體積比1∶1加入10% TCA溶液以沉淀蛋白，在3 000 r/min離心30 min，收集上清液。用2,3-二氨基萘熒光法[31]測(cè)定Se-WPI樣品溶液中上清液所含硒的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。Se-WPI中硒酸根穩(wěn)定性以脫硒率表示，脫硒率按式（2）計(jì)算。

1.3.5 Se-WPI消化率的測(cè)定

采用Li Canpeng等[33]的方法進(jìn)行蛋白質(zhì)消化實(shí)驗(yàn)。稱(chēng)取一定量的WPI、DH-WPI和Se-WPI溶于50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.0）中，使其質(zhì)量濃度均為2 mg/mL。邊攪拌邊加入一定體積的10 g/L不同蛋白酶溶液，蛋白質(zhì)與酶的最佳比例分別為堿性蛋白酶200∶1、胃蛋白酶50∶1、鏈霉蛋白酶100∶1、胰凝乳蛋白酶200∶1。分別在消化0、2、4、6、8、10、20 min時(shí)，各取2 mL溶液，加入2 mL 10% TCA溶液，混勻，3 000 r/min離心20 min，取上清液。采用Lowry法[34]測(cè)定上清液蛋白質(zhì)量濃度并計(jì)算氮質(zhì)量。蛋白消化率按式（3）計(jì)算。

1.3.6 Se-WPI抑制前列腺癌細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

1.3.6.1 LNCaP和DU145細(xì)胞的培養(yǎng)

LNCaP、DU145細(xì)胞均在改良型RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1 d更換一次培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞貼壁成致密單層（融合度達(dá)85%～95%）時(shí)，分瓶擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.3.6.2 WPI、Se-WPI、Na2SeO3抗LNCaP細(xì)胞增殖最佳作用水平的確定

用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）配制系列不同濃度的Se-WPI、WPI、Na2SeO3溶液，充分溶解后過(guò)0.22 μm濾膜以除去雜質(zhì)。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，采用2,3-二氨基萘熒光法[31]測(cè)定硒含量。加入不同終濃度的Se-WPI、WPI、Na2SeO3溶液培養(yǎng)LNCaP細(xì)胞24、48、72 h，根據(jù)細(xì)胞活力確定WPI、Se-WPI、Na2SeO3抗LNCaP細(xì)胞增殖最佳作用水平。

1.3.6.3 LNCaP和DU145細(xì)胞增殖率的測(cè)定

采用CCK-8法[35]檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。胰蛋白酶消化處理培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LNCaP、DU145細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液（LNCaP細(xì)胞5 000 個(gè)/mL、DU145細(xì)胞3 000 個(gè)/mL），按每孔100 μL接種于96 孔板，培養(yǎng)24 h。然后分別將Se-WPI、WPI、Na2SeO3用RPMI-1640完全培養(yǎng)基配制成一定濃度的溶液，每孔加入100 μL，PBS組為加入100 μL PBS，每組4 個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h及72 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處OD值，按式（4）計(jì)算細(xì)胞活力，并計(jì)算Se-WPI、WPI、Na2SeO3對(duì)LNCaP細(xì)胞半數(shù)抑制濃度（50% inhibition concentration，IC50）。

1.3.6.4 結(jié)晶紫染色觀察LNCaP細(xì)胞、DU145細(xì)胞克隆形成情況

12 孔板每孔中加入1 mL 5 000 個(gè)/mL LNCaP細(xì)胞或DU145細(xì)胞懸液，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，分別加入1 mL體積分?jǐn)?shù)1% PBS、6 μmol/L Na2SeO3和質(zhì)量濃度均為22 μg/mL的WPI和Se-WPI溶液（RPMI-1640完全培養(yǎng)基配制），繼續(xù)培養(yǎng)12 d。吸除舊培養(yǎng)基，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液固定10 min，蒸餾水洗滌2 min，換用新鮮蒸餾水再洗2 min，結(jié)晶紫染色10 min，用水充分洗滌，拍照，觀察兩種細(xì)胞形成集落的情況。

1.3.7 Se-WPI對(duì)前列腺癌細(xì)胞凋亡及黏附影響實(shí)驗(yàn)

1.3.7.1 LNCaP細(xì)胞周期檢測(cè)

參照朱孝峰等[36]的方法。6 孔板每孔中加入5×105個(gè)/mL LNCaP細(xì)胞懸液1 mL，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，分別加入1 mL含體積分?jǐn)?shù)1% PBS和不同終濃度的Na2SeO3、Se-WPI及WPI溶液，Na2SeO3終濃度分別為1.5、3.0 μmol/L，Se-WPI、WPI終質(zhì)量濃度均分別為6、11 μg/mL（Se-WPI對(duì)應(yīng)硒濃度分別為1.5、3.0 μmol/L），培養(yǎng)48 h。細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，末次洗滌時(shí)保留100 μL殘留液，將細(xì)胞輕輕吹打成單細(xì)胞懸液。取50 μL（含1×105個(gè)細(xì)胞）加入到試管底部，按細(xì)胞DNA含量（細(xì)胞周期）即時(shí)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，加入100 μL A液與細(xì)胞懸液輕輕混勻，盡量避免產(chǎn)生氣泡，室溫孵育10 min；再加入100 μL B液，操作同上，室溫孵育10 min；加入150 μL C液，操作同上，室溫避光孵育15 min。過(guò)200 目篩后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.7.2 LNCaP細(xì)胞率凋亡率檢測(cè)

參照孔憲濤[37]的方法，6 孔板每孔中加入5×105個(gè)/mL LNCaP細(xì)胞懸液1 mL，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，分別加入1 mL體積分?jǐn)?shù)1% PBS、3或6 μmol/L Na2SeO3、22 μg/mL WPI、22 μg/mL Se-WPI，（RPMI-1640完全培養(yǎng)基配制），培養(yǎng)48 h。用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，加入100 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞（5 000 個(gè)/mL），加入5 μL FITC-Annexin V和5 μL碘化丙啶（propidium iodide，PI），室溫避光孵育15 min，加入400 μL Binding Buffer，過(guò)200 目篩用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.7.3 Caspase-3活力的檢測(cè)

參照Philchenkov[38]的方法。當(dāng)培養(yǎng)瓶中細(xì)胞融合度約為70%時(shí)，吸除舊培養(yǎng)基，加入6 mL體積分?jǐn)?shù)0.5% PBS、1.5 μmol/L Na2SeO3和質(zhì)量濃度均為11 μg/mL WPI和Se-WPI溶液（RPMI-1640完全培養(yǎng)基配制），培養(yǎng)48 h。消化收集細(xì)胞（包括懸浮細(xì)胞），PBS洗滌兩次。每1×106～5×106個(gè)細(xì)胞加入50 μL預(yù)冷的細(xì)胞裂解緩沖液重懸細(xì)胞，冰浴10 min，10 000×g離心1 min，上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，分裝，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，將蛋白質(zhì)量濃度稀釋至4 mg/mL。于96 孔板每孔中加入45 μL蛋白樣品溶液，空白對(duì)照孔內(nèi)加入等體積雙蒸水，然后加入50 μL 2×Reaction Buffer（含10 mmol/L二硫蘇糖醇），5 μL 4 mmol/L Caspase 3顯色底物，37 ℃孵育2 h。用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。Caspase-3在1 min內(nèi)水解產(chǎn)生1 pmol對(duì)硝基苯胺為一個(gè)酶活力單位（U），Caspase-3活力單位為U/μg。

1.3.7.4 LNCaP細(xì)胞對(duì)基底膜成分黏附能力的測(cè)定

參照Busk等[39]的方法，96 孔板每孔中分別加入30 μL含1% BSA溶液（PBS配制，陰性對(duì)照）、3 μmol/L Na2SeO3、22 μg/mL WPI、22 μg/mL Se-WPI和質(zhì)量濃度均為30 μg/mL的層黏連蛋白、纖連蛋白和基底膜基質(zhì)溶液，37 ℃孵育1 h。PBS洗一次，加入1% BSA溶液于37 ℃環(huán)境中封閉30 min，吸除封閉液，PBS洗一次。每孔加入細(xì)胞懸液（LNCaP細(xì)胞5 000 個(gè)/mL、DU145細(xì)胞3 000 個(gè)/mL）100 μL，平行3 組，37 ℃孵育2 h。棄除培養(yǎng)基，PBS洗兩次，除去未結(jié)合的細(xì)胞，質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液固定10 min，蒸餾水洗滌2 min，換用新鮮的蒸餾水再洗2 min，結(jié)晶紫染色10 min，用蒸餾水充分洗滌，拍照并計(jì)數(shù)。按式（5）計(jì)算細(xì)胞黏附率。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS軟件，用方差分析法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用Origin 9軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Se-WPI中的硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)及77Se-NMR分析結(jié)果

pH 3.0、80 ℃干燥加熱24 h制備的Se-WPI中硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.09%。如圖1所示，在77Se-NMR譜中δ1 317處出現(xiàn)硒的吸收峰，與已報(bào)道的H2SeO3（δ1 300）[32]、NaHSeO3（δ1 308）[40]非常接近，說(shuō)明亞硒酸根與WPI發(fā)生了如下反應(yīng)[32]：P-OH+H2SeO3→P-OHSeO2+H2O（P表示蛋白），即H2SeO3與WPI的羥基形成酯，故硒以亞硒酸酯的形式存在于Se-WPI中。

圖1 Se-WPI的77Se-NMR譜Fig.1 77Se-NMR spectrum of Se-WPI

2.2 Se-WPI中硒酸根的穩(wěn)定性

如圖2所示，當(dāng)Se-WPI溶液pH值小于等于10.0，脫硒率較低，均低于3%，說(shuō)明Se-WPI中硒酸根的穩(wěn)定性很好；當(dāng)Se-WPI溶液pH值增大至11，脫硒率陡增至74.5%，表明強(qiáng)堿環(huán)境中Se-WPI上的硒酸根不穩(wěn)定。該結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了O型亞硒酸酯的存在[32,40]。

圖2 不同pH值下Se-WPI的脫硒率Fig.2 Rate of selenium removal from Se-WPI under different pH conditions

2.3 Se-WPI的消化性

蛋白被消化后會(huì)產(chǎn)生具有生物活性的肽，可以提高蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、安全性和生理保健功能[41]。一般蛋白質(zhì)保持原有結(jié)構(gòu)時(shí)很難被蛋白酶消化，但當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)經(jīng)過(guò)處理，結(jié)構(gòu)展開(kāi)，暴露出更多的酶切位點(diǎn)時(shí)，其消化性提高[27-28]。本實(shí)驗(yàn)采用堿性蛋白酶、胃蛋白酶、鏈霉蛋白酶和胰凝乳蛋白酶對(duì)WPI、DH-WPI和Se-WPI進(jìn)行消化。如表1所示，與WPI和DH-WPI相比，Se-WPI的消化性明顯提高?？赡苁且?yàn)樵诟稍锛訜釛l件下，硒酸化過(guò)程中WPI暴露出更多的酶切位點(diǎn)，因此Se-WPI的消化性明顯優(yōu)于WPI和DH-WPI。

表1 WPI、DH-WPI和Se-WPI的消化率Table 1 Digestibility of WPI, DH-WPI and Se-WPI%

2.4 Se-WPI對(duì)LNCaP、DU145細(xì)胞增殖的影響

2.4.1 Se-WPI對(duì)LNCaP、DU145細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

選擇雄激素依賴(lài)型的人前列腺癌細(xì)胞（LNCaP細(xì)胞）和雄激素非依賴(lài)型的人前列腺癌細(xì)胞（DU145細(xì)胞）兩種細(xì)胞株，加入不同水平受試藥物培養(yǎng)不同時(shí)間，評(píng)價(jià)WPI、Se-WPI和Na2SeO3對(duì)前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。

如圖3所示，通過(guò)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到WPI、Se-WPI、Na2SeO3抗LNCaP細(xì)胞增殖的最佳作用水平分別為WPI質(zhì)量濃度20 μg/mL，Se-WPI中蛋白質(zhì)量濃度20 μg/mL、其中硒濃度為5 μmol/L，Na2SeO3濃度5 μmol/L。如圖4所示，在最佳作用水平下，相同培養(yǎng)時(shí)間，Se-WPI、Na2SeO3對(duì)LNCaP細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性明顯強(qiáng)于DU145細(xì)胞，且Se-WPI對(duì)于兩種細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用均低于Na2SeO3。WPI對(duì)于兩種細(xì)胞活力均無(wú)明顯的抑制作用。如表2所示，相同作用時(shí)間下，Na2SeO3對(duì)LNCaP細(xì)胞的IC50均低于Se-WPI，而WPI本身沒(méi)有明顯抑制癌細(xì)胞增殖的活性。

表2 Se-WPI、Na2SeO3對(duì)LNCaP細(xì)胞的IC50Table 2 Fifty percent inhibition concentration (IC50) of Se-WPI and Na2SeO3 against LNCaP cells μmol/L

圖3 WPI、Se-WPI和Na2SeO3對(duì)LNCaP細(xì)胞活力的影響Fig.3 Comparison of the effects of WPI, Se-WPI and Na2SeO3 on cell viability of LNCaP cells

圖4 WPI、Se-WPI和Na2SeO3對(duì)LNCaP、DU145細(xì)胞活力的影響Fig.4 Comparison of the effects of WPI, Se-WPI and Na2SeO3 on cell viability of LNCaP and DU145 cells

2.4.2 Se-WPI對(duì)LNCaP、DU145細(xì)胞克隆形成的影響

在1% PBS、6 μmol/L Na2SeO3、22 μg/mL WPI、22 μg/mL Se-WPI條件下培養(yǎng)12 d后，兩種細(xì)胞形成集落的情況如圖5所示，Se-WPI、Na2SeO3處理組兩種細(xì)胞集落分散、疏松，進(jìn)一步證明Se-WPI、Na2SeO3對(duì)LNCaP細(xì)胞和DU145細(xì)胞生長(zhǎng)有一定抑制作用，且對(duì)LNCaP細(xì)胞的抑制作用強(qiáng)于DU145細(xì)胞，即LNCaP細(xì)胞對(duì)于硒化合物的抑制作用更為敏感。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中主要采用LNCaP細(xì)胞作為研究對(duì)象。

圖5 WPI、Se-WPI、Na2SeO3對(duì)LNCaP、DU145細(xì)胞克隆形成的影響Fig.5 Effects of WPI, Se-WPI, and Na2SeO3 on clones formation of LNCaP and DU145 cells

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，Se-WPI抑制LNCaP細(xì)胞增殖的效果明顯。雖然Se-WPI對(duì)LNCaP細(xì)胞增殖的抑制作用略低于Na2SeO3，然而，大量研究表明高劑量（＞0.5 mg Se/kgmb）的Na2SeO3會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性和遺傳毒性[2,18-21]，遺傳毒性可能導(dǎo)致基因突變，不應(yīng)長(zhǎng)期攝入高劑量的Na2SeO3[22]。而有機(jī)硒在體內(nèi)表現(xiàn)出低細(xì)胞毒性和非遺傳毒性[15,22,25]，更易隨飲食攝入并在組織中保留[22,24-25]。因此，本研究所制備Se-WPI可使硒由于從無(wú)機(jī)形態(tài)轉(zhuǎn)為有機(jī)形態(tài)，其生物安全性?xún)?yōu)于Na2SeO3。

2.5 Se-WPI對(duì)LNCaP細(xì)胞周期及凋亡的影響

細(xì)胞周期是指從一次細(xì)胞分裂結(jié)束開(kāi)始，經(jīng)過(guò)物質(zhì)積累，直到下一次細(xì)胞分裂結(jié)束為止[39]。凋亡細(xì)胞中DNA含量會(huì)減少，用PI對(duì)其進(jìn)行染色，PI熒光強(qiáng)度會(huì)降低。用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析時(shí)，在DNA直方圖中正常G0/G1細(xì)胞群前會(huì)出現(xiàn)凋亡細(xì)胞峰——亞二倍體峰（sub-G0/G1）。如圖6所示，不同水平WPI、Se-WPI和Na2SeO3對(duì)LNCaP細(xì)胞作用48 h時(shí)，體積分?jǐn)?shù)1% PBS處理下細(xì)胞生長(zhǎng)周期正常，有1.1%的細(xì)胞處于凋亡細(xì)胞峰。加入6、11 μg/mL的WPI處理相同時(shí)間，LNCaP細(xì)胞周期未受到影響，處于凋亡的細(xì)胞數(shù)基本不變。加入Se-WPI或Na2SeO3，細(xì)胞周期發(fā)生明顯變化，處于sub-G0/G1峰的細(xì)胞數(shù)明顯增多，且Na2SeO3處理后處于凋亡狀態(tài)的細(xì)胞分布比例明顯高于Se-WPI，Se-WPI或Na2SeO3對(duì)細(xì)胞周期的誘導(dǎo)呈劑量依賴(lài)性。

圖6 WPI、Se-WPI和Na2SeO3對(duì)LNCaP細(xì)胞周期的影響Fig.6 Effects of WPI, Se-WPI and Na2SeO3 on cell cycle in LNCaP cells

細(xì)胞凋亡由遺傳機(jī)制決定，受到嚴(yán)格的程序調(diào)控。正常情況下，磷脂酰絲氨酸位于細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡早期，磷脂酰絲氨酸從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到外側(cè)，暴露在細(xì)胞所處環(huán)境中。Annexin V是一種Ca2+依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋白，能與磷脂酰絲氨酸特異性結(jié)合。因此，細(xì)胞處于調(diào)亡或壞死狀態(tài)時(shí)，F(xiàn)ITCAnnexin V染色為陽(yáng)性。PI是一種不能透過(guò)完整細(xì)胞膜的核酸染料，但其能夠透過(guò)處在凋亡晚期和壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜，使細(xì)胞核染紅。因此，通過(guò)FITC-Annexin V與PI雙染可以區(qū)分正常、凋亡和壞死細(xì)胞[42]。如圖7、8所示，Se-WPI或Na2SeO3誘導(dǎo)LNCaP細(xì)胞發(fā)生凋亡，后者的誘導(dǎo)作用更強(qiáng)。培養(yǎng)48 h時(shí)，PBS組的細(xì)胞凋亡率為（0.95±0.07）%，而22 μg/mL Se-WPI組凋亡細(xì)胞比例達(dá)（6.95±0.64）%，是正常狀態(tài)的7 倍以上，3 μmol/L Na2SeO3組細(xì)胞凋亡率為PBS組的20 倍以上，WPI組無(wú)明顯變化。這說(shuō)明干燥加熱硒酸化修飾賦予WPI誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性。

圖7 WPI、Se-WPI和Na2SeO3對(duì)LNCaP細(xì)胞凋亡的影響Fig.7 Effects of WPI, SE-WPI and Na2SeO3 on apoptosis of LNCaP cells

圖8 WPI、Se-WPI和Na2SeO3對(duì)LNCaP細(xì)胞凋亡的影響Fig.8 Effects of WPI, Se-WPI and Na2SeO3 on apoptosis of LNCaP cells

Caspase-3可以特異性斷裂天冬氨酸殘基后的肽鍵，在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的作用[43]。Caspase-3常以酶原的形式存在于胞漿中，在細(xì)胞凋亡早期被激活，是早期凋亡細(xì)胞的標(biāo)志物?；罨腃aspase-3裂解相應(yīng)的胞漿和胞核底物，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[38]。如圖9所示，相對(duì)于PBS組，WPI對(duì)Caspase-3活力幾乎無(wú)影響，Se-WPI和Na2SeO3能夠明顯提高細(xì)胞內(nèi)Caspase-3活力。表明Se-WPI和Na2SeO3均可以通過(guò)活化Caspase-3蛋白，從而誘導(dǎo)LNCaP細(xì)胞凋亡。

圖9 WPI、Se-WPI和Na2SeO3對(duì)LNCaP細(xì)胞Caspase-3活力的影響Fig.9 Effects of WPI, Se-WPI and Na2SeO3 on caspase-3 activity in LNCaP cells

2.6 Se-WPI對(duì)LNCaP細(xì)胞對(duì)基底膜成分黏附能力的影響

轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的基本特征，而細(xì)胞黏附是腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中不可缺少的重要環(huán)節(jié)[39]。如圖10所示，WPI對(duì)LNCaP細(xì)胞的黏附能力基本沒(méi)有影響，與PBS組一致，而Se-WPI與Na2SeO3均可明顯降低LNCaP細(xì)胞對(duì)層黏連蛋白、纖連蛋白和基底膜基質(zhì)的黏附率，表明干燥加熱硒酸化改善了WPI的活性，使其具有硒的生物學(xué)功能。

圖10 WPI、Se-WPI和Na2SeO3對(duì)LNCaP細(xì)胞黏附能力的影響Fig.10 Effects of WPI, Se-WPI and Na2SeO3 on the adhesion of LNCaP cells to basement membrane components

以上實(shí)驗(yàn)從不同方面驗(yàn)證了Se-WPI具有與Na2SeO3相同的抑制LNCaP細(xì)胞凋亡的活性。含硒化合物的抗癌機(jī)制以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡為基礎(chǔ)[44]，此外，這些化合物也影響基因表達(dá)或各種細(xì)胞信號(hào)途徑，包括DNA修復(fù)/損傷、血管再生等[45]。研究表明，由Na2SeO3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，線(xiàn)粒體是主要的參與者[8,18]。Na2SeO3很容易擴(kuò)散進(jìn)入線(xiàn)粒體[20]，與線(xiàn)粒體內(nèi)還原型谷胱甘肽反應(yīng)產(chǎn)生過(guò)氧化物，進(jìn)一步引起細(xì)胞器表面蛋白質(zhì)的巰基被氧化。產(chǎn)生的過(guò)氧化物和被氧化的巰基打開(kāi)線(xiàn)粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔[8,46]，線(xiàn)粒體膜電位降低[8,9,20,46]，細(xì)胞色素釋放到細(xì)胞質(zhì)中[2,46]，激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[38,43]。本研究中，Se-WPI和Na2SeO3均能顯著提高細(xì)胞內(nèi)Caspase-3活力，推測(cè)Se-WPI誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑屬于Caspase依賴(lài)型[5,20,47]，具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用干燥加熱法成功將Na2SeO3整合到WPI中，得到Se-WPI，77Se-NMR和硒酸根穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Se-WPI中的硒以亞硒酸酯的形式存在。Se-WPI的消化性得到明顯改善；細(xì)胞毒性及集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Se-WPI與Na2SeO3類(lèi)似，都具有抑制LNCaP細(xì)胞、DU145細(xì)胞增殖的活性，且呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性，而WPI對(duì)兩種細(xì)胞的增殖沒(méi)有影響；LNCaP細(xì)胞對(duì)硒化合物的抑制作用較敏感；細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和Caspase-3活力檢測(cè)從不同角度驗(yàn)證Se-WPI具有誘導(dǎo)LNCaP細(xì)胞凋亡的作用；此外，Se-WPI還能夠抑制LNCaP細(xì)胞與基底膜成分的黏附。本研究結(jié)果初步表明，Se-WPI具備作為新型防癌抗癌有機(jī)補(bǔ)硒劑的潛力，但其抗癌機(jī)制以及細(xì)胞毒性和遺傳毒性等方面還需進(jìn)一步研究。