沙棘葉多酚的分離純化及其活性分析

武海麗，杜錦娥，路洋洋，李漢卿，張晟 ，李卓玉

（1.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006；2.特色植物資源研究與利用山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030006；3.山西大學(xué) 生物技術(shù)研究所，化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030006）

0 引言

沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.）是胡頹子科沙棘屬落葉性灌木或小喬木，我國沙棘原地栽培面積占全球栽培量的90%以上［1］。沙棘的各個(gè)部位均蘊(yùn)含有大量生物活性物質(zhì)，如多種氨基酸、甾醇類、黃酮類、多酚類物質(zhì)等。已有研究表明，沙棘葉中所含有的活性物質(zhì)在抗腫瘤、清除體內(nèi)自由基和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能等方面具有功能，進(jìn)而可用于防治部分慢性疾?。?-4］。沙棘中所含的多酚類化合物具有一定的抗氧化效果，能直接清除多種自由基。Elga等人比較了沙棘不同部位的抗氧化活性。結(jié)果表明，較于其他部位，沙棘葉表現(xiàn)出明顯的抗氧化作用［5］。此外，Upadhyay等研究發(fā)現(xiàn)沙棘葉提取物有清除自由基的效果，并用總抗氧化能力測定法，證明了其抗氧化作用［6］。沙棘葉中的提取物能夠提高免疫功能。金鐘研究發(fā)現(xiàn)，沙棘葉中的黃酮類化合物能夠提高小鼠腸道黏膜中IL-2和IL-4的表達(dá)，導(dǎo)致腸道免疫細(xì)胞的活性上升［7］。近年來的研究表明，沙棘葉中所含的黃酮類物質(zhì)能使多種腫瘤細(xì)胞的生長受到抑制，表現(xiàn)出良好的抗腫瘤作用。Kim等人發(fā)現(xiàn)沙棘葉提取物可以降低ROS的基礎(chǔ)水平，進(jìn)而抑制C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，并通過促進(jìn)Bax的表達(dá)促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡［8］。

多酚類物質(zhì)，是指分子結(jié)構(gòu)中含多個(gè)酚羥基的植物成分，包括黃酮類化合物、多酚類化合物和水解單寧等［9］。根據(jù)結(jié)合方式的不同，植物多酚可分為自由酚/游離酚和結(jié)合酚［10］。自由酚是指能夠溶于水或非極性溶劑的酚類，而結(jié)合酚則多指以糖苷鍵、酯鍵、醚苷鍵等結(jié)合蛋白質(zhì)和纖維素等不溶性的一類多酚［11］，需采用堿、酸或酶降解的方式進(jìn)行提取。國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)沙棘果和葉中的多酚類物質(zhì)占沙棘總多酚的絕大部分，其中沙棘葉中所含的多酚類物質(zhì)是果實(shí)中的十多倍［12］。目前，對(duì)沙棘葉中自由酚的提取和其藥理作用研究較多，但對(duì)沙棘葉中結(jié)合酚的組成和功能研究較少。以往的研究表明，結(jié)合酚經(jīng)腸道菌群發(fā)酵后比自由酚具有更強(qiáng)的生物活性［13］。因此，本研究以沙棘葉為研究對(duì)象，對(duì)其中的自由酚和結(jié)合酚進(jìn)行分離、純化，并檢測其在抑制腫瘤細(xì)胞增殖中的作用，以期促進(jìn)我省野生沙棘資源的深度開發(fā)和利用。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

新鮮中國沙棘葉采自山西呂梁，清洗后晾干保存；MTT（5-二苯基四氮唑溴鹽）于北京索萊寶科技公司購買；DMSO（Dimethyl Sulfoxide，二甲基亞砜）、乙醇（Ethyl Alcohol）、氫氧化鈉（Sodium hydroxide）、濃鹽酸（Concentrated hydro?chloric acid）、乙酸乙酯（Ethyl acetate）、福林酚試 劑（Folin-Ciocalteu）、SDS（Sodium Dodecyl Sulfate，十二烷基硫酸鈉）、BSA（Bovine Serum Albumin，牛血清白蛋白。1 μg/μL）、沒食子酸、胰蛋白酶購買自碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 沙棘葉中自由態(tài)多酚及結(jié)合態(tài)多酚的提取

稱取10 g沙棘葉并粉碎，按照料液比1∶10（W/V）分別加入超純水及80%（V/V）的不同有機(jī)溶劑：乙酸乙酯、乙醇、甲醇、丙酮，置于4 ℃攪拌40 min，5000 r/min低溫離心10 min后收集殘?jiān)绱酥貜?fù)2次，合并兩次所得的上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)行濃縮，此步收集的為自由態(tài)多酚。將提取自由態(tài)多酚后所得的殘?jiān)殖蓛煞?，分別采用酸（甲醇：硫酸=1∶10，V/V）或堿（2 mol/L 氫氧化鈉）室溫水解24 h，然后將pH調(diào)至中性，多次加入相同體積的乙酸乙酯脫脂，離心后吸取水相得到的為結(jié)合態(tài)多酚，提取過程如圖1。

1.3 總酚含量測定

總酚含量用福林酚比色法測定［14］。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別將標(biāo)準(zhǔn)品沒食子酸用超純水以0、20、60、100、150、200、300、400、500 和 600 μg/mL的濃度梯度制備成終體積為0.5 mL的標(biāo)準(zhǔn)液；對(duì)于待測樣品，另取一支試管，加入0.1 mL樣品和0.4 mL超純水，同樣使得終體積為0.5 mL。隨后上述各試管再加入0.1 mL的Folin-Ciocalteu試劑于室溫放置6 min。接著加入1 mL 7% Na2CO3試劑（W/V）和0.8 mL超純水，混勻靜置，90 min后用紫外-可見分光光度計(jì)在760 nm處測定并記錄吸光度值（optical density，OD值）。

1.4 黃酮含量測定

黃酮含量用硝酸鋁顯色法測定［15］。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別將標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁配制成0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和 0.6 mL 的標(biāo)準(zhǔn)液；對(duì)于待測樣品，另取一支試管，加入0.1 mL樣品，用超純水補(bǔ)齊體積到0.6 mL，然后加入質(zhì)量體積百分比為 5% 亞硝酸鈉和 10% AlCl3‘H2O（W/V）各0.1 mL，靜置6 min后再加入1 mL的4% 氫氧化鈉（W/V），反應(yīng)15 min后于510 nm處測定其OD值。

1.5 單寧含量測定

單寧含量用香草醛法測定［16］。分別在0、80、160、240、320和 400 μg/mL 的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液及待測樣品中加入1.5 mL 4 %的香草醛（V/V）及0.75 mL的濃鹽酸，室溫避光靜置15 min后，用紫外-可見分光光度計(jì)于500 nm處測定并記錄其OD值。

1.6 大孔樹脂純化多酚

選擇三種不同極性的大孔樹脂HPD500、HPD600和HPD722對(duì)沙棘葉多酚進(jìn)行初步純化，各大孔樹脂的功能參數(shù)如表1所示。對(duì)于新的大孔樹脂，首先采用無水乙醇充分浸泡一天后，再使用超純水清洗，直至洗出液澄清且無乙醇味為止。

然后將適量多酚提取物與大孔樹脂置于錐形瓶中，為使多酚與大孔樹脂充分結(jié)合，將錐形瓶放入搖床，150 r/min過夜振蕩。將多酚-大孔樹脂復(fù)合物轉(zhuǎn)移至50 mL離心管，離心收集上清，即為平衡液；對(duì)于沉淀，首先用超純水沖洗去除未吸附的多酚，然后使用不同濃度梯度的乙醇洗脫大孔樹脂，收集得到梯度洗脫液，并根據(jù)以下公式計(jì)算吸附量（Q）與解析率（D）。其中，Q：吸附量（mg/g）；D：解吸率（%）；C0：起始濃度（mg/mL）；C1：平衡液濃度（mg/mL）；V1：吸附液體積（mL）；W：樹脂重量（g）；C2：解吸液中多酚含量（mg/mL）；V2：解吸液體積（mL）。

1.7 細(xì)胞培養(yǎng)及MTT法測定細(xì)胞活力

人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，并放于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。MTT法參照標(biāo)準(zhǔn)的方法并進(jìn)行改進(jìn)［17］，HCT-116以每孔 6×103個(gè)細(xì)胞的密度進(jìn)行孵育，待其貼壁后，用不同濃度的多酚以時(shí)間梯度為24 h、48 h進(jìn)行處理。此后，在96孔板的細(xì)胞中加入20 μL包含5 mg/mL MTT的培養(yǎng)基，并放于37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄除培養(yǎng)基后加入150 uL的DMSO。用搖板機(jī)震蕩混勻后，使用酶標(biāo)儀（型號(hào)為Infinite F50），在570 nm處測定其吸光度。細(xì)胞存活率通過公式計(jì)算：（OD570-處理組/OD570-對(duì)照組）×100%。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)來源于3次以上重復(fù)實(shí)驗(yàn)，并用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示；在SPSS 19.0軟件中采用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異分析。

2 結(jié)果

2.1 各溶劑對(duì)沙棘葉自由態(tài)多酚含量的提取差異

分別繪制標(biāo)準(zhǔn)品沒食子酸、蘆丁、兒茶素的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2），并根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算不同溶劑所提取的沙棘葉中總多酚、黃酮和縮合單寧的含量。

由表2可知，提取得到的總酚含量依次為：80%甲醇 > 80%乙醇 > 80% 乙酸乙酯 >80% 丙酮 > 超純水。各溶劑得到的黃酮含量依次為：80%甲醇 > 80%乙醇 > 80% 乙酸乙酯 > 80% 超純水 > 80% 丙酮。此外，不同溶劑提取得到的黃酮含量差異較大，結(jié)果表明80 %甲醇提取得到的黃酮含量最多（300.96±16.85） mg/10 g，丙 酮 中 含 量 最 少（144.17±5.38） mg/10 g。用香草醛法測得，不同溶劑提取的沙棘葉中的單寧含量依次為：80% 甲醇 > 80% 乙 醇> 80% 乙酸乙酯 > 80% 丙酮 > 超純水，與各溶劑提取的沙棘葉中總多酚含量順序一致。

2.2 不同提取溶劑對(duì)沙棘葉自由態(tài)多酚抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響

采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測了不同溶劑提取沙棘葉自由態(tài)多酚對(duì)癌細(xì)胞增殖的影響。研究結(jié)果顯示，提取自不同溶劑中的沙棘葉自由態(tài)多酚對(duì)HCT-116細(xì)胞的增殖抑制作用表現(xiàn)出劑量依賴性。其中80%甲醇和80%丙酮提取的沙棘葉自由態(tài)多酚對(duì)HCT-116細(xì)胞生長抑制效果較好，而超純水和80%乙酸乙酯提取的沙棘葉自由態(tài)多酚對(duì)細(xì)胞生長抑制效果較差（圖3）。

2.3 不同水解法對(duì)沙棘葉結(jié)合態(tài)多酚提取率的影響

根據(jù)以上結(jié)果可以看出，80%甲醇提取得到的自由酚的含量及抑制細(xì)胞增殖的能力均高于其他四種溶劑，因此將其提取自由酚后的殘?jiān)謩e采用堿水解和酸水解進(jìn)行結(jié)合態(tài)多酚的提取。比較二者得到的沙棘葉中結(jié)合態(tài)多酚類的含量差異，結(jié)果顯示采用堿水解提取得到的結(jié)合態(tài)總酚、黃酮、單寧含量分別是酸水解中的1.6、3.9和3.3倍，表明堿水解法為沙棘葉結(jié)合酚的更優(yōu)提取方法。

2.4 不同濃度的沙棘葉結(jié)合態(tài)多酚對(duì)腫瘤細(xì)胞活力的影響

比較兩種水解方法得到的沙棘葉結(jié)合酚對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)二者以濃度依賴的方式抑制HCT-116細(xì)胞的增殖，且堿水解法的抑制作用顯著優(yōu)于酸水解法（圖4）。

2.5 沙棘葉結(jié)合態(tài)多酚抗腫瘤活性成分的純化

為了得到較純的抑制癌細(xì)胞生長的活性成分，首先，采用HPD500、HPD600和HPD722這3種不同極性的大孔樹脂對(duì)沙棘葉結(jié)合態(tài)多酚進(jìn)行分離純化，并計(jì)算其吸附率和解析率。結(jié)果顯示，大孔樹脂HPD500的吸附率最高，而HPD600的解析率最高，HPD722的吸附率和解析率均最低（圖5（a）和5（b））。對(duì)純化得到的多酚物質(zhì)進(jìn)行抗腫瘤活性評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)3種大孔樹脂的洗脫液均具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，并且表現(xiàn)出良好的濃度依賴性抑制作用（圖5（c））。多酚活性成分在大孔樹脂中的吸附能力及其解離能力對(duì)于后續(xù)多酚的含量均具有較大影響。因此，綜合考慮大孔樹脂的吸附率和解析率及對(duì)腫瘤細(xì)胞生長抑制活性，我們選取HPD600進(jìn)行后續(xù)的純化實(shí)驗(yàn)。

進(jìn)一步分別采用30%、60%、95%（V/V）的乙醇對(duì)吸附在大孔樹脂的沙棘葉結(jié)合態(tài)多酚進(jìn)行洗脫，檢測各洗脫液對(duì)腫瘤細(xì)胞生長的抑制活性，發(fā)現(xiàn)30%和60%的乙醇洗脫液均能夠顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，其中60%的乙醇洗脫液的抑制作用略優(yōu)于30%的乙醇洗脫液（圖5（d））。此外，95%的乙醇洗脫液中幾乎未檢測到多酚含量，表明60%的乙醇可洗脫大部分多酚。

3 討論

不同溶劑對(duì)不同的植物多酚類物質(zhì)的提取效率有較大影響，因而選擇恰當(dāng)?shù)奶崛∪軇┲陵P(guān)重要。本研究比較了5種不同的溶劑對(duì)沙棘葉游離態(tài)總酚、總黃酮和縮合單寧的提取能力，發(fā)現(xiàn)80%的甲醇較其他幾種溶劑對(duì)沙棘葉中總酚、總黃酮和縮合單寧的提取效果最好。因此，甲醇水混合物是一種高效提取沙棘葉游離酚的溶劑。

植物多酚有兩種不同的存在方式，即自由態(tài)多酚與結(jié)合態(tài)多酚。其中自由態(tài)多酚可由溶劑萃取，而結(jié)合態(tài)多酚無法直接被溶劑萃取，需要通過酶法、酸水解和堿水解等方法獲得。本研究比較了酸水解和堿水解對(duì)沙棘葉中結(jié)合酚的提取效果，發(fā)現(xiàn)堿水解法獲得的其總酚、總黃酮和水解單寧含量均較酸水解法含量髙。因此，相對(duì)于酸水解法而言，堿水解法更適于提取沙棘葉中的結(jié)合態(tài)多酚。

研究表明大約有24%～57%的多酚類化合物在果蔬中以結(jié)合態(tài)形式存在［11］。顯然，僅僅對(duì)自由態(tài)多酚進(jìn)行研究而忽略結(jié)合態(tài)多酚的功效，導(dǎo)致多酚化合物的抗氧化、抗腫瘤等的效應(yīng)大大低估。而且提取游離多酚后的殘?jiān)泻薪Y(jié)合態(tài)多酚，在消化系統(tǒng)消化吸收后依然能保持相對(duì)完整的結(jié)構(gòu)，并且能夠在結(jié)腸等各個(gè)器官都能發(fā)揮其抗炎、抗癌和抗菌等作用。然而，游離態(tài)多酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)大多在消化吸收后被破壞，導(dǎo)致其生物活性和利用率較低［18］。本研究分別比較了不同溶劑提取得到的游離酚及結(jié)合酚對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制活性，發(fā)現(xiàn)沙棘葉中的結(jié)合態(tài)多酚具有較強(qiáng)的抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長的作用，表明結(jié)合酚具有更強(qiáng)的生物活性。

綜上所述，本文建立了沙棘葉中結(jié)合態(tài)多酚和游離態(tài)多酚的提取方法，并證明結(jié)合態(tài)多酚具有良好的抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的活性，但其發(fā)揮抗腫瘤活性的有效成分還有待深入研究。本研究的開展為將來沙棘葉這一資源的深度開發(fā)提供基礎(chǔ)。