基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究連翹抗炎作用機(jī)制

劉文倩，高耀，張立偉，李石飛*

（1.山西大學(xué) 分子科學(xué)研究所， 化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山西 太原 030006；2.山西大學(xué) 中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心， 山西 太原 030006）

0 引言

中藥連翹是木犀科植物連翹Forsythia sus?pensa （Thunb.） Vahl的干燥果實(shí)，主要分布于我國的山西、陜西，河南和山東等地。連翹氣微香、味苦、性微寒、歸肺心、小腸經(jīng)，具清熱解毒，消腫散結(jié)，疏散風(fēng)熱等效用，是有著千年歷史的傳統(tǒng)中藥［1］。連翹散結(jié)消腫、清熱解毒的藥效在多方面得到體現(xiàn)，主要包括抗炎、抗腫瘤、抗病原微生物、解熱等。連翹被廣泛運(yùn)用于臨床，是許多中藥復(fù)方制劑的重要成分，如連花清瘟膠囊，雙黃連含片，牛黃上清片等［2-3］。

炎癥作為一種常見而又十分復(fù)雜的病理現(xiàn)象，它是機(jī)體對刺激及損傷產(chǎn)生的一種防御反應(yīng)。炎癥一般對機(jī)體是有益的，但嚴(yán)重的炎癥亦會傷害機(jī)體，炎癥與多數(shù)疾病都有密切的聯(lián)系［4-5］。連翹具有較強(qiáng)的抗炎作用，臨床上用于治療炎癥相關(guān)疾病，如急性風(fēng)熱感冒，癰腫瘡毒等［6］。對于連翹化學(xué)成分的相關(guān)研究，已知從連翹中可分離出達(dá)300多種化學(xué)成分，主要化學(xué)成分多達(dá)150多種，包含有黃酮類、木脂素類、苯乙醇苷類以及揮發(fā)油類等。其中連翹苷，槲皮素，木犀草素等均報(bào)道有良好的抗炎活性［2，5］。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，厲世偉等研究連翹有效成分對炎癥模型的作用，結(jié)論得連翹提取物對炎性細(xì)胞有不同程度保護(hù)，具有一定的抗炎作用［4］。王越等研究連翹成分連翹苷對LPS刺激的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)的抑制作用，結(jié)果表明連翹苷能夠抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)［7］。陳澤文等研究連翹不同極性部位的抗炎活性，結(jié)果表明連翹的部分提取物具有良好的抗炎活性［8］。目前關(guān)于連翹抗炎的研究有很多，大多研究了連翹的各種成分表現(xiàn)出的抗炎活性，然而在系統(tǒng)闡明連翹抗炎具體作用機(jī)制及相關(guān)作用等方面的研究相對缺乏。因此我們需要進(jìn)一步加強(qiáng)對連翹抗炎作用機(jī)制的研究。

中藥注重整體性，并在功效上表現(xiàn)多樣性特點(diǎn)。其分子機(jī)制相對復(fù)雜， 難以深入研究。而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門將信息網(wǎng)絡(luò)與計(jì)算機(jī)科學(xué)相結(jié)合，基于系統(tǒng)生物學(xué)和多向藥理學(xué)理論的新學(xué)科，其特點(diǎn)具整體性和系統(tǒng)性，與中醫(yī)藥整體性原則相吻合［9-10］。從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)這門技術(shù)上可以獲得“多成分-多靶點(diǎn)”的相互聯(lián)系及蛋白互作關(guān)系，預(yù)測中藥及其分子作用機(jī)制，使得中藥研究得以更好延伸。本研究以連翹抗炎作出發(fā)點(diǎn)，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法來研究連翹抗炎的作用機(jī)制，為連翹后期研究提供相關(guān)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 連翹活性成分收集與篩選

本研究經(jīng)中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫TC?MSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）檢索連翹的活性成分信息?？诜幬镌隗w內(nèi)經(jīng)過吸收（absorption）、分布（distribution）、代謝（metabo?lism）及排泄（excretion）的過程，為ADME過程?？诜锢枚龋∣B，oral bioavailability）是衡量中藥臨床藥效的有效指標(biāo)，類藥性原則（DL，drug likeness）是指化合物與已知藥物的相似性。所以本研究以O(shè)B≥30%及DL≥ 0.18的2個(gè)條件進(jìn)行篩選以獲得有效的活性成分［11-12］。

1.2 連翹活性成分作用靶點(diǎn)的預(yù)測與篩選

將TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選得到活性成分的化學(xué) 結(jié) 構(gòu) 數(shù) 據(jù) 導(dǎo) 入 PharmMapper（http：//lilabecust.cn/pharmmapper/）平臺進(jìn)行預(yù)測靶點(diǎn)，再將每個(gè)成分的預(yù)測結(jié)果的Z值進(jìn)行降序，分別選擇前50個(gè)結(jié)果進(jìn)行后續(xù)研究［12］。并使用Uniprot蛋 白 質(zhì) 數(shù) 據(jù) 庫（https：//www.uniprot.org）規(guī)范靶點(diǎn)信息。

1.3 炎癥靶點(diǎn)的收集與篩選

通過 OMIM 數(shù)據(jù)庫（https：//omim.org/）和TTD數(shù)據(jù)庫（https：//db.idrblab.org/ttd/）檢索炎癥靶點(diǎn)，以“inflammation”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，其中OMIM數(shù)據(jù)庫選帶有“*”的炎癥靶點(diǎn)。收集兩個(gè)數(shù)據(jù)庫與炎癥相關(guān)的靶點(diǎn)信息并進(jìn)行整合。再將預(yù)測靶點(diǎn)與炎癥靶點(diǎn)取交集得到共同靶點(diǎn)，并繪制韋恩圖。

1.4 構(gòu)建“連翹成分-預(yù)測靶點(diǎn)”和“連翹成分-炎癥靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

將連翹的活性成分，預(yù)測靶點(diǎn)，交集的炎癥靶點(diǎn)建成EXCEL數(shù)據(jù)，將其導(dǎo)至Cytoscape 3.8.1（http：//www.cytoscape.org/）軟件中，利用該軟件構(gòu)建“連翹成分-預(yù)測靶點(diǎn)”，“連翹成分-炎癥靶點(diǎn)”，以探究連翹抗炎作用機(jī)制。運(yùn)用“Net?work analyzer”功能分析相關(guān)屬性， 導(dǎo)出接近中心性ClosenessCentrality，中介中心性Between?nessCentrality，點(diǎn)度中心性Degree等參數(shù)，Degree為每一個(gè)節(jié)點(diǎn)擁有邊的數(shù)量，一個(gè)節(jié)點(diǎn)的De?gree越大，說明該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中就越重要。

1.5 蛋白靶點(diǎn) PPI（Protein-Protein Interaction）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

取交集靶點(diǎn)導(dǎo)入到String平臺（https：//string-db.org），生物種類設(shè)為人類，其余為默認(rèn)設(shè)置，得到蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)，再利用Cyto?Scape3.8.1軟件中的MCODE插件進(jìn)一步分析PPI網(wǎng)絡(luò)，得到蛋白互作關(guān)系的高密度子網(wǎng)［13］。

1.6 連翹抗炎靶點(diǎn)的功能與通路富集分析

將交集靶點(diǎn)上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行GO（Gene Ontology）功能和 KEGG（Kyoto Ency?clopedia of Genes and Genomes）通路富集分析。所得結(jié)果以P<0.05為界，GO分析選取前10個(gè)富集結(jié)果和KEGG分析選取前20個(gè)富集結(jié)果并利用R語言進(jìn)行可視化，并構(gòu)建“連翹抗炎靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié) 果

2.1 連翹活性成分及成分靶點(diǎn)的獲取

經(jīng)TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得150種連翹活性成分，再經(jīng)OB≥30%及DL≥0.18篩選后獲得21個(gè)連翹活性成分。21個(gè)成分分為8種類型結(jié)構(gòu)，分別為：7個(gè)木脂素類及其苷類，4個(gè)黃酮類，1個(gè)C6-C2天然醇及其苷類，2個(gè)甾醇類，4個(gè)萜類，1個(gè)醌類，1個(gè)有機(jī)酸類，1個(gè)生物堿物質(zhì)，詳見表1。 21個(gè)活性成分經(jīng)PharmMapper平臺預(yù)測靶點(diǎn)并篩選，再刪除重復(fù)靶點(diǎn)得254個(gè)靶點(diǎn)，最后又經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫規(guī)范得230個(gè)。

2.2 炎癥靶點(diǎn)的獲取

通過OMIM數(shù)據(jù)庫輸入“inflammation”關(guān)鍵詞得1091個(gè)炎癥靶點(diǎn)，又經(jīng)篩選帶有“*”符號的靶點(diǎn)獲得818個(gè)炎癥靶點(diǎn)。另外使用TTD數(shù)據(jù)庫輸入“inflammation”得120個(gè)炎癥靶點(diǎn)。最后整合得871個(gè)炎癥靶點(diǎn)。將所得的連翹活性成分預(yù)測靶點(diǎn)與炎癥靶點(diǎn)取交集，得到交集靶點(diǎn)45個(gè)，并繪制韋恩圖，如圖1所示。

2.3 構(gòu)建“連翹活性成分?靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

使用Cytoscape3.8.1軟件構(gòu)建“連翹活性成分-預(yù)測靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖（共251個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中21個(gè)成分節(jié)點(diǎn)和230個(gè)預(yù)測靶點(diǎn)；共949條邊），綠色六邊形為21個(gè)成分，黃色和藍(lán)色菱形為230個(gè)靶點(diǎn)，其中黃色為度值≥11的靶點(diǎn)，如圖2所示。在該網(wǎng)絡(luò)中，分析其拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，其中有 6個(gè)預(yù)測靶點(diǎn)可以與15個(gè)及以上的化合物相互作用。度值≥15的靶點(diǎn)有碳酸酐酶-2（Carbon?ic anhydrase 2），細(xì)胞分裂蛋白激酶 2（Cell divi?sion protein kinase 2），酪氨酸蛋白磷酸酶非受體1型（Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 1），凝血酶原（Prothrombin），雄激素受體（Androgen receptor），熱休克蛋白 HSP 90-alpha（Heat shock protein HSP 90-alpha），詳見表 2。由上述可知，連翹的有效活性成分與相應(yīng)靶點(diǎn)之間存在一個(gè)成分對應(yīng)多個(gè)靶標(biāo)、一個(gè)靶標(biāo)對應(yīng)多個(gè)成分的關(guān)系，這體現(xiàn)了連翹多成分、多靶點(diǎn)共同作用的機(jī)制。

構(gòu)建“連翹活性成分-炎癥靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖（共66個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中21個(gè)成分節(jié)點(diǎn)和45個(gè)炎癥靶點(diǎn)；共211條邊），綠色菱形為連翹21個(gè)活性成分，淡粉色方形為45個(gè)炎癥靶點(diǎn)。分析網(wǎng)絡(luò)圖可以得到連翹抗炎的核心成分，網(wǎng)絡(luò)分析表明：其中有8個(gè)活性成分的度值在11及以上，依次為 MOL000098（槲皮素），MOL003281（20（S）-達(dá)瑪烷-24-烯-3β，20-二醇-3-乙酸酯），MOL003305（連翹苷），MOL003322（4-［（3R，6S）-3-（3，4-二甲氧基苯基）-1，3，3a，4，6，6a-六氫呋喃［3，4-c］呋喃-6-基］-3-甲氧基苯酚），MOL003283（（+）-異落葉松樹脂醇），MOL003344（β-香樹脂醇乙酸酯），MOL000006（木犀草素），MOL003308（（+）-松脂醇單甲醚-4-D-β-葡萄糖苷），如圖3所示。

2.4 蛋白靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

取交集靶點(diǎn)提交至 String平臺，得PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，經(jīng)Cytoscape3.8.1軟件修飾得圖45個(gè)節(jié)點(diǎn)，216條邊。度值越大，顏色越深，其平均度值9.6，如圖4所示。為更精確地分析連翹抗炎的作用機(jī)制，運(yùn)用Cytoscape3.8.1中的MCODE 插件，得高密度子網(wǎng)，其靶點(diǎn)為45個(gè)靶點(diǎn)度值前14個(gè)靶點(diǎn)，可見度值越高，在PPI網(wǎng)絡(luò)中越重要。由圖可知，連翹抗炎主要與絲裂原激活蛋白激酶 14（MAPK14），SRC 蛋白激酶（SRC），胰島素樣生長因子1（IGF1），絲裂原激活蛋白激酶 1（MAPK1），表皮生長因子受體（EGFR），絲裂原激活蛋白激酶8（MAPK8），白細(xì)胞介素2（IL2）， 信 號 轉(zhuǎn) 導(dǎo) 與 轉(zhuǎn) 錄 激 活 因 子 1（STAT1），90KDA熱休克蛋白AA1（HSP90AA 1），基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）等靶點(diǎn)密切相關(guān)，如圖5所示。

2.5 連翹抗炎靶點(diǎn)功能與通路的富集分析

經(jīng)分析并借助R語言對結(jié)果可視化得：連翹參與的生物學(xué)過程（BP，Biological Process）主要有細(xì)胞對脂多糖的反應(yīng)（Cellular response to lipopolysaccharide），Peptidyl-serine磷酸化（Pepti?dyl-serine phosphorylation），細(xì)胞對胰島素刺激的反應(yīng)（Cellular response to insulin stimulus），凋亡過程的負(fù)調(diào)控（Negative regulation of apoptotic process），來自RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄起始（Transcription initiation from RNA polymerase Ⅱpromoter）等過程。連翹主要參與的細(xì)胞組成（CC，Cellular Component）有細(xì)胞外間隙（Estra?cellular space），細(xì)胞核（Nucleus），細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)域（Perinuclear region of cytoplasm），胞質(zhì)溶膠（Cytosol），核質(zhì)（Nucleoplasm）等成分。連翹抗炎靶點(diǎn)的功能（MF，Molecular Function）主要有類固醇激素受體活性（Steroid hormone receptor activity），蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性（Protein tyro?sine kinase activity），受體信號蛋白酪氨酸激酶活性（Receptor signaling protein tyrosine kinase ac?tivity），酶 結(jié) 合（Enzyme binding），蛋 白 結(jié) 合（Protein binding）等功能，如圖6所示。

此外，KEGG通路分析結(jié)果顯示得相關(guān)通路有癌癥通路（Pathways in cancer），催乳激素信號 通 路（Prolactin signaling pathway），結(jié) 核 ?。═uberculosis），破骨細(xì)胞分化 （Osteoclast differ?entiation），丙型肝炎（Hepatitis C），PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway），GnRH 信號通路（GnRH signaling pathway），Rap 1信號通路（Rap 1 signaling pathway），Ras信號通路（Ras signaling pathway），如圖7所示，富集通路結(jié)果詳見表3。最后構(gòu)建抗炎靶點(diǎn)-通路圖，以選取的20條KEGG通路及所涉及的27個(gè)抗炎靶點(diǎn)作圖，并分析其拓?fù)鋮?shù)。網(wǎng)絡(luò)分析得，MAPK1、MAPK8、EGFR、MAPK14度值分別為19、14、13、12，在網(wǎng)絡(luò)中度值占最高，為關(guān)鍵靶點(diǎn)，如圖8所示。

3 討論

連翹是臨床常用清熱解毒要藥，在風(fēng)熱感冒、乳癰、瘰疬、丹毒、溫病初起、癰疽等熱證治療顯示出顯著療效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，連翹在抗病毒、抗腫瘤、抗炎等方面均顯示出作用。其中抗炎作為連翹的主要藥理作用之一，目前只是在研究連翹的不同化學(xué)成分的抗炎活性較為充分，但連翹抗炎作用機(jī)理的研究卻相對缺乏。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法從連翹抗炎的活性成分、作用靶點(diǎn)、相關(guān)通路等方面對作用機(jī)制進(jìn)行了探討。從連翹的活性成分篩選出連翹抗炎的核心成分為槲皮素、連翹苷、木犀草素等。槲皮素為多醇羥基黃酮類化合物，具有抗炎，免疫調(diào)節(jié)，抗癌，抗氧化等作用。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可通過抑制NF-κB通路，降低炎癥因子表達(dá)，達(dá)到抗炎目的［14］。木犀草素是存在于許多藥用植物中的典型C6-C3-C6結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物，且具有多種藥理活性。木犀草素發(fā)揮抗炎作用，其通過影響花生四烯酸的代謝，多條炎性信號通路如NF-κB信號通路、MAPK和AP-1信號通路及抑制炎癥因子表達(dá)等多種途徑抗炎［15-16］。相關(guān)研究揭示了木犀草素與槲皮素在體外表現(xiàn)良好的抗炎效果［17］。有文獻(xiàn)報(bào)道連翹苷對炎癥因子具有抑制作用，表現(xiàn)出良好的抗炎活性［18-19］。

在連翹抗炎的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中通過構(gòu)建高密度子網(wǎng)，有14個(gè)蛋白靶點(diǎn)起關(guān)鍵作用，其核心靶點(diǎn)為 MAPK14、SRC、IGF1、MAPK1、EGFR等。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK），具有調(diào)控促炎因子的作用。MAPK 家族可分為p38、JNK和ERK，其中p38，JNK在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［20］，MAPK14 蛋白激酶是 4 個(gè)p38 MAPKs 之一［12］。MAPK1是MAPK 家族一員，參與炎癥反應(yīng)，它的激活可促使炎癥因子的表達(dá)［21］。SRC是一種非受體蛋白酪氨酸激酶，它參與細(xì)胞的生長、發(fā)育和分化等過程且發(fā)揮重要作用，并與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)［22］。IGF1作為一種重要的生長因子，以自分泌或者是旁分泌的方式促使成骨細(xì)胞的增殖、分化、維持骨代謝的平衡，從而促進(jìn)骨形成［23］。EG?FR 作為一種I型跨膜糖蛋白，經(jīng)誘導(dǎo)形成二聚體，再磷酸化后激活下游信號通路，從而影響細(xì)胞的增殖、分化與存活［24］。

由本研究中氣泡圖氣泡的顏色和大小，得出連翹抗炎的主要通路有癌癥通路、催乳激素信號通路、結(jié)核病、破骨細(xì)胞分化、丙型肝炎、PI3K-Akt信號通路等。癌癥嚴(yán)重威脅著人類健康，是全球性的公共衛(wèi)生問題之一［25］。炎癥因子與癌癥密切相關(guān)，其參與了腫瘤的發(fā)生、促進(jìn)、惡性轉(zhuǎn)化、侵襲及轉(zhuǎn)移病理過程，并且核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在炎癥與腫瘤之間起著重要作用［26］。Prolactin是一種多肽激素，具有作為激素和細(xì)胞因子的生物活性功能［27］。它參與生物過程廣泛，包括神經(jīng)調(diào)節(jié)，泌乳，情緒反應(yīng)，細(xì)胞生長增殖，內(nèi)分泌以及免疫調(diào)節(jié)［28］。催乳素還通過對星形膠質(zhì)細(xì)胞白細(xì)胞介素功能的旁分泌調(diào)節(jié)，在神經(jīng)炎性反應(yīng)相關(guān)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［29］。結(jié)核病是一個(gè)連續(xù)體，由一系列病變組成，是炎癥復(fù)雜調(diào)節(jié)的結(jié)果，促炎因子包括干擾素、TNF-α、IL-1以及微小核糖核酸和類花生酸在結(jié)核病期間形成一個(gè)互作網(wǎng)絡(luò)。結(jié)核病是由一種高度健壯和復(fù)雜的細(xì)菌病原體結(jié)核分枝桿菌引起的，結(jié)核病的特點(diǎn)是潛伏和活動期的炎癥不消退。結(jié)核病是一種局部疾病，典型集中在肺，即肺結(jié)核［30-31］。目前臨床主要通過抗炎、祛痰及止咳等方式治療肺結(jié)核［32］。破骨細(xì)胞由單核細(xì)胞融合分化而成，是骨吸收的功能細(xì)胞［33］，在骨骼發(fā)育和維持中起重要作用，破骨細(xì)胞異?；罨瘯r(shí)會導(dǎo)致各種骨相關(guān)疾病的發(fā)生。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，有許多中醫(yī)藥基于NF-κB信號通路來調(diào)控破骨細(xì)胞分化［34］。丙型肝炎是由于感染丙肝病毒（HCV）所導(dǎo)致。丙肝病毒是一種有包膜的RNA病毒，屬于類肝素病毒屬和黃病毒科［35］。丙型肝炎的分子機(jī)制與多條炎癥信號通路相關(guān)，如MAPK、NF-κB等信號通路［36］。PI3K-Akt途徑是許多系統(tǒng)中細(xì)胞生長的重要調(diào)節(jié)因子，PI3K（磷酸肌醇3-激酶）家族由1類、2類和3類激酶組成，它們將PIP2（磷脂酰肌醇二磷酸）磷酸化為PIP3。1類PI3K激酶參與Akt（蛋白激酶B）的激活，Akt激活導(dǎo)致許多下游蛋白質(zhì)的刺激，影響細(xì)胞生長、存活以及分化［37］。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，PI3K-Akt信號通路參與炎癥反應(yīng)，并發(fā)揮較明顯的調(diào)控作用［38-40］。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對連翹抗炎作用機(jī)制進(jìn)行了初步預(yù)測，分析了連翹抗炎相關(guān)靶點(diǎn)及所涉及通路，為后續(xù)研究提供了指導(dǎo)意義?；谏鲜鼋Y(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)連翹在抗炎作用中是多個(gè)活性成分參與多個(gè)靶點(diǎn)的調(diào)控，同時(shí)一個(gè)靶點(diǎn)也參與調(diào)控多條信號通路，符合中藥的多成分，多靶點(diǎn)，多種途徑的特征。