一種用于過氧亞硝酸根檢測的長波長發(fā)射比率熒光探針

楊倩倩，昝琪，王碩航，于雪，張躍偉*，董川，樊麗*

（1.山西大學 環(huán)境科學研究所，山西 太原 030006；2.吉林化工學院 化學與制藥工程學院，吉林 吉林 132022）

0 引言

過氧亞硝酸根（ONOO?）是生物體內(nèi)一類重要的活性氧化物（ROS）和活性氮化物（RNS），由超氧陰離子自由基（O2?ˉ）和一氧化氮自由基（?NO）反應(yīng)形成，參與各種生理和病理過程的調(diào)節(jié)［1-2］。ONOOˉ不僅可以起到信號傳導的作用，還具有抗菌活性，而且在維持細胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用［3-4］。然而，由于ONOOˉ具有較強的氧化性和親核性，過量的ONOOˉ易與蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、酪氨酸殘基和酶等多種生物活性物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，從而影響細胞正常的生理活動，甚至導致細胞凋亡或壞死，進而誘發(fā)多種疾病，如炎癥、神經(jīng)退行性疾病、自身免疫性疾病和癌癥等［5-7］。為了更好地研究ONOOˉ水平與相關(guān)疾病之間的內(nèi)在聯(lián)系，迫切需要開發(fā)一種用于特異性檢測ONOOˉ的方法。

迄今為止，文獻報道了多種檢測ONOOˉ的方法，包括電化學分析法、色譜法、紫外-可見分光光度法等［8-10］，但是這些檢測方法普遍存在一些局限性，如靈敏度低、操作費時、設(shè)備昂貴、檢測成本高、樣品預處理具有潛在破壞性等。相對而言，基于小分子熒光探針的熒光成像技術(shù)，因其靈敏度高、便于操作、成本較低、非破壞性檢測和時空分辨率高等優(yōu)勢，已成為檢測生物系統(tǒng)內(nèi)活性物質(zhì)的有力工具，在現(xiàn)代生物學和醫(yī)學研究領(lǐng)域不可或缺［11-13］。目前，在已開發(fā)用于ONOOˉ檢測的熒光探針中，根據(jù)識別機理的不同，可分為硼酸及硼酸酯氧化型［14-17］、C=C 雙鍵裂解型［18-20］、三氟甲基活化酮型［21-22］、有機硒/碲氧化型［23-24］、α-酮酰胺氧化型［25］、酰肼氧化型［26-27］以及 N-氨基苯酚氧化型［4，28］等。盡管這些熒光探針對于人們理解ONOOˉ的生理學功能及其與相關(guān)疾病關(guān)系方面具有極大的幫助，但所報道的ONOOˉ熒光探針大多都是單波長發(fā)射探針，易受到如探針的局部濃度、儀器參數(shù)和微環(huán)境等外界因素的干擾［29-30］，檢測的準確度受到限制。相反，比率發(fā)射型熒光探針通過測量兩個不同發(fā)射波長的熒光強度的比值，可以有效避免上述干擾，從而能夠在復雜的環(huán)境中更準確地分析目標分析物［13，18］。 此 外 ，目 前 報 道 的 許 多 比 率 型ONOOˉ熒光探針仍存在發(fā)射波長短（< 600 nm）、易受其他活性氧（如 H2O2、ClOˉ、·OH、1O2等）干擾導致的選擇性差等問題［22，31］。因此，迫切需要開發(fā)具有長波長發(fā)射、高選擇性的比率型熒光探針用于ONOOˉ的特異性識別。

本文設(shè)計合成了一種長波長發(fā)射的比率型熒光探針DHX--BE用于ONOOˉ的檢測，DHX--BE由苯硼酸酯、氧雜蒽以及吡啶陽離子構(gòu)成，利用苯硼酸酯和碳碳雙鍵兩個反應(yīng)位點對ONOOˉ進行識別（圖1）。DHX--BE本身在658 nm處具有深紅熒光發(fā)射，與ONOOˉ作用后，紅色熒光減弱；同時在554 nm處產(chǎn)生強綠色熒光發(fā)射，發(fā)射峰位移高達104 nm。DHX--BE對ONOOˉ的響應(yīng)呈現(xiàn)顯著的比率發(fā)射熒光特性，其熒光強度比值（F554nm/F658nm）增強了727倍，檢測限為20.4 nmol/L。此外，DHX--BE對ONOOˉ具有較快的響應(yīng)速度和高選擇性，從而實現(xiàn)了對ONOOˉ的快速、高效和特異性檢測。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

2-溴-1-環(huán)己烯-1-甲醛、2-羥基-4-甲氧基苯甲醛購于上海麥克林生化科技有限公司。碳酸銫、醋酸鋅、1，4-二甲基吡啶碘化物、三氯化鋁購于阿拉丁試劑（上海）有限公司。4-溴甲基苯硼酸頻哪醇酯購于薩恩化學技術(shù)（上海）有限公司。除另有說明，所用的化學試劑均為分析純，在實驗使用時未做進一步處理。

紫外-可見吸收光譜在TU-1901雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司，中國）上測定；熒光光譜在FLS920愛丁堡熒光光譜儀（愛丁堡儀器公司，英國）上測定；核磁共振光譜在Bruker AVANCE III 600 MHz超導核磁共振波譜儀（布魯克公司，瑞士）上測定；高分辨質(zhì)譜在Thermo Scientific Q Exac?tive組合型四極桿Orbitrap質(zhì)譜儀（賽默飛世爾科技公司，美國）上測定。

1.2 探針的合成與表征

探針DHX--BE的合成路線如圖2所示。

1.2.1 化合物2的合成

向2-羥基-4-甲氧基苯甲醛（402 mg，2.645 mmol）的 N，N-二甲基甲酰胺（10 mL）溶液中加入碳酸銫（2585 mg，7.935 mmol），氮氣保護下，再將2-溴-1-環(huán)己烯-1-甲醛（化合物1，1000 mg，5.29 mmol）的N，N-二甲基甲酰胺（2 mL）溶液滴加到上述反應(yīng)液中。室溫反應(yīng)24小時后，將反應(yīng)液倒入蒸餾水（120 mL）中，用二氯甲烷（3×50 mL）萃取，收集有機相，氯化鈉溶液洗滌，無水硫酸鎂干燥，抽濾，濃縮。經(jīng)過快速柱層析純化（石油醚∶乙酸乙酯 = 5∶1，V/V），真空干燥后得到黃色固體223 mg為化合 物 2，產(chǎn) 率 為 34.8%。1H NMR （400 MHz，CDCl3） δ 10.32 （s， 1H）， 7.08 （d， J = 9.2 Hz，1H）， 6.72 ～ 6.61 （m， 3H）， 3.85 （s， 3H），2.72 ～ 2.52 （m， 2H）， 2.45 （t， J = 6.0 Hz，2H）， 1.76 ～ 1.67（m， 2H）。

1.2.2 化合物3的合成

將化合物 2（171 mg，0.7 mmol），1， 4-二甲基吡啶碘化物（165 mg，1.54 mmol）和醋酸鋅（333 mg，1.82 mmol）加入到乙醇（10 mL）中，然后加入哌啶（190 μL）為催化劑。氮氣保護下，80 ℃反應(yīng)27 h后，冷卻至室溫，濃縮反應(yīng)溶液，殘余物經(jīng)過快速柱層析純化（二氯甲烷∶甲醇 = 100∶1，V/V），真空干燥后得到紫黑色固體202 mg為化合物3，產(chǎn)率為62.3%。1H NMR（400 MHz， DMSO-d6） δ 8.63 （d， J = 6.8 Hz，2H）， 8.24 （d， J = 16.0 Hz， 1H）， 8.07 （d，J = 6.4 Hz， 2H）， 7.23 （d， J = 8.4 Hz， 1H），7.00 （d， J = 2.0 Hz， 1H）， 6.78 （s， 1H）， 6.73（dd， J = 8.4， 2.0 Hz， 1H）， 6.63 （d， J = 16.0 Hz， 1H）， 4.18 （s， 3H）， 3.84 （s， 3H）， 3.03（s， 1H）， 2.56 （t， J = 5.2 Hz， 2H）， 1.85 ～1.72（m， 2H）， 1.68 ～ 1.62（m， 1H）。

1.2.3 化合物4的合成

在冰水浴條件下，將化合物3（500 mg，1.09 mmol）加入到100 mL圓底燒瓶中，再加入干燥的二氯甲烷（20 mL）使化合物3全溶。氮氣保護下，加入三氯化鋁（2907 mg，21.8 mmol），自然升至25 ℃并反應(yīng)24 h。反應(yīng)完全后，緩慢加入蒸餾水（20 mL）淬滅反應(yīng)，然后再加入1 mol/L HCl（30 mL），用二氯甲烷∶甲醇 = 10∶1（3×50 mL）萃取，無水硫酸鎂干燥，抽濾，濃縮。經(jīng)過快速柱層析純化（二氯甲烷∶甲醇 =20∶1，V/V），真空干燥后得到紫黑色固體436 mg為化合物4，產(chǎn)率為89.9%。1H NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ 10.25 （s， 1H）， 8.63 （d，J = 6.8 Hz， 2H）， 8.21 （d， J = 15.6 Hz，1H）， 8.05 （d， J = 7.2 Hz， 2H）， 7.11 （d， J =8.4 Hz， 1H）， 6.80 （d， J = 2.0 Hz， 1H）， 6.76（s， 1H）， 6.63 ～ 6.55 （m， 2H）， 4.17 （s，3H）， 4.14 （q， J = 5.6 Hz， 2H）， 2.56 ～ 2.52（m， 2H）， 2.49 ～ 2.25（m， 2H）.

1.2.4 探針DHX--BE的合成

將化合物 4（30 mg，0.05 mmol）溶于甲醇（3 mL）中，加入碳酸銫（49 mg，0.15 mmol）反應(yīng)10 min，然后加入4-溴甲基苯硼酸頻哪醇酯（45 mg，0.15 mmol）。氮氣保護下，80 ℃反應(yīng)18 h后，濃縮反應(yīng)液，殘余物經(jīng)過快速柱層析純化（二氯甲烷∶甲醇 = 50∶1，V/V），真空干燥后得到紫黑色金屬光澤固體15 mg為目標產(chǎn)物DHX--BE，產(chǎn)率為 45.4%。1H NMR （400 MHz，DMSO-d6） δ 8.63 （d， J = 6.8 Hz， 2H）， 8.24（d， J = 16.0 Hz， 1H）， 8.07 （d， J = 6.8 Hz，2H）， 7.72 （d， J = 8.0 Hz， 2H）， 7.48 （d， J =8.0 Hz， 2H）， 7.24 （d， J = 8.4 Hz， 1H）， 7.10（d， J = 2.0 Hz， 1H）， 6.81 （dd， J = 8.8， 2.4 Hz， 1H）， 6.79 （s， 1H）， 6.64 （d， J = 16.0 Hz， 1H）， 5.22 （s， 2H）， 4.17 （s， 3H）， 2.56（t， J = 5.2 Hz， 2H）， 2.49 ～ 2.46 （m， 2H），1.80 ～ 1.70 （m， 2H）， 1.30 （s， 12H）；13C NMR （150 MHz， DMSO-d6） δ 159.65， 153.35，152.92， 152.24， 144.11， 139.93， 134.96，134.59， 127.41， 127.11， 126.81， 124.60，122.15， 118.40， 115.17， 110.70， 101.94， 83.69，69.38， 46.22， 30.93， 28.78， 24.66， 24.03， 22.04，20.30， 13.94； HR-MS m/z： C34H37BNO4+， calcd 534.281 0，found 534.281 0。

1.3 光譜測定

1.3.1 探針DHX--BE母液的制備

精確稱取一定質(zhì)量的DHX--BE固體，用二甲基亞砜（DMSO）溶解，配成1 mmol/L的DHX--BE母液。

1.3.2 ONOOˉ的制備

ONOOˉ的具體制備過程參考文獻［32］，得到的儲備液需在?20 ℃保存。ONOOˉ的濃度通過吸收光譜在302 nm處的吸光度值計算確定（摩爾吸光系數(shù)為 1670 L?mol-1?cm-1）。

1.3.3 分析測試物的制備

過氧化氫（H2O2）用去離子水稀釋30%H2O2溶液制得；次氯酸根（ClOˉ）用去離子水稀釋NaClO（含6%～14%活性氯）溶液制得，其濃度由292 nm處的吸光度值確定（摩爾吸光系數(shù)為 350 L?mol?1?cm?1）；羥基自由基（·OH）依據(jù)芬頓反應(yīng)產(chǎn)生，由硫酸亞鐵溶液加入10當量的H2O2溶液反應(yīng)得到，其濃度等于Fe2+濃度；單線態(tài)氧（1O2）由次氯酸鈉溶液與H2O2溶液反應(yīng)制得，其濃度等于次氯酸鈉的濃度；一氧化氮（NO）是由硝普鈉溶于去離子水中制成10 mmol/L的儲備液；其他生物硫醇、陽離子和陰離子均溶于去離子水中制成10 mmol/L儲備液。

1.3.4 探針DHX--BE的光譜性能測試

取10 μL DHX--BE母液（1 mmol/L）加入到2 mL DMSO/PBS（1/9，V/V，pH 7.4）測試體系中，混合均勻后，再加入不同濃度的ONOOˉ溶液，室溫下反應(yīng)5 min后，進行紫外-可見吸收光譜和熒光光譜的測定。

選擇性實驗中，取10 μL DHX--BE母液加入2 mL DMSO/PBS（1/9，V/V，pH 7.4）測試體系中，混合均勻后，再加入20 μL其他分析物（10 mmol/L），室溫下反應(yīng)5 min后，進行熒光光譜的測定。

pH響應(yīng)實驗中，取10 μLDHX--BE母液加入 2 mL DMSO/PBS（1/9，V/V，pH 3?10）測試體系中，加或不加100 μmol/L ONOOˉ條件下，室溫下反應(yīng)5 min后，進行熒光光譜的測定。

以上實驗中，激發(fā)波長均為514 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為3 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針DHX--BE對ONOOˉ的光譜響應(yīng)研究

首先，我們研究了DHX--BE在DMSO/PBS（1/9，V/V，pH 7.4）體系中與 ONOOˉ反應(yīng)前后的紫外-可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜。如圖 3（a）和 3（b）所示，DHX--BE 本身在 520 nm處有最大吸收和在658 nm處有最大發(fā)射。當加入ONOOˉ后，DHX--BE在520 nm處的吸收強度明顯減弱，同時在362 nm處有新的吸收峰出現(xiàn)。另外，在ONOOˉ的存在下，DHX--BE在658 nm處的發(fā)射峰消失，同時在554 nm處出現(xiàn)一個新的強熒光發(fā)射峰，這說明DHX--BE與ONOOˉ發(fā)生反應(yīng)并且生成了新物質(zhì)。以上結(jié)果均表明，DHX--BE可以與ONOOˉ發(fā)生反應(yīng)且能通過比率響應(yīng)來特異性的識別ONOOˉ。

2.2 探針DHX--BE對ONOOˉ的響應(yīng)時間研究

為了更好地理解DHX--BE與ONOOˉ的反應(yīng)動力學，在室溫下考察了DHX--BE對ONOOˉ的響應(yīng)時間。如圖4（a）所示，DHX--BE本身在658 nm處的熒光強度在幾分鐘內(nèi)保持不變，在加入ONOOˉ后，658 nm處的熒光強度降低，同時在554 nm處出現(xiàn)新的熒光發(fā)射峰且其發(fā)射強度隨著反應(yīng)時間的延長而不斷增強，在反應(yīng)5 min后達到最大值。DHX--BE的熒光強度比F554nm/F658nm隨時間的變化如圖4（b）所示，在加入ONOOˉ后，F(xiàn)554nm/F658nm逐漸增大，在反應(yīng)5 min后達到最大值，這表明DHX--BE與ONOOˉ在5 min內(nèi)反應(yīng)完全。

2.3 探針DHX--BE對ONOOˉ的熒光滴定研究

隨后，對DHX--BE與ONOOˉ反應(yīng)的熒光光譜實驗進行了研究。如圖5（a）所示，隨著ONOOˉ濃度的逐漸增加，DHX--BE在658 nm處的熒光強度逐漸降低，同時一個新的熒光發(fā)射峰在554 nm處出現(xiàn)且熒光強度隨著ONOOˉ濃度的增加而逐漸增強。熒光強度比F554nm/F658nm隨ONOOˉ濃度增加的變化如圖5（a）插圖所示，當ONOOˉ的濃度增加到100 μmol/L時，F(xiàn)554nm/F658nm從0.031 41增加至22.83，增強了727倍。進一步分析DHX--BE的熒光強度比F554nm/F658nm和ONOOˉ濃度的線性關(guān)系，如圖5（b）所示，在ONOOˉ濃度范圍為0～10 μmol/L時，F(xiàn)554nm/F658nm與ONOOˉ濃度具有良好的線性關(guān)系（F554nm/F658nm= 0.062 3 c （ONOOˉ） + 0.017 3，R2=0.998）；根據(jù) LOD = 3σ/k，計算得到 DHX--BE對ONOOˉ的檢出限為20.4 nmol/L。上述結(jié)果表明，DHX--BE對ONOOˉ具有較高的靈敏度而且可以用于ONOOˉ的定量檢測。

2.4 探針DHX--BE對ONOOˉ的選擇性研究

接下來，考察了DHX--BE對ONOOˉ的選擇性。在相同體系中，當加入ONOOˉ或其他分析物時，DHX--BE的熒光光譜變化和熒光強度比F554nm/F658nm變化如圖 6（a）和 6（c）所示。這些分析物包括各種活性氧（H2O2、ClO-、·OH、1O2）、活性硫（S2-、HSO3ˉ、S2O32-、GSH、Hcy、Cys）、活 性 氮（NO、NO2ˉ）以及各種陽離子（K+、Na+、Ba2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Cd2+、Sn2+）和陰離子（Cl-、Br-、CO32-、H2PO4ˉ），它們分別與DHX--BE反應(yīng)5 min后進行檢測。結(jié)果表明，只有在加入ONOOˉ時，554 nm處才會出現(xiàn)新的強熒光發(fā)射峰，F(xiàn)554nm/F658nm才會顯著增加，而加入其他分析物與探針本身相比幾乎沒有變化，產(chǎn)生的影響幾乎可以忽略不計。此外，我們還研究了在上述分析物存在時，DHX--BE對ONOOˉ識別的抗干擾能力。如圖6（b）所示，當ONOOˉ和其他分析物共存時，DHX--BE在554 nm處都保持了較強的熒光強度，且其熒光強度比F554nm/F658nm也幾乎沒有明顯變化（圖6（c））。這些結(jié)果充分證實了DHX--BE對ONOOˉ具有高度選擇性，可以在復雜的生物體系中高靈敏的檢測ONOOˉ。

2.5 探針DHX--BE對ONOOˉ的pH響應(yīng)研究

進一步研究了DHX--BE在不同pH條件下對ONOOˉ的響應(yīng)。如圖7所示，DHX--BE本身的熒光強度比F554nm/F658nm在pH 3～10范圍內(nèi)基本沒有變化，表明DHX--BE具有良好的穩(wěn)定性。當加入ONOOˉ反應(yīng)5 min后，熒光強度比F554nm/F658nm在pH 3～6范圍內(nèi)無明顯變化；而在7～10的pH范圍內(nèi)顯著增大，尤其在pH 7.4時，熒光強度比F554nm/F658nm達到最大，這表明DHX--BE非常適合在生理pH環(huán)境下對ONOOˉ進行特異性識別。

2.6 探針DHX--BE對ONOOˉ的響應(yīng)機理研究

由于ONOOˉ具有強氧化性，能夠氧化苯硼酸酯和碳碳雙鍵［13］。通過DHX--BE與ONOOˉ反應(yīng)前后的熒光光譜對比，我們推測ONOOˉ有可能與DHX--BE的苯硼酸酯和碳碳雙鍵作用，使苯硼酸酯發(fā)生氧化水解反應(yīng)生成酚類化合物，同時誘導碳碳雙鍵氧化裂解得到相應(yīng)的醛，最終釋放出產(chǎn)物DHX--OH（圖1）。為了進一步證實上述推斷，我們對DHX--BE和DHX--BE與ONOOˉ反應(yīng)后的產(chǎn)物進行了高分辨質(zhì)譜分析。如圖8所示，DHX--BE在m/z =534.281 0處有較強的分子離子峰，與DHX--BE的分子量（534.281 0）吻合。與ONOOˉ反應(yīng)后，在m/z =229.140 6出現(xiàn)一個新的分子離子峰，這與推測的產(chǎn)物DHX--OH（m/z：229.085 9，［M+H］+）相對應(yīng)。由此表明，ONOOˉ可以氧化水解DHX--BE的苯硼酸酯，同時氧化裂解碳碳雙鍵，生成產(chǎn)物分子DHX--OH。

3 結(jié)論

本文設(shè)計合成了一種長波長發(fā)射的比率型熒光探針DHX--BE，利用苯硼酸酯和碳碳雙鍵作為ONOOˉ的特異性反應(yīng)位點，用于ONOOˉ的檢測。通過核磁共振波譜和高分辨質(zhì)譜對DHX--BE的結(jié)構(gòu)進行了表征；采用紫外-可見分光光度法和熒光光譜法研究了DHX--BE對ONOOˉ的特異性識別；并且通過高分辨質(zhì)譜驗證了DHX--BE與ONOOˉ的識別機理。實驗表明，DHX--BE對ONOOˉ具有比率熒光響應(yīng)特性，發(fā)射峰位移達104 nm，檢測限為20.4 nmol/L，且具有響應(yīng)速度快、選擇性高和靈敏度高等優(yōu)點。因此，DHX--BE的開發(fā)對生物體內(nèi)ONOOˉ的研究及其生理病理功能和疾病診斷具有潛在的應(yīng)用價值。