人卵丘顆粒細胞及胚胎培養(yǎng)液中線粒體的研究進展

甄雪蓉，賈俊龍，王玲，*

(1.甘肅中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，蘭州 730000；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四○醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，蘭州 730050)

全世界約有15%的夫婦受到不孕癥的影響，先天缺陷、營養(yǎng)不良、激素失調(diào)或生殖系統(tǒng)疾病等多方面因素均可導致不孕不育[1]，輔助生殖技術(shù)(ART)的出現(xiàn)改善了這一局面。人類ART主要有常規(guī)體外受精-胚胎移植(IVF-ET)、人工授精、卵子體外成熟(IVM)、卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)、胚胎凍融技術(shù)、植入前遺傳學診斷(PGD)等。但有一部分患者在ART治療之后，妊娠率仍不理想。研究表明，存在于成熟的人類卵母細胞中的數(shù)十甚至數(shù)十萬個線粒體，是卵母細胞成熟及成功植入前胚胎發(fā)育的必要條件[2]。顆粒細胞的線粒體參與眾多細胞內(nèi)物質(zhì)代謝，可利用葡萄糖的代謝產(chǎn)物丙酮酸為卵母細胞三磷酸腺苷(ATP)合成提供底物[3]。顆粒細胞線粒體功能及顆粒細胞-卵母細胞間的相互作用是卵母細胞正常發(fā)育的必要條件[4]。近年來，因為ART術(shù)后妊娠率的不理想及其發(fā)展瓶頸，學者們對人類胚胎培養(yǎng)液中線粒體功能的研究愈來愈多，本文就人卵丘顆粒細胞(CGCs)及胚胎培養(yǎng)液中線粒體的研究進展展開綜述。

一、線粒體結(jié)構(gòu)和功能

1.線粒體結(jié)構(gòu)：線粒體由兩層磷脂膜包裹，即線粒體外膜和線粒體內(nèi)膜，位于兩層線粒體膜之間的是線粒體膜間隙，被線粒體內(nèi)膜包裹的是線粒體基質(zhì)[5]。這兩層膜在脂質(zhì)組成、跨膜蛋白特征和作用、通透性和形狀等方面存在顯著差異，是細胞器內(nèi)共生起源的結(jié)果。線粒體協(xié)調(diào)許多細胞過程，例如脂質(zhì)代謝、細胞離子穩(wěn)態(tài)以及金屬輔助因子的生物合成。線粒體超微結(jié)構(gòu)的復雜性決定了其功能的多樣性[6]。

2.線粒體功能：眾所周知，線粒體是細胞的動力源，主要通過氧化磷酸化合成ATP，ATP合成過程中通過電子傳遞鏈(ETC)傳遞電子。ETC由5個復合體(I-V)組成，通過調(diào)節(jié)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和琥珀酸的轉(zhuǎn)移，促使線粒體內(nèi)膜產(chǎn)生電化學梯度來驅(qū)動ATP合成酶。氧化磷酸化過程可產(chǎn)生活性氧(ROS)，生理情況下，ROS的產(chǎn)生和清除維持在一個動態(tài)平衡[7]。高濃度ROS會損傷線粒體功能，生理水平的ROS作為信號分子，通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的信號傳導介導細胞分裂、細胞分化和細胞功能轉(zhuǎn)變等諸多生物學過程，從而維持細胞和組織穩(wěn)態(tài)[8]。在卵母細胞成熟和早期胚胎發(fā)育過程中，線粒體經(jīng)歷了階段性的空間再分布，線粒體的結(jié)構(gòu)缺陷和DNA拷貝數(shù)的異常都可能影響卵母細胞的成熟和胚胎的發(fā)育。線粒體與細胞核以及其他細胞器之間的通訊，成為其調(diào)節(jié)著床前發(fā)育的關(guān)鍵[9]。

二、CGCs與線粒體

1.CGCs：人體內(nèi)卵泡的發(fā)育是一個復雜的過程，從始基卵泡、竇前卵泡、竇狀卵泡、排卵前卵泡直至排卵，共經(jīng)歷了5個階段。顆粒細胞分為位于卵泡壁的壁層顆粒細胞(MGCs)和直接包裹在卵母細胞周圍的CGCs。CGCs與卵母細胞直接接觸形成卵丘-卵母細胞復合體(COCs)，主要為卵母細胞提供營養(yǎng)和能量；而MGCs位于卵泡壁上，主要執(zhí)行內(nèi)分泌功能，排卵時卵細胞和它周圍的CGCs一起被排出。研究發(fā)現(xiàn)，在行ICSI周期中，若獲取的卵母細胞少或未完全成熟，可以將未成熟卵母細胞與CGCs一起體外共培養(yǎng)，此法可提高患者優(yōu)質(zhì)胚胎率[10]。CGCs和MGCs在卵泡的生長發(fā)育中都起著重要作用[11]。

在卵泡發(fā)育過程中，CGCs通過縫隙連接參與和卵母細胞的雙向代謝物交換，這對卵母細胞的正常成熟和CGCs的增殖都至關(guān)重要。另一方面，卵母細胞旁分泌因子如轉(zhuǎn)化生長因子家族成員(GDF9、BMP15)控制和調(diào)節(jié)卵丘的生長和擴張[12]。GDF9、BMP15存在于與單卵母細胞相對應的CGCs中。研究表明，兩者的mRNA基因表達水平與正常受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率和優(yōu)質(zhì)囊胚形成率呈顯著正相關(guān)，因此，可以作為預測卵母細胞發(fā)育潛能的指標[13]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，線粒體融合蛋白可通過促進線粒體的融合直接影響線粒體功能，調(diào)節(jié)線粒體介導的細胞能量產(chǎn)生、自噬及凋亡。在女性生殖系統(tǒng)中，線粒體融合蛋白在調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育、促進竇前卵泡向竇卵泡轉(zhuǎn)化、促進卵母細胞成熟以及維持妊娠期子宮內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)等方面有重要意義[14]。

2.CGCs中線粒體作用：近年來，隨著ART技術(shù)的逐漸成熟，Taugourdeau等[15]發(fā)現(xiàn)，CGCs中線粒體數(shù)量、分布、DNA(mtDNA)的拷貝數(shù)與胚胎質(zhì)量相關(guān)。一項關(guān)于卵巢儲備功能減退(DOR)和CGCs線粒體相關(guān)性的研究表明，CGCs中mtDNA拷貝數(shù)降低可能與DOR患者卵母細胞功能受損有關(guān)；因此，CGCs線粒體的某些特征(例如mtDNA拷貝數(shù))可以作為卵母細胞發(fā)育潛能的指標[16]。Taugourdeau等[15]評估了人CGCs中mtDNA的拷貝數(shù)與相應胚胎植入后懷孕幾率之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在IVF過程中，胚胎植入的概率與CGCs中的mtDNA拷貝數(shù)密切相關(guān)，證明了CGCs中mtDNA定量可作為胚胎植入潛能的生物標記物。Ogino等[17]也發(fā)現(xiàn)，CGCs中mtDNA拷貝數(shù)可以作為預測優(yōu)質(zhì)胚胎的參數(shù)。

然而，也有一些研究的結(jié)果與上述結(jié)論相反。Liu等[18]的研究結(jié)果表明，CGCs中mtDNA拷貝數(shù)在植入胚胎與未植入胚胎、優(yōu)質(zhì)胚胎與劣質(zhì)胚胎之間均無顯著差異；質(zhì)優(yōu)組和質(zhì)差組相應CGCs的線粒體膜電位、ATP含量和ROS水平均無顯著差異；因此，他們認為CGCs中mtDNA拷貝數(shù)的測定對IVF患者的胚胎選擇可能無明顯指導作用。此外，另有一項關(guān)于人類CGCs中mtDNA相對含量和線粒體基因組變異是否與卵母細胞生殖潛能和ART結(jié)局相關(guān)的研究表明，CGCs中mtDNA拷貝數(shù)或特定mtDNA遺傳變異的存在與ART結(jié)局無關(guān)，但與患者體質(zhì)量指數(shù)(BMI)相關(guān)，從而認為，分析CGCs中的mtDNA在改善胚胎選擇方面無明顯優(yōu)勢[19]。這與Liu等[18]的結(jié)果一致。從上述研究報道可發(fā)現(xiàn)，CGCs中mtDNA拷貝數(shù)能否作為預測胚胎質(zhì)量和胚胎植入的參數(shù)的結(jié)論并不一致，因此，仍需要我們進一步驗證。

三、胚胎培養(yǎng)液與線粒體

1.胚胎培養(yǎng)液：人類ART術(shù)的最終目的是成功妊娠，而胚胎質(zhì)量是影響ART成功率的重要因素，但是目前尚缺乏有效、客觀、全面評價胚胎質(zhì)量的方法。目前臨床上采用的判斷胚胎能否移植的方法是胚胎形態(tài)學評分。最近研究表明，胚胎培養(yǎng)液中胚胎自身分泌的氨基酸、葡萄糖、丙酮酸在胚胎發(fā)育過程中至關(guān)重要[20]，而胚胎培養(yǎng)液中主要的細胞因子，包括可溶性人白細胞抗原因子-G(sHLA-G)、β-人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)、血小板活性因子(PAF)、胰島素樣生長因子(IGFs)、表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-α)、瘦素(leptin)可以作為胚胎發(fā)育和植入潛力的指標[21]。研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)質(zhì)胚胎及種植胚胎的培養(yǎng)液中含有高水平的PAF，因此，PAF水平可以作為挑選具有植入潛力胚胎的指標[22]。

2.胚胎培養(yǎng)液中線粒體作用：線粒體在卵母細胞成熟、受精和早期的胚胎發(fā)育中均扮演著重要角色。mtDNA是獨立于核DNA之外的能進行半自主復制的遺傳物質(zhì)，在哺乳動物中為母系遺傳。當精子在完成受精后，精子能量耗竭，由卵母細胞為受精卵繼續(xù)發(fā)育成胚胎提供能量支持，因此，發(fā)育至卵裂期胚胎細胞中的線粒體全部來自于卵母細胞[23]。胚胎發(fā)育過程中，線粒體主要通過氧化磷酸化提供ATP，當線粒體受損時，將產(chǎn)生額外的ROS。研究發(fā)現(xiàn)，卵裂期胚胎第3天(D3)胚胎質(zhì)量越好，其ATP水平越高，ROS水平越低[24]，同時胚胎質(zhì)量越好，胚胎培養(yǎng)液中mtDNA拷貝數(shù)越高[25]。體外受精過程中，早期卵裂胚胎的mtDNA拷貝數(shù)與卵母細胞中的拷貝數(shù)相同，并在囊胚期開始增加；線粒體的增加可能和胚胎應激有關(guān)，胚胎應激能誘導線粒體生物合成，而倍性差異則能誘導蛋白質(zhì)應激，導致ROS的產(chǎn)生，ROS含量增多反過來破壞線粒體功能，造成線粒體損傷[26]。

有研究表明，胚胎培養(yǎng)液中mtDNA/基因DNA(gDNA)的比率與胚胎質(zhì)量和生存潛力密切相關(guān)，因此，其在臨床上可用于挑選具有更好發(fā)育潛力的胚胎進行移植[27]。然而，Zhang等[28]的發(fā)現(xiàn)與上述結(jié)論相反，他們的研究證明胚胎培養(yǎng)液中mtDNA/gDNA雖然和胚胎發(fā)育有一定相關(guān)性，但尚不能作為臨床預測胚胎質(zhì)量的指標。一項動物實驗發(fā)現(xiàn)，胚胎培養(yǎng)液中mtDNA拷貝數(shù)與胚胎染色體倍性有關(guān)，二倍體胚胎發(fā)育到囊胚的比率大于單倍體，但二倍體囊胚mtDNA拷貝數(shù)低于單倍體囊胚[29]。此外，一項有關(guān)胚胎形態(tài)學參數(shù)與整倍體相關(guān)性分析表明，形成囊胚后第3日胚胎質(zhì)量、囊胚擴張程度與囊胚整倍體狀態(tài)無關(guān)，而活檢時間、囊胚內(nèi)細胞團級別及囊胚滋養(yǎng)層細胞級別與整倍體狀態(tài)顯著相關(guān)[30]。

上述研究表明，胚胎培養(yǎng)液中雖只存在微量mtDNA，但經(jīng)過DNA擴增后仍能獲得較多mtDNA，且其在一定程度上可能反映胚胎質(zhì)量，而且可能作為未來預測胚胎質(zhì)量的重要標志物。但對mtDNA在胚胎早期發(fā)育過程中能否預測胚胎質(zhì)量及著床率的相關(guān)研究仍存在爭議，因此仍需大量研究證實上述理論。

四、總結(jié)與展望

綜上所述，線粒體是人體內(nèi)至關(guān)重要的細胞器，它通過氧化磷酸化為機體提供ATP，在生殖系統(tǒng)中也不例外。卵母細胞和精子質(zhì)量是輔助生殖技術(shù)中決定胚胎質(zhì)量及成功妊娠的重要因素。眾所周知，在受精過程中，卵母細胞提供了早期胚胎發(fā)育的能量來源，這意味著卵母細胞中線粒體的儲備至關(guān)重要。已有研究發(fā)現(xiàn)，卵母細胞中線粒體含量及mtDNA拷貝數(shù)與胚胎質(zhì)量呈正相關(guān)[31]。卵母細胞周圍的CGCs與胚胎發(fā)育過程中胚胎培養(yǎng)液線粒體含量及DNA拷貝數(shù)與胚胎質(zhì)量的相關(guān)性成為研究熱點，但眾多學者的研究結(jié)論并不一致，尚無法用于準確判斷和預測胚胎質(zhì)量；而臨床上用于預測胚胎質(zhì)量的形態(tài)學評分并不十分準確，因此找到預測胚胎質(zhì)量的非侵入性方法顯得尤為重要。未來有必要繼續(xù)開展對卵母細胞周圍CGCs和胚胎培養(yǎng)液的研究，以期為改善輔助生殖中胚胎著床及成功妊娠提供理論參考。