植物樣品中硒形態(tài)分析的前處理技術(shù)

王文靜，陳 通，崔琬晶，郭亞飛，潘秀云，鄧天龍,*

(1.海洋資源化學(xué)與食品技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué) 化工與材料學(xué)院，天津 300457；2.湖北省益欣鹽產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院有限公司，湖北 孝感 432400)

1 前言

作為人類生命必需的十四種微量元素之一，硒在人體中發(fā)揮著不可或缺的作用。通過(guò)合成谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、硫氧還原蛋白還原酶、蛋氨酸亞砜還原酶等氧化還原酶，清除有害自由基及過(guò)氧化物，起到抗衰老作用[1]。硒還能保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫，提升機(jī)體免疫力，并在預(yù)防心血管疾病，拮抗重金屬和污染物、抑制腫瘤、護(hù)肝、防治風(fēng)濕及呼吸道疾病等諸多方面起到重要的作用[2]。人體所需的硒大部分靠膳食獲取，直接或間接來(lái)源于植物。

硒可分為無(wú)機(jī)硒和有機(jī)硒兩大類。植物樣品中Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ) 等無(wú)機(jī)酸較少，大部分以硒蛋白、硒多糖、硒核酸等大分子硒及硒代蛋氨酸(SeMet)、硒代胱氨酸(SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)、硒代乙硫氨酸(SeEt)等小分子有機(jī)硒化物的形式存在[3]。如在壺瓶碎米薺中，主要以硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸的形式存在，富硒西蘭花中主要以硒代蛋氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代胱氨酸形式存在，富硒大豆主要是硒代蛋氨酸以及少量的硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸和亞硒酸鹽[4]。不同形態(tài)硒的營(yíng)養(yǎng)功能、安全性、生物活性差異明顯，因此植物中硒形態(tài)的分析對(duì)合理開發(fā)富硒植物和科學(xué)補(bǔ)硒至關(guān)重要。

然而，植物中硒的形態(tài)種類繁多且不穩(wěn)定，且各形態(tài)的硒含量較低，其形態(tài)分析檢測(cè)具有挑戰(zhàn)性。因此，科學(xué)合理的前處理對(duì)方法的構(gòu)建至關(guān)重要。在前處理過(guò)程中，既要避免原始硒形態(tài)的轉(zhuǎn)化，又不能引入污染物，并能滿足具體檢測(cè)需求。在此基礎(chǔ)上，簡(jiǎn)便、高效、綠色的前處理技術(shù)受到越來(lái)越多的關(guān)注。

實(shí)驗(yàn)中常采用濕法消解、微波消解、石墨爐消解、干灰化等方法處理植物樣本以測(cè)定其總硒含量[5]，但由于這些方法反應(yīng)劇烈，容易使蛋白質(zhì)發(fā)生變性或者分解，各硒形態(tài)被破壞或發(fā)生轉(zhuǎn)化，因此不能應(yīng)用于硒的形態(tài)分析。植物樣品基體復(fù)雜，硒與氨基酸、蛋白質(zhì)等相結(jié)合形成各種小分子或大分子形態(tài)，種類復(fù)雜多樣，需要根據(jù)硒的形態(tài)與植物樣本的特點(diǎn)、檢測(cè)需求采取相應(yīng)的前處理技術(shù)。

2 植物樣品硒形態(tài)分析的前處理技術(shù)

2.1 液相萃取法(LPE)

液相萃取法是硒形態(tài)分析中應(yīng)用最為廣泛的前處理技術(shù)，主要包括水提取法、酸提取法、醇提取法、酶提取法、加壓液體萃取法等方法。為提高提取效率，同時(shí)會(huì)輔以攪拌、震搖、離心、超聲、微波等技術(shù)[6]。超聲輔助提取是通過(guò)超聲波使溶液中分子運(yùn)動(dòng)頻率和速度增加，溶質(zhì)溶劑充分接觸，從而提高提取效率；微波輔助提取則是根據(jù)物質(zhì)吸收微波能力的差異性，加速樣品和溶劑間的相互作用，達(dá)到提取目的。

2.1.1 水提取法

水提取法是以去離子水為溶劑提取樣本中水溶性硒的前處理方法，適用于游離的無(wú)機(jī)硒或者非結(jié)合蛋白形式的小分子硒，如硒酸鈉、亞硒酸鈉、甲基硒代半胱氨酸等，對(duì)于以結(jié)合蛋白形式存在的大分子硒的提取效果則較差[7]。傅世利等[8]采用超聲水提法處理凍干后的臍橙樣品，經(jīng)UPLCQ-TOF-MS法測(cè)定，臍橙中SeCys2、MeSeCys和SeMet 3種形態(tài)硒的加標(biāo)回收率在78.8%～92.9%之間，RSD在2.1%～7.5%間。陸奕娜等[9]針對(duì)富硒茶葉、大米樣品，建立了水提法前處理、高效液相色譜—電感耦合等離子體質(zhì)譜(HPLC-ICP-MS)聯(lián)用技術(shù)測(cè)定7種硒形態(tài)的方法，該法確定了提取最優(yōu)條件為超聲下提取2 h，提取次數(shù)為1次。張弛等[10-11]在富硒蘿卜葉、荸薺中硒的賦存形態(tài)及分布研究中采用水提法對(duì)可溶性硒進(jìn)行提取，測(cè)得富硒蘿卜葉中硒水溶性蛋白硒的含量占總硒的26.78%，荸薺中水溶性蛋白質(zhì)中硒的含量為17.16 μg/g。Ogra等[12]與Auger[13]等也分別將水提取方法應(yīng)用到對(duì)大蒜中硒的提取過(guò)程。水提取法操作簡(jiǎn)單，環(huán)境友好，經(jīng)濟(jì)節(jié)約，但也存在著提取效率低、適用范圍窄的缺點(diǎn)。

2.1.2 酸提取法

仲娜[14]采用HPLC分離技術(shù)聯(lián)用ICP - MS檢測(cè)技術(shù)分析富硒海帶樣品中的硒形態(tài)，在前處理提取劑的選擇上，比較了0.1 mol/L HCl、0.1 mol/L NaOH、20 mmol/L NH4AC-CH3OH(5%)及蛋白酶XIV四種提取劑，發(fā)現(xiàn)使用0.1 mol/L HCl為提取介質(zhì)、超聲輔助處理時(shí)可成功提取出Na2SeO3、MeSeCys等4種硒形態(tài)，其他提取劑則提取硒的種類少或效率低。姚真真等[15]采用HPLC-ICP-MS測(cè)定蘋果中SeCys2、MeSeCys、Se(Ⅵ)、SeMet、Se(Ⅳ)等5種硒形態(tài)，研究發(fā)現(xiàn)采用鹽酸為提取劑時(shí)加標(biāo)回收率差、采用鏈酶蛋白酶為提取劑時(shí)回收率的時(shí)效性差，而采用5 mmol/L檸檬酸為提取劑時(shí)回收率及時(shí)效性均較好。Cankur等[16]研究發(fā)現(xiàn)室溫下用0.1 mol/L HCl溶液水解24 h可以有效地從蒔蘿的葉、莖及根部提取小分子的硒。酸提取法多采用鹽酸、檸檬酸為提取劑，提取率較高，但容易造成硒形態(tài)的破壞或者轉(zhuǎn)化。

2.1.3 醇提取法

李娜[17]以大米和茶葉中的硒為研究對(duì)象，比較沸水、高氯酸—乙醇、甲醇—水、酶4種提取劑效果，得出甲醇—水提取效果最好，提取效率近 80%，進(jìn)一步優(yōu)化提取條件，建立了植物產(chǎn)品中4種常見硒形態(tài)的HPLC-HG-AFS分析方法。韓丹[18]用陰離子交換色譜連接氫化物發(fā)生——原子熒光光譜法(LC-HG-AFS)測(cè)定了用甲醇——水處理的植物樣品，得到SeCys、Se(Ⅳ) 、SeMet和Se(Ⅵ)的加標(biāo)回收率分別為 95.7%、106.9%、93.3%和91.4%。Ouerdane等[19]在研究芥菜籽中的硒代葡萄糖苷時(shí)，發(fā)現(xiàn)其易在水提取過(guò)程中不穩(wěn)定而造成損失，而在70%甲醇溶液中則有較好提取效果。醇提取法一般用于有機(jī)硒的提取，成本相對(duì)較高。

2.1.4 酶提取法

酶提取法一般在較為溫和操作條件下進(jìn)行，各硒形態(tài)之間的轉(zhuǎn)化少，因而是液相萃取法中應(yīng)用最廣泛一種提取方法，常用的酶有蛋白酶K、蛋白酶XIV、鏈酶蛋白酶、胃蛋白酶等。陳貴宇等[20]采用蛋白酶K為提取劑，超聲1 h處理富硒茶葉，經(jīng)HPLC-ICP-MS分離檢測(cè)，SeCyS2、SeMC、Se(Ⅳ)、SeMet、Se(Ⅵ) 5種硒形態(tài)在梯度洗脫下短時(shí)間得到了完全分離，加標(biāo)回收率在 91.8%～109.4%之間。曹玉嬪[21]以馬卡、牛蒡?yàn)檠芯繉?duì)象，超聲波輔助蛋白酶K-脂肪酶提取法進(jìn)行前處理、HPLC-ICP-MS法進(jìn)行測(cè)定，SeCys2、Se(Ⅳ)、SeMet和Se(Ⅵ)4種硒形態(tài)加標(biāo)回收率在95.4%～108.0%，并應(yīng)用于田七7種形態(tài)硒的提取。超聲和微波是酶提取法常用的兩種輔助方法，曾鳳澤等[22]研究發(fā)現(xiàn)微波輔助提取相對(duì)于震蕩和超聲更能保持酶的活性，采用微波輔助蛋白酶XIV前處理、HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)測(cè)定靈芝中的6種硒形態(tài)，提取率高達(dá)99.2%，加標(biāo)回收率 91.7%～98.7%，RSD0.031%～3.2%。秦沖等[23]亦采用微波輔助蛋白酶XIV測(cè)定富硒小麥，在37 ℃提取30 min，SeMet和SeCys2即可達(dá)到最大提取量。酶提取法提取率高，但耗時(shí)較長(zhǎng)，需要超聲、微波等技術(shù)的輔助。此外，酶解法適用范圍廣，可根據(jù)硒的賦存形態(tài)合理選擇酶種類。

2.1.5 加壓液體萃取法

加壓液體萃取是在較高溫度和壓力下采用常規(guī)溶劑對(duì)固體或半固體待測(cè)物進(jìn)行提取的技術(shù)，具有提取時(shí)間短、溶劑消耗少、穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)。加速溶劑萃取儀 (ASE ) 的成功研制，使該技術(shù)實(shí)現(xiàn)儀器化，變得自動(dòng)化、高效化[24]。Peachey等[25]通過(guò)ASE萃取系統(tǒng)用水和酶處理富硒水芥菜，處理后的樣品經(jīng)HPLC - ICP - MS測(cè)定顯示，其含有SeMC、SeMet、硒酸鹽、亞硒酸鹽等多種形態(tài)的硒。

加壓液體萃取在傳統(tǒng)液相萃取法的基礎(chǔ)上大大縮短了提取時(shí)間，同時(shí)在安全性、節(jié)約性方面優(yōu)點(diǎn)顯著，具有良好的發(fā)展前景。

2.1.6 其他液相萃取法

除以上幾種常用的提取方法，其他液相萃取的方法還有鹽提法、堿提法等，或是將幾種提取方法協(xié)同。胡婷[26]優(yōu)化了HPLC-UV-HG-AFS法測(cè)定植物中4種硒形態(tài)的方法，研究發(fā)現(xiàn)超聲輔助25 mmol/L乙酸銨的前處理方式可將植物樣品中4種硒形態(tài)成功分離，分離度、回收率均能滿足實(shí)驗(yàn)要求。韓婷婷等[27]建立了以1.5 mol/L KOH為提取劑、IC - HG - AFS檢測(cè)膠州灣海產(chǎn)品中硒形態(tài)的方法，分析海帶中硒的加標(biāo)回收率為87%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD3.2%。張路夢(mèng)[28]、高二東[29]分別采用堿提法提取富硒茶葉中的硒蛋白，證明了茶葉中硒蛋白多呈堿溶性。Stefanka等[30]采用水——胃蛋白酶—胰蛋白酶三步法提取法處理蘑菇樣品，成功提取出4種形態(tài)的硒，提取效率高于一步提取法。Mounicou等[31]為研究大蒜中的硒形態(tài)，建立了一種順序提取法，依次用水、酶、鹽酸、亞硫酸鹽，二硫化碳處理樣品，該方法可以根據(jù)硒的不同來(lái)源(水溶性結(jié)合硒、細(xì)胞壁結(jié)合硒、蛋白質(zhì)結(jié)合硒、元素結(jié)合硒和硒化物)有針對(duì)性的提取不同形態(tài)的硒。

2.2 固相萃取法(SPE)

作為一種常用的前處理技術(shù)，固相萃取法主要用于液體樣品分離、純化、濃縮。Yan等[32]制備了5-磺基水楊酸功能化磁鐵礦納米粒子，成功提取出腐乳汁中Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、SeMet及SeCys2四種硒形態(tài)。Yathavakilla等[33]采用陽(yáng)離子交換固相萃取結(jié)合ICP-Ms檢測(cè)出芥菜葉片中含MeSeMet、MeSeCys及少量SeMet。孟昭榮等[34]制備了一種交聯(lián)殼聚糖，用以富集藍(lán)莓樣品中的痕量硒，Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)的加標(biāo)回收率分別在96.6%～107.3%與96.9%～106.3%之間。Torres等[35]采用XAD樹脂作為橄欖油樣品預(yù)濃縮的吸附劑，采用UPLC-ESI-MS法測(cè)定，硒氨基酸的回收率在84%～97%之間，檢出限為0.09 μg/kg。固相萃取法在富集的同時(shí)又能除去雜質(zhì)，相較于液相萃取法，該法試劑消耗少，富集倍數(shù)高、選擇性強(qiáng)，容易實(shí)現(xiàn)與分析儀器的聯(lián)用。但是，只能處理液體樣品的特點(diǎn)增加了該方法的局限性。

2.3 液相微萃取(LPME)

液相微萃取是在液相萃取的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的一種新型綠色前處理技術(shù)。其原理是目標(biāo)物在樣品和提取劑之間達(dá)到分配平衡，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的提取。根據(jù)取樣方式可分為直接液相微萃取、頂空液相微萃取等。Chen等[36]采用懸浮液滴固化微萃取法結(jié)合電熱汽化電感耦合等離子體質(zhì)譜法檢測(cè)茶葉中Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)及有機(jī)硒，該方法RSD在5.5%以內(nèi)，富集因子高達(dá)500。熊珺等[37]建立了頂空單滴液相微萃取與GC-MS聯(lián)用測(cè)定食品中揮發(fā)性有機(jī)硒的方法，將該方法應(yīng)用于大蒜中二甲基硒和二甲基二硒的分析，兩者的加標(biāo)回收率分為93.5%和90.6%。與傳統(tǒng)液相萃取相比，液相微萃取具有試劑消耗小、操作簡(jiǎn)單、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，且能集采樣、萃取、濃縮步驟為一體，便于實(shí)現(xiàn)與儀器的聯(lián)用[38]，在痕量元素的分析中潛力極大。

2.4 固相微萃取(SPME)

固相微萃取是一種新型的前處理方法，與固相萃取不同，其原理并非是萃取全部待測(cè)物，而是基于待測(cè)物在水樣和固定相涂層之間的分配。根據(jù)萃取方式，分為直接法、頂空法、膜保護(hù)法等。平衡后的纖維頭可直接插入GC或HPLC的進(jìn)樣室，樣品經(jīng)熱解進(jìn)入色譜柱，實(shí)現(xiàn)快速測(cè)樣。Gionfriddo等[39]基于廣泛應(yīng)用的固相微萃取結(jié)合—?dú)庀嗌V—三重四極質(zhì)譜(SPME-GC-QqQMS)方法，提出了一種新的富硒和普通馬鈴薯硒形態(tài)的分析方法，使用氯甲酸丙酯-丙醇混合物初步衍生后按照以上方法提取、分離、檢測(cè)，SeMet、MeSeCys回收率82.3%～116.3%。龔亮等[40]選擇二乙烯苯—碳分子—聚二甲基硅氧烷為吸附涂層，建立了頂空固相微萃取結(jié)合GC-MS測(cè)定食品中兩種揮發(fā)性有機(jī)硒的方法，將該方法應(yīng)用于大蒜，檢測(cè)出二甲基硒(DMSe)和二甲基二硒(DMDSe)的含量分別為4.87 μg/kg和0.25 μg/kg，加標(biāo)回收率在84.6%～102.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差7.1%～9.4%，可用于食品中揮發(fā)性有機(jī)硒的分析。固相微萃取無(wú)需溶劑、簡(jiǎn)單快速、安全性高，且裝置便攜，易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，近年來(lái)發(fā)展迅速。

完整的硒形態(tài)分析不僅包括前處理，還有后續(xù)的分離與檢測(cè)。目前，硒的形態(tài)分離主要依靠色譜技術(shù)，如氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC) 、離子色譜(IC)、毛細(xì)管電泳技術(shù)(CE)等，檢測(cè)技術(shù)則有電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)、原子吸收光譜(AAS)、原子發(fā)射光譜(AES)等。目前，色譜分離與光譜分析儀器聯(lián)用技術(shù)被廣泛應(yīng)用于硒的形態(tài)分析[41]，如高效液相色譜—?dú)浠锇l(fā)生—原子熒光聯(lián)用技術(shù)(HPLC-HG-AFS)、氣相色譜—電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-ICP-MS) 等。其中高效液相色譜—電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-ICP-MS) 因其檢出限低、靈敏度高、選擇性好、穩(wěn)定性強(qiáng)等諸多顯著性優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于硒形態(tài)分析研究。

3 結(jié)論

樣品前處理是保證分析準(zhǔn)確性的關(guān)鍵步驟，植物樣品基質(zhì)復(fù)雜，其中的硒形態(tài)種類多、易轉(zhuǎn)化，需要根據(jù)植物樣本及硒形態(tài)特點(diǎn)、檢測(cè)方法的需求采取恰當(dāng)?shù)那疤幚矸绞?。目前，液相萃取法是硒形態(tài)分析中傳統(tǒng)的前處理技術(shù)，其中超聲波輔助蛋白酶提取法效率最高、應(yīng)用最為廣泛，加壓液體萃取法提取快、消耗溶劑少，具有良好的發(fā)展前景。近年來(lái)，液相微萃取、固相微萃取等微型化樣品前處理技術(shù)因具有操作簡(jiǎn)單、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，逐漸被應(yīng)用于植物樣品中硒形態(tài)的研究。高效分離技術(shù)與靈敏的檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合是當(dāng)前硒形態(tài)分析技術(shù)的主流，隨著聯(lián)用分析技術(shù)的發(fā)展，硒形態(tài)的分析更加快速而準(zhǔn)確。未來(lái)硒形態(tài)分析將向著提取分離檢測(cè)一體化、連續(xù)化、自動(dòng)化、綠色化、超痕量方向發(fā)展，這也將促使植物樣品硒的前處理技術(shù)在微型化、簡(jiǎn)便性、高效性等方面進(jìn)一步發(fā)展。