非洲豬瘟及其診斷技術

榮 光，徐向東,2，彭維祺，孫衛(wèi)平，夏萬良，張潤峰

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所，海南?？?571101；2.湖北師范大學，湖北黃石 435000）

非洲豬瘟（Africa swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（Africa swine fever virus，ASFV）引起的豬的一種急性、熱性和高度傳染性的疾病[1,2]，幾乎可以感染不同日齡的豬[3]。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必須通報的疫病，我國動物防疫法將其列為I 類動物疫病[4]。由于ASFV 結構復雜，存活時間長，基因組龐大且易變異，而且其大多數(shù)蛋白結構與功能尚不清楚，以至于目前尚無有效的疫苗來預防ASFV[5,6]。當下除了要加快有效疫苗的研發(fā)，更重要的是利用準確、快速的診斷技術及時做出準確的診斷，對于非洲豬瘟病毒的防控和凈化具有重要意義。本文對非洲豬瘟及非洲豬瘟病毒診斷技術的研究進展進行綜述，以期為非洲豬瘟病毒準確、快速診斷和疫病凈化提供參考。

1 非洲豬瘟

1.1 病原學

非洲豬瘟病毒（ASFV）在病毒學分類上屬于非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬，是ASFV 家族的唯一成員[7]。ASFV 是二十面體對稱結構的雙鏈DNA 病毒，大小在175～215nm，全基因組總長為175～190kb[8,9]。根據(jù)目前的有關研究，ASFV 共有24 個基因型和1 個血清型，在我國流行的是基因Ⅱ型、血清8 群[10,11]。根據(jù)該病毒致病力的不同，可分為感染無臨床癥狀毒株、低致病性毒株、中等毒力毒株、強毒力毒株[12]。其主要通過呼吸道和消化道侵染機體，使其免疫系統(tǒng)受損，進入血液后，引起組織器官出血[13]。

1.2 流行病學

豬是ASFV 唯一的自然宿主，不同品種、不同日齡的豬均可感染。鈍緣蜱屬昆蟲是ASFV 的傳播媒介和貯藏寄主[14,15]，該病毒也是唯一以鈍緣蜱屬昆蟲為傳播方式的DNA 病毒[4]。該病毒主要通過直接或間接接觸帶毒豬的體液、排泄物以及血液等進行傳播[16]。目前尚未發(fā)現(xiàn)其能對人類以及其他動物具有感染性[17]。

1.3 臨床癥狀

豬一旦被ASFV 感染后，典型臨床癥狀表現(xiàn)為高熱、食欲下降、皮膚發(fā)紺、嘔吐、便血和共濟失調(diào)等，剖檢后會發(fā)現(xiàn)淋巴結、腎、胃腸黏膜等出血，甚至還伴隨呼吸障礙等特征[2,18-20]。毒株毒力不同，引起的臨床癥狀也不同，可分為最急性型、急性型、亞急性型、慢性型。強毒力毒株感染豬后，通常表現(xiàn)為最急性型或急性型。最急性型一般無明顯癥狀，病豬突然死亡。急性型的病豬主要特點為高熱、中度厭食、呼吸困難、便血、皮膚發(fā)紺等，處于妊娠期的母豬均會流產(chǎn)。并且強毒力毒株造成的病死率最高可達100%。中等毒力毒株主要引發(fā)非洲豬瘟亞急性型，其臨床癥狀與急性型相似，但程度相對較低，病死率一般為30%～70%。低毒力毒株主要引發(fā)非洲豬瘟慢性型，臨床癥狀表現(xiàn)為呼吸困難、濕咳、消瘦、關節(jié)腫脹等，病死率一般為10%～20%[21-23]。

2 非洲豬瘟診斷技術

2.1 病原學檢測

2.1.1 病毒分離

采集病豬血液或器官組織對非洲豬瘟病毒進行分離，分離過程必須要在生物安全三級（包括三級）以上的實驗室進行。在病毒分離過程中，將抗生素和培養(yǎng)液加到血液或研磨組織中，離心獲取上清液，通過病變效應、紅細胞吸附實驗、間接免疫熒光試驗等技術，確定豬是否感染非洲豬瘟[24,25]。

2.1.2 紅細胞吸附試驗

紅細胞吸附試驗（HAD）早在1960 年就已經(jīng)建立[24]。試驗時，將豬血液或組織制作的懸液接種在原代白細胞培養(yǎng)物中，鏡檢時，若出現(xiàn)有紅細胞吸附在感染細胞表面，呈玫瑰花環(huán)或桑葚狀現(xiàn)象，即可判定為陽性。該試驗較煩瑣且耗時長，對實驗環(huán)境及實驗操作人員的要求相對較高，具有一定的局限性[26,27]。

2.1.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗

酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）的原理是將抗體或抗原吸附在固相載體表面，檢測樣品中的抗原或抗體可與其特異性結合，形成抗原抗體復合物，將酶標抗體再與該復合物結合，根據(jù)加入底物的顏色反應即可判定結果[28]。隨著該技術不斷發(fā)展與應用，其檢測結果也更加準確而有效，具有方便、快速、設備儀器要求低、成本低等優(yōu)點。但是與紅細胞吸附實驗相比，其靈敏性和特異性較低，檢測結果受樣本影響較大；與PCR相比，其特異性和靈敏性低，易出現(xiàn)假陽性；樣本易受保存環(huán)境溫度影響，檢測結果準確性不能得到保證[24]。

2.1.4 熒光抗體試驗

熒光抗體試驗（FAT）是對病豬冰凍切片或者組織切片進行抗原檢測。檢測時，將病豬的冰凍切片、組織切片或已在載玻片上涂有已接種白細胞培養(yǎng)物的細胞沉淀干燥后，浸入丙酮中進行固定，用異硫氰酸熒光素標記抗非洲豬瘟病毒抗體，再用PBS 液沖洗后，在熒光顯微鏡觀察，如果胞漿中發(fā)現(xiàn)特異性熒光，判為陽性。該實驗具有很強的敏感性和特異性，可快速、簡便地得到非洲豬瘟病毒檢測的結果。但實驗對熒光素特異性要求較高，非特異性熒光素染色可能會造成假陽性的結果，對急性非洲豬瘟的靈敏度高。同時該實驗對操作人員的要求較高，并且需要借助顯微鏡，難以實現(xiàn)現(xiàn)場檢測，常作為檢測非洲豬瘟病毒的輔助方法[11,25]。

2.1.5 聚合酶鏈式反應

聚合酶鏈式反應（PCR），具有敏感、快速、特異性高的特點，同時對樣品的純度、血液樣品及組織的保存方式要求較低，被廣泛應用于非洲豬瘟病毒的檢測。Agüero 等[29]根據(jù)p72 保守基因序列，設計引物，建立了快速檢測ASFV 的PCR 方法，且該方法得到OIE 認證。但2015 年有相關研究認為，該方法在檢測中會出現(xiàn)假陰性結果[30]。為解決這個問題，Luo等根據(jù)p72 基因設計引物，檢測不同地區(qū)4 個基因型的14 個代表毒株，表明該方法更為靈敏、準確，能相對全面的檢測非洲豬瘟病毒[31]。

2.1.6 多重PCR

此技術是在PCR 技術的基礎上建立并發(fā)展起來的，能在同一個反應體系中，同時加入多對引物，分別擴增到不同的靶標，獲得相應目的片段[32]。還能對DNA 和RNA 病毒進行同時檢測，效率較高，降低了試劑耗材成本。如五重RT-PCR 鑒別診斷方法，廣泛應用于動物疫病的檢測[33]。

2.1.7 納米PCR

該技術是將納米金屬顆粒添加到普通PCR 反應中，使反應體系熱導性更強，PCR 反應更快，可提高反應的特異性，消除非特異性擴增，提高擴增產(chǎn)物產(chǎn)量，納米PCR 技術可使非洲豬瘟病毒檢測的靈敏度增加至1000 倍[34]。

2.1.8 套式PCR

套式PCR 是先用外套引物進行一次擴增，再用內(nèi)套引物對擴增產(chǎn)物進行第二次擴增，提高擴增的敏感性，該方法可從非洲軟蜱中檢測出非洲豬瘟病毒，可用于篩查不同種類蜱體內(nèi)的非洲豬瘟病毒[35]。

2.1.9 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR 技術，是在PCR 體系中加入熒光基團，利用熒光信號實時監(jiān)測PCR 反應過程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析[36]。該技術與常規(guī)PCR 相比較，檢測過程簡化，可對多個樣品進行同時檢測，檢測的速度更快、靈敏度更高，并且特異性強、自動化程度高，有效解決常規(guī)PCR 污染等問題[37]。

2.1.10 等溫擴增技術

等溫擴增技術是核酸體外擴增技術，其始終維持在恒定溫度進行反應。反應過程無需精密的儀器，具備恒溫裝備即可，并且操作簡便，反應時間短。不足的是缺乏熱循環(huán)中的變性、退火等程序，易出現(xiàn)假陽性，僅適用于疾病的初步篩查，在一定程度上限制了該技術的應用。且檢測試劑盒中酶的成本較高，造成單個樣品檢測費用比普通熒光PCR 高[38]。

2.2 血清學檢測

2.2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗

酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）是血清學檢測方法中應用最廣泛的檢測技術，具有快速、靈敏、成本低、特異性高、準確性高等特點，適用于大規(guī)模樣品的排查、疫病監(jiān)測以及自動化血清學檢測。一般情況下，國內(nèi)外常用p30/p32、p54、p72、p73 等作為檢測ASFV 抗體的蛋白，該方法可通過這些蛋白直接檢測出較低或中等毒力感染豬抗體[37]。王彩霞等[39]以ASFV p72 蛋白為包被抗原，建立阻斷ELISA 方法檢測豬血清中抗ASFV p72 蛋白的抗體，對ASFV 陽性血清靈敏度最低為1∶128，具有較高的特異性、敏感性和良好的重復性。

2.2.2 膠體金試紙檢測技術

膠體金試紙檢測技術是將特異性抗原或抗體與膠體金結合，形成膠體金免疫復合物，膠體金聚集于檢測線顯色，通過觀察顯色反應，即可判定結果。該技術可通過目測法判斷結果，不需要專業(yè)的儀器設備，具有操作簡單，特異性、靈敏度高等特點，適合現(xiàn)場、基層、大規(guī)模排查或是生豬調(diào)運臨場的使用[40]。張鑫宇等[2,41]于2014 年以非洲豬瘟p54 的重組蛋白為核心蛋白標記膠體金，再分別用葡萄球菌A 蛋白和抗p54 多抗作為檢測線和質(zhì)控線，按一定順序制備非洲豬瘟p54 抗體膠體金試紙，建立了p54 抗體膠體金檢測法，該試紙與豬的其他病毒抗體陽性血清無交叉反應，表明該檢測法的敏感性和特異性高。

2.2.3 間接免疫熒光試驗

間接免疫熒光試驗是利用特異性抗體和樣品中相應抗原反應，形成抗原抗體復合物，再用熒光標記的第二抗體與抗原抗體復合物結合，洗滌后在熒光顯微鏡下觀察熒光。該試驗敏感度高，但對試驗條件及操作要求較高，常用于復核ELISA 檢測中的可疑樣品[24,37,40]。

3 小結

非洲豬瘟是我國重點防范的外來疫病之一，在全球已流行一百多年。自2018 年我國首次發(fā)生非洲豬瘟以來，我國生豬養(yǎng)殖業(yè)以及人們的日常生活都受到了嚴重的影響。目前尚無疫苗和藥物可用于預防和治療非洲豬瘟，因此，快速、有效、科學的診斷技術對非洲豬瘟防控尤為重要。該文從非洲豬瘟病原學、流行病學、臨床癥狀及診斷技術等方面進行了綜述，以期各個地區(qū)能根據(jù)實際情況，綜合各種方法的優(yōu)缺點，選擇適當?shù)姆椒ㄟM行檢測。同時科研單位也應根據(jù)目前診斷技術的不足，加大力度研發(fā)更佳的診斷方法。