經(jīng)羧甲基殼聚糖誘導(dǎo)的葡萄柚果實(shí)轉(zhuǎn)錄組WRKY基因分析及抗性相關(guān)基因挖掘

楊 清，劉勝紅，黃二賓，杜嶸宇，王 芳，2，鄧 佳，3，*

(1.西南林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，云南 昆明 650224； 2.西南喀斯特山地生物多樣性保護(hù)國家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224； 3.西南山地森林資源保育與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

葡萄柚(CitrusparadisiMacf.)是蕓香科柑橘屬植物，又叫西柚，有較高的營養(yǎng)、保健、醫(yī)藥研究價(jià)值。柑橘類水果因果實(shí)質(zhì)地軟化在采后貯藏運(yùn)輸過程中易受到霉菌感染引發(fā)青、綠霉病、酸腐病和黑腐病等生理性病害，縮短貯運(yùn)壽命，降低其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。其中，最常見和最嚴(yán)重的柑橘屬果實(shí)采后侵染性病害是由指狀青霉(Penicilliumdigitatum)引起的綠霉病和擴(kuò)展青霉(Penicilliumexpansum)引起的青霉病[1]。對(duì)于柑橘采后病害的防治，目前普遍采用氣調(diào)、涂膜、留樹貯藏、化學(xué)貯藏等方式?；瘜W(xué)殺菌劑通常采用苯并咪唑類和取代苯類的殺菌劑，雖然是最有效的手段，但使用農(nóng)藥會(huì)導(dǎo)致抗藥性、農(nóng)藥殘留、污染環(huán)境等問題的產(chǎn)生，所以未來研究的重點(diǎn)是結(jié)合多種保鮮技術(shù)的綜合防治[2]。

殼聚糖(chitosan，CTS)，化學(xué)名為β-(1，4)聚-2-胺基-D-葡萄糖，是一種含氮的高分子陽離子聚合物，在自然界儲(chǔ)量豐富，最初由節(jié)肢動(dòng)物的外殼提取而來，應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中不會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒副作用，經(jīng)土壤中微生物分解后又可被植物吸收[3-4]。除此之外，CTS具有良好的生物相容性、可生物降解性、果蔬保鮮、殺菌殺蟲、抵御逆境、抗病誘導(dǎo)、促進(jìn)生長、提高產(chǎn)量等特性[5]。殼聚糖誘導(dǎo)植物抗病的方式主要是直接抑菌作用及誘導(dǎo)抗病性；誘導(dǎo)植物的結(jié)構(gòu)抗病性或誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性蛋白、木質(zhì)膠、木質(zhì)素與植保素和改變植物的代謝方式等[6-7]。羧甲基殼聚糖(carboxymethyl chitosan，CMCS)是殼聚糖羧甲基化反應(yīng)后的衍生物，它在保持殼聚糖優(yōu)良特性的基礎(chǔ)上，還具有良好的水溶性，所以羧甲基殼聚糖為主體的保鮮劑更有研究和應(yīng)用前景[8-9]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子和抗性相關(guān)基因主要與植物的抗逆性、衰老和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過程有關(guān)，WRKY參與調(diào)控植物抗逆相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)及抗性物質(zhì)合成代謝，提高植物抗逆能力。

本實(shí)驗(yàn)用1.5% CMCS溶液浸泡處理3 min，誘導(dǎo)葡萄柚24 h后，采用二代高通量測序技術(shù)，對(duì)葡萄柚進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，對(duì)抗性相關(guān)的差異表達(dá)基因進(jìn)行了功能注釋與比較分析，對(duì)殼聚糖的抑菌作用和誘導(dǎo)作用進(jìn)行了初步研究，為誘導(dǎo)葡萄柚抗性的分子研究奠定基礎(chǔ)，從而為殼聚糖在生產(chǎn)實(shí)踐上的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

指狀青霉和擴(kuò)展青霉為西南林業(yè)大學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從貯藏的里約紅葡萄柚發(fā)病果實(shí)上分離鑒定的菌種。于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上培養(yǎng)完成后，配制成濃度為1×105CFU·mL-1的孢子懸浮液(血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù))。

1.1.2 試劑

羧甲基殼聚糖(CMCS)，羧基化度≥80%，pH值8～10，水分≤10%，采購于上海騰準(zhǔn)生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 損傷接種

葡萄柚果實(shí)表面經(jīng)無菌水沖洗晾干之后采用75%的乙醇對(duì)果實(shí)表面進(jìn)行擦拭消毒，晾干后分別用1.5% CMCS溶液和無菌水(對(duì)照組，CK)浸泡葡萄柚果實(shí)3 min，室溫自然晾干。病原菌接種參照Bi等[10]的方法并稍作修改，用打孔器在葡萄柚果實(shí)赤道部位等距離地刺4個(gè)4 mm×4 mm的小孔。孔內(nèi)汁液自然晾干后，用移液槍分別向每個(gè)果實(shí)孔洞中定量注入20 μL濃度為1×105CFU·mL-1的P.digitatum和P.expansum孢子懸浮液。待孔內(nèi)汁液全部吸收后單果包裝，置于塑料筐內(nèi)室溫貯藏，每天觀察測定果實(shí)發(fā)病率和病斑直徑。

1.2.2 損傷自然發(fā)病

果實(shí)浸泡及損傷處理同1.2.1節(jié)，果實(shí)打孔后單果包裝，置于塑料筐內(nèi)室溫貯藏，每天觀察測定果實(shí)發(fā)病率和病斑直徑。

1.2.3 無損傷接種發(fā)病

果實(shí)浸泡處理同1.2.1節(jié)，室溫自然晾干后，采用分別裝有濃度為1×105CFU·mL-1的P.digitatum、P.expansum孢子懸浮液的手持氣壓式噴霧器對(duì)果實(shí)噴霧接菌，以果實(shí)表面濕潤但不滴水為宜，待果皮表面菌液全部晾干后單果包裝，置于塑料筐內(nèi)室溫貯藏，每天測定果實(shí)發(fā)病率和病斑直徑。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄組果實(shí)處理及取樣

6個(gè)葡萄柚果實(shí)處理同上。置于室溫條件下貯藏24 h后對(duì)葡萄柚果實(shí)進(jìn)行取樣，取樣時(shí)迅速分離果皮果肉，分別包裝于自封袋中，并迅速于-80 ℃超低溫冰箱貯藏。

1.3 果實(shí)樣本轉(zhuǎn)錄組測序分析

6個(gè)葡萄柚果皮樣品總RNA的提取、cDNA文庫的構(gòu)建以及轉(zhuǎn)錄組深度測序均委托基地奧司完成。

1.3.1 文庫構(gòu)建、測序數(shù)據(jù)分析

篩選FDR<0.05且|log2FC|>1的基因?yàn)轱@著差異基因，對(duì)達(dá)到此標(biāo)準(zhǔn)的DEGs進(jìn)行GO功能和KEGG富集分析，差異基因表達(dá)量用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差來表示，數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值。

1.3.2 基于蛋白序列的葡萄柚WRKY進(jìn)化樹構(gòu)建

利用開放閱讀框(ORF)(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)預(yù)測篩選出的CsWRKY基因的氨基酸序列，從TAIR數(shù)據(jù)庫中獲得了72個(gè)擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員的氨基酸序列，使用MAGA11.0軟件對(duì)葡萄柚WRKY蛋白和擬南芥中WRKY蛋白的氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，利用鄰接法(NJ，neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap值設(shè)為1 000，構(gòu)建擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族與CsWRKY的系統(tǒng)進(jìn)化樹。進(jìn)化樹結(jié)果用在線軟件Evolview(http：//www.evolgenius.info/evolview/)進(jìn)行美化。

1.3.3 熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測

采用RNAprep Pure總RNA提取試劑盒提取與測序同批的樣品總RNA，用Hifair?Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用Primer3 Plus進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，Primer design進(jìn)行引物校正，引物序列見表1。qRT-PCR體系采用Hieff UNICON?Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix和Corbett Rotor-Gene300熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測，反應(yīng)程序如下：95 ℃ 2 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 25 s，共40個(gè)循環(huán)。隨機(jī)選取9個(gè)DEGs進(jìn)行表達(dá)分析，以Action為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT估算待測差異基因的表達(dá)水平。

表1 qRT-PCR用引物序列

1.4 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用SPSS Statistics 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，利用t檢驗(yàn)方法分析不同處理組間差異，以P<0.05表示差異顯著，發(fā)病率用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差來表示，并使用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 CMCS誘導(dǎo)對(duì)葡萄柚抗指狀青霉和擴(kuò)展青霉的效果

由圖1-A、B可知，CMCS誘導(dǎo)間隔24 h損傷接種P.digitatum，CK、CMCS處理接種后第2天發(fā)病率分別為66.67%和33.33%，第3天發(fā)病率分別為100%和66.67%，CMCS處理組果實(shí)發(fā)病率顯著低于CK組果實(shí)(P<0.05)；CMCS誘導(dǎo)處理果實(shí)接種P.digitatum第6～8天，病斑直徑顯著小于CK組(P<0.05)。綜上所述，與對(duì)照組相比，CMCS處理顯著降低葡萄柚果實(shí)P.digitatum的發(fā)病率和病斑直徑(P<0.05)。由圖1-C、D可知，CMCS誘導(dǎo)間隔24 h損傷接種P.expansum，CK、CMCS處理接種后第2天發(fā)病率分別為83.33%和25.00%，第3天發(fā)病率分別為100%和66.67%，處理間差異顯著(P<0.05)；接種P.expansum第6、7天，CMCS處理組比對(duì)照組的病斑直徑小且增長速率降低，但兩者差異不顯著。

圖中沒有相同字母代表差異顯著(P<0.05)，下同。

由圖2可知，CMCS誘導(dǎo)間隔24 h，損傷自然發(fā)病第4天，CK發(fā)病率為100%，CMCS處理果實(shí)發(fā)病率為75%，顯著低于CK組果實(shí)(P<0.05)；第4、5天 CMCS處理的病斑直徑小于CK，分別降低41.67%和40.93%。綜上所述，CMCS浸泡處理能顯著降低葡萄柚果實(shí)損傷自然發(fā)病率和病斑直徑。

圖2 CMCS誘導(dǎo)處理葡萄柚果實(shí)損傷自然發(fā)病情況

由圖3-A、B可知，CMCS誘導(dǎo)間隔24 h，無損傷接種P.expansum第14 、15天，CK發(fā)病率分別為75%、100%，CMCS處理的發(fā)病率分別僅為25%和50%，CMCS處理果實(shí)發(fā)病率顯著低于CK果實(shí)(P<0.05)；第14、15天 CMCS處理的病斑直徑小于CK，較CK分別降低53.70%和40.41%，其中第15天兩者處理病斑直徑差異顯著(P<0.05)。綜上所述，與CK相比，CMCS浸泡處理能顯著降低無損傷接種P.expansum的發(fā)病率和病斑直徑。CK和CMCS處理的果實(shí)無損傷接種P.digitatum均未發(fā)病。

圖3 CMCS誘導(dǎo)處理葡萄柚果實(shí)不損傷接種P. expansum的發(fā)病情況

2.2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控報(bào)告

對(duì)上述1.5%CMCS浸泡誘導(dǎo)處理和對(duì)照的葡萄柚果皮進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，測序質(zhì)量控制后，結(jié)果如表2所示，誘導(dǎo)24 h的樣品共獲得33.60 Gb clean data。CK和CMCS堿基Q20平均值分別為98.19%和98.18%，堿基Q30平均值分別為94.27%和94.24%，GC含量分別達(dá)43.79%和43.75%；以上數(shù)據(jù)表明，本次轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)量和質(zhì)量都較高，準(zhǔn)確性高，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

表2 堿基信息統(tǒng)計(jì)表

2.3 參考基因組比對(duì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

由表3可知，對(duì)誘導(dǎo)處理組和對(duì)照組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，所獲得的純凈序列中，能定位到基因組上的純凈序列平均值分別為33 268 189條和32 837 615條，占比為81.68%～82.25%；在參考序列上，能比對(duì)上多個(gè)序列的基因的平均值為731 203.33和715 577.67條，占比為1.74%～1.89%；在參考序列上，只有唯一比對(duì)位置序列基因的平均值為32 536 985.33和32 122 037.33條，占比為79.85%～80.50%。其中能定位到純凈序列上的基因占比都超過81.68%，而在參考序列上有多個(gè)比對(duì)位置的基因序列數(shù)均小于2%；以上數(shù)據(jù)說明本次測序不存在污染并且參考基因組選擇合適，所選參考基因組組裝能滿足信息分析的需求。

表3 基因比對(duì)率統(tǒng)計(jì)表

2.4 組裝質(zhì)量統(tǒng)計(jì)

將上述測序結(jié)果的unigene序列使用Trinity軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。從圖4-A可知，N50的數(shù)量遠(yuǎn)低于基因的數(shù)量，而且其長度高于基因的平均長度，平均GC含量為39.32%。說明基因的組裝質(zhì)量合格，效果較好，可用于后續(xù)數(shù)據(jù)的分析和挖掘。

2.5 Unigene基本注釋

2.5.1 注釋結(jié)果匯總

由圖4-B的unigene基本功能注釋可知，處理組測序得到的39 390個(gè)基因，有27 337條(69.40%)unigene被注釋到Nr數(shù)據(jù)庫、24 842條(63.07%)unigene被注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫、14 330條(36.38%)unigene被注釋到KOG數(shù)據(jù)庫、17 718條(44.98%)unigene被注釋到SwissProt數(shù)據(jù)庫；總共有27 467條(69.73%)unigene被注釋到數(shù)據(jù)庫，沒有注釋到數(shù)據(jù)庫的一共有11 923(30.27%)條。其中，12 990條unigene在4個(gè)數(shù)據(jù)庫中都有注釋。

2.5.2 Nr注釋

Nr可以將核酸數(shù)據(jù)和蛋白數(shù)據(jù)聯(lián)系起來，并確定物種相似性。由圖4-C可以看出，CMCS處理的葡萄柚果實(shí)樣品注釋到Nr數(shù)據(jù)庫中31.21%的unigene與甜橙(Citrussinensis)已發(fā)表基因組序列匹配度最高，其次是克萊門柚(Citrusclementina)，占30.53%；粳稻(OryzasativaJaponicaGroup)，占10.23%；溫州蜜柑(Citrusunshiu)，占2.47%；扁桃(Prunusdulcis)，占1.95%；所涉及的unigene數(shù)目分別為8 533、8 345、2 796、675和533條。

圖4 Unigene長度分布圖(A)、四大數(shù)據(jù)庫注釋維恩圖(B)和Nr注釋物種分布圖(C)

2.6 CMCS誘導(dǎo)處理葡萄柚果皮差異表達(dá)基因分析

2.6.1 差異表達(dá)基因篩選

為了探究CMCS誘導(dǎo)處理對(duì)葡萄柚果皮的差異基因表達(dá)情況，以FDR<0.05且|log2FC|>1為條件篩選顯著差異表達(dá)基因。結(jié)果如圖5所示，CK-24 h-vs-CMCS-24 h，總共篩選出85個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因67個(gè)，下調(diào)基因18個(gè)。

圖5 差異基因統(tǒng)計(jì)圖(A)、差異基因火山圖(B)

2.6.2 差異表達(dá)基因的GO功能分類統(tǒng)計(jì)

如圖6所示，CMCS處理組，DEGs都被涉及到生物過程(biological process)、細(xì)胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)3個(gè)大類，總共包括在37個(gè)二級(jí)亞類。生物過程包括19個(gè)亞類，其中，以細(xì)胞過程(cellular process)、代謝過程(metabolic process)、應(yīng)激反應(yīng)(response to stimulus)和單生物過程(single-organism process)富集的DEGs最多，分別為50、46、38和38個(gè)，該4個(gè)亞類可能與細(xì)胞的能量代謝、生長等相關(guān)；細(xì)胞組分包括12個(gè)亞類，其中以細(xì)胞(cell)、細(xì)胞區(qū)域(cell part)和細(xì)胞器(organelle)富集到最多的DEGs，分別為42、41和29個(gè)，該3個(gè)亞類可能與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的運(yùn)輸、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)；分子功能的亞類數(shù)目最少，僅有6個(gè)，其中以催化活性(catalytic activity)、結(jié)合(binding)和核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性(nucleic acid binding transcription factor activity)富集到最多的DEGs，分別為22、23和10個(gè)。

圖6 GO富集分類柱狀圖

2.6.3 差異表達(dá)基因的KEGG生物通路分類統(tǒng)計(jì)

由圖7可知，DEGs被富集到20條pathway上，其中顯著富集(P<0.05)的pathway是戊糖、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換(pentose and glucuronate interconversions)、亞油酸代謝(linoleic acid metabolism)、維生素B6代謝(vitamin B6metabolism)、油菜素類酯生物合成(brassinosteroid biosynthesis)和代謝途徑(metabolic pathways)5條通路，富集的差異基因個(gè)數(shù)分別是2、1、1、1、10個(gè)。余下通路按照顯著性差異水平由高到低依次為硫胺素代謝(thiamine metabolism)、類胡蘿卜素生物合成(carotenoid biosynthesis)、植物晝夜節(jié)律(circadian rhythm-plant)、α-亞麻酸代謝(alpha-linolenic acid metabolism)、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝(alanine， aspartate and glutamate metabolism)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工(protein processing in endoplasmic reticulum)、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝(glycine， serine and threonine metabolism)、谷胱甘肽代謝(glutathione metabolism)、乙醛酸和二羧酸代謝(glyoxylate and dicarboxylate metabolism)、次生代謝產(chǎn)物生物合成(biosynthesis of secondary metabolites)、過氧化物酶體(peroxisome)、苯丙烷生物合成(Phenylpropanoid biosynthesis)、MAPK植物信號(hào)通路(MAPK signaling pathway-plant)、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(plant hormone signal transduction)、碳代謝(carbon metabolism)。

圖7 KO富集氣泡圖

2.7 WRKY轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)情況分析

根據(jù)差異表達(dá)基因的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，以P<0.05，|log2FC|>1為差異基因篩選條件，篩選WRKY家族差異表達(dá)基因，log2FC>1即為上調(diào)的差異基因，log2FC<-1為下調(diào)的差異基因。如表4所示，CMCS誘導(dǎo)處理葡萄柚果皮轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中，WRKY家族差異表達(dá)基因相較于對(duì)照組均顯著上調(diào)。其中，有5個(gè)WRKY基因顯著上調(diào)，分別是Unigene0016512(WRKY40)、Unigene0022945(WRKY53)、Unigene0004228(WRKY24)、Unigene0030218(WRKY54)、Unigene0015122(WRKY30)。

表4 CMCS誘導(dǎo)WRKY轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量

2.8 抗病性相關(guān)差異基因篩選分析

由表5可知，在DEGS富集的20條通路中，顯著富集通路5條(P<0.05)，篩選出與抗病性相關(guān)的基因11個(gè)，在多個(gè)與植物病害防衛(wèi)相關(guān)的通路中都有表達(dá)。所有通路中的DEGS既有上調(diào)表達(dá)又有下調(diào)表達(dá)，上調(diào)差異基因表達(dá)量均顯著高于未誘導(dǎo)處理(表6)，下調(diào)差異基因表達(dá)量顯著低于未誘導(dǎo)處理(表7)。其中，與抗病性相關(guān)的上調(diào)表達(dá)基因6個(gè)，分別編碼蛋白磷酸酶(PP2C)、丙氨酸-乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AGT1)、熱激蛋白(HSP17.4、HSP22.0)、谷氨酰胺環(huán)轉(zhuǎn)移酶(GGCT2；2)和9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(NCED1)，經(jīng)CMCS誘導(dǎo)處理顯著上調(diào)表達(dá)；與抗病性相關(guān)的下調(diào)表達(dá)基因共5個(gè)，分別編碼果膠甲酯酶(PME44、PME7)、脂氧合酶(LOX2.1)、過氧化物酶(PER63)和細(xì)胞色素P450(CYP92C6)。這些差異基因富集的通路分別是植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、次生代謝、過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、谷胱甘肽代謝。

表5 CMCS誘導(dǎo)葡萄柚24 h的差異基因

續(xù)表5 Continued Table 5

表6 CMCS誘導(dǎo)葡萄柚抗病性相關(guān)的上調(diào)差異基因表達(dá)量

2.9 抗病性相關(guān)差異基因與WRKY差異基因相關(guān)性聚類熱圖分析

對(duì)篩選出的相關(guān)抗病性差異表達(dá)基因(11個(gè))和WRKY差異基因(5個(gè))做相關(guān)性聚類分析，通過聚類圖(圖8)可以清楚地看到，這些基因按照抗性相關(guān)上調(diào)差異基因和抗性相關(guān)下調(diào)差異基因聚成兩類。WRKY差異基因(Unigene0016512(WRKY40)、Unigene0022945(WRKY53)、Unigene0004228(WRKY24)、Unigene0030218(WRKY54)、Unigene0015122(WRKY30))與上調(diào)抗病性相關(guān)差異基因(PP2C、AGT1、HSP17.4、HSP22.0、GGCT2；2NCED1)呈顯著正相關(guān)，與下調(diào)抗病性相關(guān)基因(PME44、PME7、LOX2.1、PER63、CYP92C6)呈顯著負(fù)相關(guān)。

2.10 基于蛋白序列的葡萄柚果皮WRKY進(jìn)化樹分析

為準(zhǔn)確地對(duì)葡萄柚果皮中WRKY基因家族進(jìn)行分類和功能預(yù)測，選擇差異表達(dá)的5個(gè)CsWRKY蛋白與擬南芥72個(gè)WRKY蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖9)。結(jié)果表明，WRKY進(jìn)化樹聚為6組，葡萄柚果皮差異表達(dá)WRKY基因聚在一組，CsWRKY40、CsWRKY24和CsWRKY54與AtWRKY5有較高同源性；CsWRKY53與AtWRKY73的同源性最高；CsWRKY30與AtWRKY16和AtWRKY52的同源性最高。葡萄柚WRKY基因與擬南芥WRKY基因同源性越高，親緣關(guān)系越近，蛋白功能越相似。

2.11 熒光定量PCR驗(yàn)證

隨機(jī)對(duì)WRKY、抗病性相關(guān)富集通路中篩選出的8個(gè)差異基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果表明，WRKY40、WRKY53、WRKY24、WRKY54、GGCT2；2、NCED1上調(diào)，PME7、LOX2.1下調(diào)，8個(gè)基因的調(diào)控趨勢與轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)一致，轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果得到驗(yàn)證(圖10)。

圖10 八個(gè)關(guān)鍵差異基因的qRT-PCR檢測

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，采用1.5%的CMCS溶液誘導(dǎo)處理葡萄柚果實(shí)，可顯著降低果實(shí)P.digitatum和P.expansum的發(fā)病率及病斑直徑增長速度。進(jìn)一步對(duì)上述處理果皮進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)果表明，CMCS處理誘導(dǎo)果實(shí)抗病性相關(guān)基因的表表達(dá)，KEGG分析發(fā)現(xiàn)，CMCS誘導(dǎo)的差異基因富集在抗病相關(guān)的多條代謝通路，包括次生代謝、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、過氧化物酶體、苯丙烷生物合成、谷胱甘肽代謝等通路。

此外，從WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族中篩選出5個(gè)差異基因(Unigene0016512(WRKY40)、Unigene0022945(WRKY53)、Unigene0004228(WRKY24)、Unigene0030218(WRKY54)、Unigene0015122(WRKY30))，其蛋白序列與72個(gè)擬南芥WRKY蛋白序列進(jìn)行進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)葡萄柚5個(gè)WRKY差異基因和擬南芥的一簇WRKY基因有較高同源性，蛋白功能相似；相關(guān)性聚類分析結(jié)果表明，5個(gè)WRKY基因與上調(diào)抗病性相關(guān)差異基因(PP2C、AGT1、HSP17.4、HSP22.0、GGCT2；2、NCED1)呈顯著正相關(guān)，推測WRKY基因的表達(dá)對(duì)其他抗病基因有一定的激活作用；同時(shí)，5個(gè)WRKY基因與下調(diào)抗性相關(guān)基因(PME44、PME7、LOX2.1、PER63、CYP92C6)呈顯著負(fù)相關(guān)；可推測WRKY基因能抑制抗性相關(guān)防御酶活性和部分下游抗病基因的表達(dá)，來參與采后果實(shí)的抗病過程。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子在與抗病相關(guān)的早期防衛(wèi)應(yīng)答調(diào)節(jié)中扮演重要角色，主要依賴SA信號(hào)途徑和JA信號(hào)途徑來發(fā)揮作用[11]。有研究證實(shí)，同時(shí)敲除AtWRKY11和AtWRKY17或只敲除AtWRKY11可減弱擬南芥對(duì)病原菌的抗性[12]；AtWRKY52基因的過表達(dá)使擬南芥具有耐青枯病能力[13]；在擬南芥中過表達(dá)GmWRKY16基因可以顯著提高擬南芥對(duì)干旱，鹽害等逆境的抗性[14]；擬南芥WRKY7、WRKY11和WRKY17可以調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶基因的轉(zhuǎn)錄水平來參與防御反應(yīng)[15]。

植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中蛋白磷酸酶(PP2C)可參與許多生物過程，其在響應(yīng)病原菌、鹽堿和干旱等過程中發(fā)揮重要作用[16]，研究表明在擬南芥和青蒿等植物中，PP2C對(duì)ABA信號(hào)途徑起負(fù)調(diào)控作用[17]。在擬南芥中過表達(dá)PP2C基因可增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)外源脅迫的抗性[18]。9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(NCED)是脫落酸(abscisic acid， ABA)的合成限速酶。研究表明，擬南芥中的AtNCED3[19]和番茄中的LeNCED1的過表達(dá)使內(nèi)源性ABA積累增加，植株耐旱性增強(qiáng)；楊樹的轉(zhuǎn)錄組研究，在干旱脅迫中，NCED基因表達(dá)明顯，ABA含量明顯增加[20]；CsNCED1與柑橘葉片和果實(shí)的ABA合成有關(guān)[21]。本實(shí)驗(yàn)中CMCS誘導(dǎo)處理葡萄柚后，果實(shí)PP2C和NCED1顯著上調(diào)表達(dá)，表明CMCS誘導(dǎo)可以增強(qiáng)PP2C和NCED1的基因表達(dá)量，調(diào)控內(nèi)源性ABA含量，并提高果實(shí)抗性。

丙氨酸-乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AGT1)是植物光呼吸的關(guān)鍵酶。AGT1是具有絲氨酸-乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶(SGAT)活性的丙氨酸乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶，能發(fā)揮SGAT的功能。SGAT是過氧化物酶體中標(biāo)志性酶，具有減少和消除活性氧的功能，對(duì)于光呼吸途徑的正常運(yùn)轉(zhuǎn)和碳、氮的代謝起著重要作用，還與植物的抗病性和衰老等生理過程密切相關(guān)[22]。SGAT在甜瓜中的過量表達(dá)起到了抵抗霜霉病的作用[23]。本研究中，在過氧化物酶體、代謝途徑、氨基酸代謝和碳代謝通路中，AGT1基因顯著上調(diào)，說明CMCS誘導(dǎo)能增強(qiáng)AGT1表達(dá)，發(fā)揮SGAT抗氧化的作用，降低病害侵襲造成的氧化脅迫損傷危害。

植物體在病原菌侵染脅迫下，熱激蛋白(HSP)能夠防止功能蛋白的變性，修復(fù)已變性的蛋白，防止細(xì)胞損傷，響應(yīng)環(huán)境壓力，提高植株對(duì)逆境的耐受力[24]。HSP20家族成員最多、分布最廣泛，調(diào)控植物的生長發(fā)育并參與脅迫。在抗逆機(jī)制中，HSP的積累和表達(dá)是抗逆的主要環(huán)節(jié)[25]。本研究中HSP17.4B和HSP22.0基因經(jīng)CMCS誘導(dǎo)后被激活，并顯著上調(diào)表達(dá)，說明CMCS誘導(dǎo)葡萄柚果實(shí)防御體系形成過程中有HSP20家族的參與。

谷氨酰胺環(huán)轉(zhuǎn)移酶(GGCT)參與谷胱甘肽降解，與植物抗逆性、花粉管的生長有關(guān)[26]。有研究表明，擬南芥響應(yīng)脅迫時(shí)，參與抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)的上調(diào)基因被激活，谷胱甘肽含量增加，減輕植物體內(nèi)的重金屬毒性和生長抑制[27]；本研究中，CMCS誘導(dǎo)調(diào)控葡萄柚果實(shí)谷胱甘肽代謝途徑，GGCT2；2基因表達(dá)量顯著上調(diào)，說明CMCS誘導(dǎo)激活谷胱甘肽代謝通路參與果實(shí)抗病體系的建立。

果膠甲酯酶(PME)是細(xì)胞壁代謝的關(guān)鍵酶之一，對(duì)植物細(xì)胞壁有降解作用，破壞植物防御，PME44和PME7是該基因家族的成員。研究表明，擬南芥植株受到病菌侵染時(shí)，PME基因表達(dá)量大幅上升[28]；在嘎拉蘋果發(fā)育過程中，PME基因表達(dá)量增加，果實(shí)硬度顯著下降[29]；本研究中，CMCS處理后，果實(shí)PME44、PME7基因表達(dá)量顯著下調(diào)，減緩細(xì)胞壁降解，強(qiáng)化物理屏障防護(hù)能力。

脂氧合酶(LOX)是植物脂肪酸代謝途徑中的關(guān)鍵限速酶，可以催化不飽和脂肪酸產(chǎn)生大量的活性氧，這些活性氧參與細(xì)胞膜脂的過氧化，破壞質(zhì)膜，從而導(dǎo)致細(xì)胞壞死[30]。研究證實(shí)，辣椒CaLOX1在鹽脅迫和干旱下表達(dá)量提高，過表達(dá)CaLOX1的擬南芥對(duì)ABA的抗性增強(qiáng)，通過調(diào)控ABA響應(yīng)基因來提高對(duì)鹽和干旱的脅迫[31]。本研究中，CMCS處理后，葡萄柚果實(shí)中LOX基因表達(dá)量降低，推測CMCS能緩解果實(shí)細(xì)胞質(zhì)膜被破壞，延緩細(xì)胞衰老死亡。

植物過氧化物酶(peroxidase，POD或Prx)是氧化還原酶中的一種，可催化去除H2O2，參與木質(zhì)部合成及外源脅迫響應(yīng)。在柑橘中，CsPrx25通過細(xì)胞壁木質(zhì)化和維持活性氧平衡，提高柑橘細(xì)菌性潰瘍病的抗逆性[32]。經(jīng)CMCS處理的葡萄柚果實(shí)，參與苯丙烷生物代謝的PER63基因表達(dá)量顯著下調(diào)，由此推測，CMCS可能增強(qiáng)果皮細(xì)胞壁木質(zhì)化，提高抗病性。

細(xì)胞色素P450(cytochrome P450，CYPs)被稱為“萬能的生物催化劑”，包括CYP71、CYP92、CYP73等多個(gè)家族。CYPs基因是植物防御體系響應(yīng)外界脅迫的重要組成部分，其表達(dá)受環(huán)境脅迫因子誘導(dǎo)，可通過脂肪酸、激素以及萜類、黃酮類等物質(zhì)的生物合成和調(diào)節(jié)作用，保護(hù)植物免受各種不利因子損傷[33]。CYP74B16通過催化脂肪酸的降解參與植物抗病信號(hào)通路[34]。本實(shí)驗(yàn)CMCS誘導(dǎo)處理葡萄柚果實(shí)，CYP92C6基因表達(dá)量在油菜素類酯生物合成、次生代謝和代謝途徑中顯著下調(diào)，推測CMCS對(duì)抗性物質(zhì)的合成具有調(diào)節(jié)作用。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采后CMCS浸泡處理可誘導(dǎo)提高葡萄柚果實(shí)對(duì)P.digitatum和P.expansum抗病性，通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)CMCS可以誘導(dǎo)WRKY轉(zhuǎn)錄因子與其他抗性基因相互作用，在葡萄柚果實(shí)抗病反應(yīng)中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，為葡萄柚抗性相關(guān)基因挖掘和抗性響應(yīng)的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。揭示了CMCS誘導(dǎo)果實(shí)產(chǎn)生抗性作用的機(jī)理，并為今后葡萄柚的采后運(yùn)輸和保存提供了一定的現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。