亞致死劑量呋蟲(chóng)胺對(duì)意大利蜜蜂采集蜂免疫解毒相關(guān)基因表達(dá)和酶活性的影響

張宇昊，馬衛(wèi)華，劉晉佳，馬秀梅，姜玉鎖，*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801)

意大利蜜蜂(Apismelliferaligustica)具有產(chǎn)量高、易管理、繁殖能力強(qiáng)等特點(diǎn)，已成為我國(guó)主要飼養(yǎng)的蜜蜂品種。它不僅能夠通過(guò)蜂產(chǎn)品創(chuàng)造價(jià)值，還能通過(guò)授粉提高作物產(chǎn)量并改善作物品質(zhì)為人類(lèi)帶來(lái)更大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，因此，意大利蜜蜂對(duì)促進(jìn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的作用。近年來(lái)，隨著農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化、規(guī)模化的飛速發(fā)展，各式各樣的殺蟲(chóng)劑被廣泛地使用導(dǎo)致授粉昆蟲(chóng)生存條件惡劣，數(shù)量正在急劇下降。從2006年冬季開(kāi)始，美國(guó)出現(xiàn)蜂群崩潰失調(diào)現(xiàn)象造成蜂農(nóng)飼養(yǎng)的蜜蜂大面積消失，野生蜜蜂豐度和多樣性下降[1]。有研究指出，引發(fā)該現(xiàn)象的主要原因之一是蜜蜂長(zhǎng)期暴露在殘留的化學(xué)毒素環(huán)境中[2]。因此，如何保護(hù)蜜蜂從而維持長(zhǎng)期穩(wěn)定的生態(tài)環(huán)境已成為全球亟待解決的生物安全問(wèn)題。

新煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑是當(dāng)前普遍采用的殺蟲(chóng)劑類(lèi)別，具備出色的內(nèi)吸活性、高效率、高持續(xù)性，是有效防治刺吸式口器害蟲(chóng)(木虱、蚜蟲(chóng)、粉虱、葉蟬、椿象)的首選藥劑。新煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑的作用機(jī)制主要是通過(guò)選擇性結(jié)合昆蟲(chóng)神經(jīng)系統(tǒng)的乙酰膽堿受體(AchR)結(jié)合位點(diǎn)，阻斷昆蟲(chóng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常傳導(dǎo)，導(dǎo)致昆蟲(chóng)過(guò)度興奮，最終麻痹而死，此外，新煙堿殺蟲(chóng)劑被植物吸收后殘留于花蜜和花粉之中除了能有效殺滅靶標(biāo)昆蟲(chóng)外，還會(huì)對(duì)許多傳粉媒介產(chǎn)生負(fù)面影響[3-4]。蜜蜂日常的采集行為，會(huì)大量接觸到殘留農(nóng)藥的花粉花蜜。近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)，新煙堿殺蟲(chóng)劑會(huì)造成蜜蜂腦部受損[5]并且影響蜜蜂采食效率[6-7]、記憶和飛行能力[8]，新煙堿殺蟲(chóng)劑會(huì)降低蜜蜂的繁殖力和生長(zhǎng)速度[9]。此外，亞致死劑量的新煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑已被證明會(huì)損害蜜蜂的學(xué)習(xí)能力并導(dǎo)致其免疫系統(tǒng)受損[10]。

呋蟲(chóng)胺作為用于防治害蟲(chóng)的新一代新煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑，具備速效、無(wú)抗藥性、滲透性強(qiáng)、殺蟲(chóng)譜廣等特性。近年來(lái)，關(guān)于呋蟲(chóng)胺脅迫對(duì)意大利蜜蜂影響的相關(guān)研究表明，呋蟲(chóng)胺在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)成年工蜂的毒性等級(jí)為高毒[11]。新出房的工蜂經(jīng)LC10劑量的呋蟲(chóng)胺處理后，腦部差異表達(dá)的miRNA主要與蜜蜂的發(fā)育、神經(jīng)傳導(dǎo)和免疫防御有關(guān)[12]。然而目前關(guān)于亞致死劑量呋蟲(chóng)胺脅迫對(duì)意大利蜜蜂采集蜂免疫解毒相關(guān)基因表達(dá)及免疫解毒酶系活性的影響鮮有報(bào)道。

本試驗(yàn)旨在探究亞致死劑量呋蟲(chóng)胺脅迫下，意大利蜜蜂采集蜂免疫解毒相關(guān)基因表達(dá)情況及免疫解毒酶系活力。對(duì)Abaecin、Apidaecins、Defensin-1、Hymenoptaecin、AChE-2、PPO、GST和Cyp450基因的表達(dá)量情況，飼喂后蜜蜂體內(nèi)多酚氧化酶、乙酰膽堿酯酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和過(guò)氧化氫酶活性變化。試驗(yàn)結(jié)果可為進(jìn)一步明確亞致死劑量呋蟲(chóng)胺對(duì)蜜蜂健康的影響提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

原藥呋蟲(chóng)胺購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress公司，丙酮(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)，TRIZOL(Thermo公司)，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) 試劑盒(TaKaRa公司)，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus) 試劑盒(TaKaRa公司)，總蛋白定量測(cè)定試劑盒、乙酰膽堿酯酶(AchE)測(cè)定試劑盒、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)測(cè)定試劑盒、多酚氧化酶(PPO)測(cè)定試劑盒、過(guò)氧化氫酶(CAT)測(cè)定試劑盒和總超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；人工氣候箱、EU-2600A紫外分光光度計(jì)(上海昂拉儀器有限公司)，熒光定量PCR儀(BIORAD公司)。

1.2 供試蜜蜂

試驗(yàn)所用的意大利蜜蜂取自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)蜂場(chǎng)，上午9：00在3個(gè)健康群體的蜂箱入口處抓取攜帶花粉的采集蜂，將收集到的蜜蜂轉(zhuǎn)移至塑料飼喂盒(8 cm×8 cm×6.5 cm，長(zhǎng)×寬×高)中，每盒30只，共21盒(對(duì)照組和6個(gè)處理組，每組3個(gè)重復(fù))，隨后將飼喂盒放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h(溫度28 ℃，相對(duì)濕度70%，黑暗)，用于呋蟲(chóng)胺急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)；另抓取攜帶花粉的采集蜂，每盒30只，共9盒(對(duì)照組和2個(gè)處理組各3盒)用于亞致死劑量呋蟲(chóng)胺處理。

1.3 呋蟲(chóng)胺的處理

取10 mg呋蟲(chóng)胺原藥溶于100 mL丙酮中制成100 mg·L-1的呋蟲(chóng)胺儲(chǔ)液。將適量的儲(chǔ)液通過(guò)50%蔗糖溶液稀釋至不同濃度梯度。將收集的蜜蜂饑餓處理2 h后，向塑料飼喂盒中加入不同濃度梯度的蜜藥混合液(每只蜜蜂15 μL)，待消耗完畢后加入50%的蔗糖溶液，讓其自由取食，每8 h更換蔗糖溶液，并移除死蜂，連續(xù)記錄48 h，求出毒力曲線。

根據(jù)急性毒性試驗(yàn)的結(jié)果，采用LC20和LC50的呋蟲(chóng)胺處理蜜蜂，處理48 h后，直接放入液氮速凍，轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱中凍存。

1.4 RNA的提取及cDNA的合成

每組取3只意蜂于液氮中研磨，按照比例(1∶1 000)加一定量TRIZOL提取總RNA，使用NanoDrop 2000檢測(cè)RNA質(zhì)量及濃度，將所有樣品RNA濃度調(diào)至500 ng·mL-1，依照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA的合成。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

使用熒光定量試劑盒進(jìn)行qRT-PCR分析，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性20 s；95 ℃變性20 s，60 ℃退火及延伸20 s，45個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參基因，結(jié)果根據(jù)2-ΔΔCT法計(jì)算并分析，引物序列見(jiàn)表1。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物對(duì)序列信息

1.6 免疫解毒酶系活力的測(cè)定

1.6.1 酶液的制備

分別取對(duì)照組和2個(gè)處理組各3只蜜蜂，用冰冷的生理鹽水進(jìn)行沖洗，隨后放入液氮研磨，稱(chēng)量0.2 g組織放入有1.8 mL的勻漿介質(zhì)的燒杯內(nèi)，在冰浴條件下用手持勻漿儀勻漿5 min。最后在高速冷凍離心機(jī)(4 ℃，12 000×g)中離心15 min，收集上清液作為酶提取液，放入-80 ℃保存。

1.6.2 蛋白含量測(cè)定

采用BCA法[13]對(duì)酶液進(jìn)行總蛋白含量的測(cè)定。

1.6.3 酶活性測(cè)定

按照南京建成生物工程研究所的試劑盒說(shuō)明測(cè)定各組意蜂體內(nèi)PPO、AChE、SOD、GST和CAT的活性。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件(版本26.0)進(jìn)行分析，方法用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的單因素方差分析法(one-way ANOVA)，多重比較用LSD法，進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)(P<0.05為差異顯著)，結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示。使用GraphPadPrism 7軟件包進(jìn)行圖形制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 毒力測(cè)定

試驗(yàn)設(shè)置了3、1.5、0.75、0.375、0.187 5、0.093 75 mg·L-1共6個(gè)處理組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30只蜜蜂。經(jīng)計(jì)算得出呋蟲(chóng)胺脅迫意大利蜂采集蜂的LC20和LC50分別為0.458和0.988 mg·L-1，結(jié)果見(jiàn)圖1。

y為呋蟲(chóng)胺濃度的常用對(duì)數(shù)值；x為死亡概率。

2.2 呋蟲(chóng)胺對(duì)意大利蜜蜂采集蜂體內(nèi)免疫解毒相關(guān)基因表達(dá)的影響

采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了意蜂取食0.458mg·L-1和0.988 mg·L-1呋蟲(chóng)胺蔗糖溶液48 h后，4種免疫相關(guān)抗菌肽基因Abaecin、Apidaecins、Defensin-1和Hymenoptaecin以及4種解毒基因AChE-2、PPO、GST、Cyp450的表達(dá)量變化。

LC20組中PPO、Apidaecins、Defensin-1和Hymenoptaecin基因表達(dá)量與對(duì)照組相比有顯著上調(diào)趨勢(shì)；LC50組中AChE-2、PPO、GST、Cyp450、Apidaecins和Defensin-1表達(dá)量有顯著上調(diào)趨勢(shì)，Abaecin和Hymenoptaecin基因表達(dá)量有顯著下調(diào)趨勢(shì)。LC50組中的Abaecin和Hymenoptaecin表達(dá)量均顯著低于LC20組，而AChE-2、PPO、GST、Cyp450和Apidaecins基因表達(dá)量顯著高于LC20組(圖2)。

CK，50%蔗糖水；LC20，0.458 mg·L-1呋蟲(chóng)胺蔗糖溶液；LC50，0.988 mg·L-1呋蟲(chóng)胺蔗糖溶液。下同。同一基因下，柱上無(wú)相同字母的表示處理間差異顯著(P<0.05)。

2.3 呋蟲(chóng)胺對(duì)意大利蜜蜂采集蜂免疫解毒酶系活性的影響

LC20組與對(duì)照組相比(圖3)，AChE、CAT和SOD活性均有顯著下調(diào)趨勢(shì)；LC50組與對(duì)照組相比，AChE、PPO、CAT和SOD活性均有顯著下調(diào)趨勢(shì)。

柱上無(wú)相同字母的表示處理間差異顯著(P<0.05)。

3 討論

蜜蜂作為傳粉媒介在陸地生態(tài)系統(tǒng)和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中發(fā)揮重要的功能作用，隨著殺蟲(chóng)劑的廣泛使用，傳粉媒介極有可能接觸到殘留的殺蟲(chóng)劑導(dǎo)致健康受損[14]。亞致死劑量的殺蟲(chóng)劑會(huì)影響昆蟲(chóng)的生理、行為和種群密度[15-16]，會(huì)降低昆蟲(chóng)的繁殖力和存活率[17-18]。有研究發(fā)現(xiàn)，亞致死劑量噻蟲(chóng)嗪脅迫蜜蜂會(huì)導(dǎo)致免疫相關(guān)基因發(fā)生變化[19]，此外，亞致死劑量的吡蟲(chóng)啉破壞了蜜蜂的求偶行為導(dǎo)致交配率下降80%[20]。我們首先在實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定了呋蟲(chóng)胺脅迫蜜蜂的急性經(jīng)口毒性大小，發(fā)現(xiàn)在48 h時(shí)LC20和LC50分別0.458和0.988 mg·L-1，并探究了兩個(gè)亞致死濃度(0.458和0.988 mg·L-1)呋蟲(chóng)胺脅迫對(duì)意大利蜜蜂采集蜂免疫解毒相關(guān)基因表達(dá)變化及酶活性變化的影響。

蜜蜂的先天免疫反應(yīng)由復(fù)雜的個(gè)體機(jī)制和特殊行為組成。包括細(xì)胞免疫和體液免疫，可針對(duì)環(huán)境中殘留的殺蟲(chóng)劑作出即時(shí)反應(yīng)，如基因的調(diào)控和體液因子的激活。Abaecin是一種抗菌肽，屬于富含脯氨酸的肽家族，有更廣譜的抗革蘭氏陰性菌作用[21]。Defensin-1是屬于富含半胱氨酸的陽(yáng)離子抗菌肽家族，在抵御入侵病原體的防御中起關(guān)鍵作用[22]。Hymenoptaecin是一種由 93 個(gè)氨基酸組成的線性肽，屬于富含甘氨酸的肽家族，能夠抑制革蘭氏陰性菌生長(zhǎng)[23]。Apidaecins是一種含有18個(gè)氨基酸殘基的小肽，富含脯氨酸，主要對(duì)革蘭氏陰性菌起作用[24]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，LC50組Abaecin和Hymenoptaecin表達(dá)量均顯著下調(diào)說(shuō)明呋蟲(chóng)胺會(huì)負(fù)面影響意蜂的免疫功能，同時(shí)Apidaecins和Defensin-1表達(dá)量顯著上調(diào)，我們認(rèn)為當(dāng)受到外來(lái)物質(zhì)的挑戰(zhàn)時(shí)，這兩個(gè)基因的表達(dá)是有助于蜜蜂應(yīng)對(duì)呋蟲(chóng)胺的脅迫，說(shuō)明呋蟲(chóng)胺脅迫會(huì)刺激蜜蜂的免疫應(yīng)答，改變免疫基因的表達(dá)量，有助于揭示呋蟲(chóng)胺對(duì)意大利蜜蜂免疫系統(tǒng)的影響。

AChE-2主要分布于蜜蜂的中樞神經(jīng)內(nèi)，參與體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞[25-26]。PPO通過(guò)轉(zhuǎn)錄翻譯多酚氧化酶，在蜜蜂生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮作用[27]。GST是多功能抗氧化酶超家族的成員，在解毒和防止由活性氧引起的氧化損傷方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Cyp450是存在于昆蟲(chóng)體內(nèi)的多功能解毒酶，參與對(duì)殺蟲(chóng)劑的解毒代謝作用[28]。結(jié)果顯示，LC50組的AChE-2、PPO、GST和Cyp450的表達(dá)量均顯著上調(diào)，說(shuō)明呋蟲(chóng)胺對(duì)解毒基因有誘導(dǎo)效應(yīng)，這與先前的研究結(jié)果相似，吡蟲(chóng)啉對(duì)Ace2具有誘導(dǎo)效應(yīng)[29]。噻蟲(chóng)嗪將誘導(dǎo)意大利蜜蜂CYP6AS3和CYP6AS5基因的上調(diào)表達(dá)[30]。

AChE、PPO、GST、CAT和SOD均為蜜蜂體內(nèi)重要的解毒代謝酶系。AChE可催化神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿水解為膽堿和醋酸鹽，是新煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑的主要作用靶標(biāo)[31]。GST是一種昆蟲(chóng)體內(nèi)的主要解毒酶，能夠代謝內(nèi)源性和外源性化合物[32]。SOD和CAT是清除昆蟲(chóng)體內(nèi)多余的活性氧，可抵御這些活性氧化劑引起的氧化損傷，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激和損傷方面發(fā)揮重要作用。PPO是一種免疫蛋白，主要介導(dǎo)昆蟲(chóng)體液免疫系統(tǒng)[33]。本研究中試驗(yàn)組體內(nèi)的GST與對(duì)照沒(méi)有顯著差異，表明意大利蜜蜂體內(nèi)的GST沒(méi)有受到呋蟲(chóng)胺的脅迫而激活。而亞致死劑量呋蟲(chóng)胺處理組中蜜蜂體內(nèi)的其他4種酶活性與對(duì)照組相比均顯著下調(diào)，進(jìn)一步說(shuō)明亞致死劑量呋蟲(chóng)胺脅迫下抑制意大利蜜蜂解毒酶系活性，導(dǎo)致蜜蜂對(duì)呋蟲(chóng)胺的代謝能力下降，最終可能會(huì)影響蜜蜂的行為能力。

4 結(jié)論

綜上，本研究通過(guò)毒力測(cè)定、免疫解毒相關(guān)基因表達(dá)和解毒酶系活性3個(gè)層面探索亞致死劑量呋蟲(chóng)胺對(duì)意大利蜜蜂采集蜂的影響。結(jié)果表明，亞致死劑量呋蟲(chóng)胺脅迫影響意大利蜜蜂采集蜂免疫解毒相關(guān)基因的表達(dá)及解毒酶系活性，擾亂意大利蜜蜂正常的免疫系統(tǒng)進(jìn)而對(duì)其健康和生存造成影響。研究結(jié)果可為深入研究亞致死劑量呋蟲(chóng)胺對(duì)意大利蜜蜂代謝和生理的影響進(jìn)一步提供依據(jù)。