嗜熱菌篩選及其促進(jìn)沼渣和蟲糞共堆肥的效果

肖小蘭，張 浩，付傳僡，劉 皓，阮文權(quán)，*

(1.江南大學(xué) 環(huán)境與土木工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122； 2.英塞克高效生態(tài)農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)有限公司，江蘇 蘇州 215636)

日常生活、餐飲服務(wù)和食品生產(chǎn)等活動會產(chǎn)生大量的餐廚垃圾。據(jù)報(bào)道，我國餐廚垃圾年產(chǎn)量達(dá)9 000萬t[1]。餐廚垃圾具有含水率高、易腐爛等特點(diǎn)，易對生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重危害[2]。餐廚垃圾經(jīng)高溫蒸煮和三相分離后產(chǎn)生有機(jī)漿液和有機(jī)固渣，其中，有機(jī)漿液經(jīng)厭氧消化可將有機(jī)物轉(zhuǎn)化為沼氣能量。然而，厭氧消化周期性排泥會產(chǎn)生大量沼渣(即餐廚有機(jī)漿液厭氧沼渣)。這些沼渣含水率高，碳氮比失衡，難以處理。有機(jī)固渣含有豐富的蛋白質(zhì)和碳水化合物，可利用黑水虻幼蟲將其轉(zhuǎn)化為具有高附加值的昆蟲體蛋白[3]，并排出代謝產(chǎn)物(即黑水虻蟲糞)，但蟲糞存在鹽度高、惡臭和水分含量高等特點(diǎn)[4]，仍需進(jìn)一步處理。共堆肥可將多種有機(jī)固體廢棄物分解轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的腐殖質(zhì)，形成營養(yǎng)豐富的有機(jī)肥料[5]，是處理餐廚有機(jī)漿液厭氧沼渣和黑水虻蟲糞的理想方法。

根據(jù)堆肥過程中溫度的變化，可將堆肥分為4個(gè)時(shí)期——升溫期、高溫期、降溫期和腐熟期。其中，高溫期是有機(jī)物降解的主要階段。其間，蛋白質(zhì)、多糖、木質(zhì)纖維素等物質(zhì)被微生物分解，堆肥體積明顯減小，蟲卵、病原菌被滅活。高溫期的嗜熱微生物是決定堆肥質(zhì)量的關(guān)鍵因素。然而，Nakasaki等[6]報(bào)道，細(xì)菌和真菌的豐富度和多樣性在高溫期均降低。這不利于有機(jī)物的高效降解。近來，研究人員嘗試在堆肥中接種嗜熱菌劑，以期提高堆肥質(zhì)量。李昌寧等[7]發(fā)現(xiàn)，向豬糞堆肥中接種耐高溫菌劑可使高溫期提前2 d，并延長高溫期2 d，可加快堆肥腐熟；錢玉婷等[8]向雞糞堆肥中接種嗜熱菌劑，總養(yǎng)分(N+P2O5+K2O)含量提高了5.03%，種子發(fā)芽指數(shù)提高了21.73%；王玉等[9]在豬糞堆肥中接種極端嗜熱菌劑，種子發(fā)芽指數(shù)和胡富比分別提高了35.9%和21.3%，改善了堆肥品質(zhì)。由此可見，在堆肥中接種嗜熱菌劑可延長堆肥高溫期，減少植物毒性，增強(qiáng)堆肥的腐殖化程度，提高產(chǎn)品肥效。然而，也有研究表明，接種菌劑對堆肥沒有效果[10]。主要原因是，相較于堆肥原生境的微生物，接種的外源微生物對堆肥環(huán)境的適應(yīng)性較差，無法達(dá)到預(yù)期效果[9]。為了減少接種菌劑和土著微生物之間的拮抗作用，不少研究直接以原堆肥樣品為菌種來源，優(yōu)選功能微生物制成菌劑進(jìn)行接種。徐谞等[11]從豬糞堆肥高溫期篩選了3株芽孢桿菌并進(jìn)行接種，有效促進(jìn)了豬糞堆肥的發(fā)酵腐熟；Xu等[12]從牛糞-甘蔗葉堆肥中篩選并復(fù)配多功能復(fù)合嗜熱菌劑，將其接種回牛糞—甘蔗葉堆肥后，提高了細(xì)菌和真菌群落的復(fù)雜性和多樣性。這說明，從堆肥原生境中篩選、富集和培養(yǎng)土著微生物，將其制備成菌劑后再接種到原堆肥中，可能在維持菌劑有效性、提高堆肥質(zhì)量上具有一定的積極作用。

目前，國內(nèi)外關(guān)于通過共堆肥方式處理餐廚有機(jī)漿液厭氧沼渣與黑水虻蟲糞的研究較少，而且，這二者在共堆肥的過程中存在高溫期較短、降解不充分等問題。為此，本文從餐廚有機(jī)漿液厭氧沼渣和黑水虻蟲糞共堆肥高溫期篩選能夠耐高溫，同時(shí)在降解有機(jī)物方面具有優(yōu)勢的細(xì)菌和真菌，將其復(fù)配成嗜熱菌劑接種回共堆肥中，監(jiān)測共堆肥過程中理化性質(zhì)、有機(jī)質(zhì)降解率、種子發(fā)芽指數(shù)、腐殖質(zhì)組成和含量、三維熒光光譜的變化，探討其對共堆肥效果的影響，并通過高通量測序分析接種嗜熱菌劑對堆肥過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，旨在為促進(jìn)有機(jī)固廢的優(yōu)質(zhì)堆肥提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)原料

1.1.1 堆肥原料

沼渣系張家港某餐廚垃圾處理廠餐廚有機(jī)漿液厭氧沼渣發(fā)酵沼氣池(全混式厭氧發(fā)酵工藝)內(nèi)污泥混合液經(jīng)過離心脫水后的固渣；黑水虻蟲糞和水稻秸稈取自張家港某黑水虻養(yǎng)殖場。將水稻秸稈攪碎至1 cm左右長度，用于調(diào)節(jié)堆肥的碳氮比和孔隙度。

將上述堆肥原料的基礎(chǔ)理化性質(zhì)整理于表1。

表1 堆肥原料的基礎(chǔ)理化性質(zhì)

1.1.2 培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g·L-1，酵母浸膏5 g·L-1，氯化鈉10 g·L-1，瓊脂18 g·L-1。

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g·L-1，酵母浸膏5 g·L-1，氯化鈉10 g·L-1。

孟加拉紅培養(yǎng)基：蛋白胨5 g·L-1，葡萄糖10 g·L-1，瓊脂20 g·L-1，磷酸二氫鉀1 g·L-1，硫酸鎂0.5 g·L-1，氯霉素0.1 g·L-1，孟加拉紅0.033 g·L-1。

馬鈴薯葡萄糖肉湯(PDB)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1。

1.2 菌種來源與嗜熱菌劑制備

1.2.1 嗜熱菌分離

取餐廚有機(jī)漿液厭氧沼渣和黑水虻蟲糞共堆肥高溫期樣品10 g于250 mL錐形瓶中，加入90 mL經(jīng)滅菌處理的0.9%氯化鈉溶液，振蕩30 min，得到濃度為10-1的菌液。隨后，在無菌操作臺中梯度稀釋，得到濃度依次為10-2、10-3、…、10-9的菌液。將菌液涂布到LB固體培養(yǎng)基(篩選細(xì)菌)和孟加拉紅培養(yǎng)基(篩選真菌)上，50 ℃恒溫培養(yǎng)。長出菌落后，挑選形態(tài)不同的單菌落進(jìn)一步劃線純化，獲得純度較高的單菌落。將細(xì)菌接種至LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)(50 ℃，120 r·min-1)至對數(shù)生長期，然后置于體積分?jǐn)?shù)50%的甘油中，-20 ℃保存。真菌采用斜面低溫保藏法，在-20 ℃條件下保存。

1.2.2 菌株酶活檢測

采用糖化酶測試盒、堿性蛋白酶測試盒、脲酶測試盒、纖維素酶/羧甲基纖維素酶測試盒、堿性木聚糖酶測試盒和漆酶測試盒(均購自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行粗酶液提取和菌株相應(yīng)酶活的檢測。其中，糖化酶活性以每1 min分解可溶性淀粉產(chǎn)生1 mg葡萄糖所需酶量為1個(gè)酶活單位，蛋白酶活性以每1 min催化水解酪蛋白溶液產(chǎn)生1 nmol酪氨酸為1個(gè)酶活單位，脲酶活性以每1 min水解尿素產(chǎn)生1 μg NH3-N為1個(gè)酶活單位，纖維素酶活性以每1 min催化水解羧甲基纖維素鈉產(chǎn)生1 μg葡萄糖為1個(gè)酶活單位，木聚糖酶活性以每1 min分解木聚糖產(chǎn)生1 nmol還原糖所需酶量為1個(gè)酶活單位，漆酶活性以每1 min氧化1 nmol底物ABTS[2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽]所需酶量為1個(gè)酶活單位。

1.2.3 菌種鑒定

綜合酶活指標(biāo)，優(yōu)選耐高溫菌株送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。其中，16S rDNA數(shù)據(jù)在核糖體數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，ITS序列信息在NCBI數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行Blast比對。

1.2.4 嗜熱菌劑制備

將優(yōu)選的細(xì)菌菌株在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)(50 ℃，120 r·min-1)2 d，得到微生物懸浮液。將優(yōu)選的真菌菌株在PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)(50 ℃，120 r·min-1)5 d，得到微生物懸浮液。將不同微生物懸浮液等體積混合，制得嗜熱菌劑，其有效活菌數(shù)≥1×108mL-1。

1.3 堆肥設(shè)計(jì)與樣品采集

以餐廚有機(jī)漿液厭氧沼渣和黑水虻蟲糞為原料，以(水稻)秸稈為調(diào)理劑，按照沼渣、蟲糞、秸稈質(zhì)量比3∶1∶4的比例(以濕重計(jì))進(jìn)行共堆肥[碳氮比(C/N)約為25]，補(bǔ)充蒸餾水，調(diào)節(jié)含水率至60%左右。堆料混合均勻后，放入25 L塑料桶。堆肥共持續(xù)30 d，前14 d每隔2 d人工翻堆1次，之后每隔4 d人工翻堆1次，以保證充足的氧氣。分別在堆肥的第2天和第8天，按堆料干重的5%接種嗜熱菌劑，將其作為接種組(T)；空白組(CK)中加入等量的LB液體培養(yǎng)基和PDB培養(yǎng)基混合液(體積比1∶1)。接種組和空白組各設(shè)置3組平行。在試驗(yàn)的0、2、5、10、15、20、25、30 d采用五點(diǎn)取樣法取樣。樣品一部分在4 ℃ 貯藏，用于測定pH值、根長、種子發(fā)芽率，及有機(jī)質(zhì)、溶解性有機(jī)碳(DOC)、腐殖質(zhì)(HS)、胡敏酸(HA)、富里酸(FA)含量；一部分在-20 ℃貯藏，用于高通量測序。參照文獻(xiàn)[13]的方法計(jì)算種子發(fā)芽指數(shù)(GI)。

1.4 分析方法

1.4.1 物理化學(xué)性質(zhì)分析

用T-115型電子溫度計(jì)(深圳市拓爾為電子科技有限公司)測定堆體溫度。將樣品在105 ℃條件下烘至恒重，測定含水率。將樣品置于馬弗爐中，600 ℃持續(xù)6 h，測定有機(jī)質(zhì)含量。按照白玲等[14]所用方法提取和測定DOC。參照Zhang等[13]報(bào)道，測定pH值、GI，以及總碳(TC)、總氮(TN)、P2O5、K2O含量。其中，測定GI所用種子為黑麥草種子，發(fā)芽天數(shù)為3 d。腐殖質(zhì)、富里酸和胡敏酸含量按照Wu等[15]所用方法進(jìn)行提取和測定。

1.4.2 三維熒光光譜分析

將堆肥樣品與去離子水按照1∶10的質(zhì)量體積比混合，150 r·min-1振蕩2 h，然后將懸浮液在4 000 r·min-1離心5 min，用0.45 μm水系膜過濾。所得濾液按相同比例稀釋后，用F-7000型熒光分光光度計(jì)(日本Hitachi)測定三維熒光光譜。掃描速度設(shè)置為12 000 nm·min-1，電壓為600 V，激發(fā)波長(EX)為200～450 nm，發(fā)射波長(EM)為250～550 nm，激發(fā)增量均為5 nm，狹縫均設(shè)置為5 nm。

1.4.3 高通量測序分析

使用Qiagen DNeasy PowerSoil Kit 試劑盒(上海Qiagen)提取接種組和空白組第5、15、30天樣品的微生物DNA。用于細(xì)菌高通量測序的引物為341F(5′-CCTACGGGGNGGCWGCAG-3′)和805R(5′-GACTACHVGGTATCTACC-3′)，用于真菌高通量測序的引物為ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：5×FastPfu緩沖液4 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL，引物(5 μmol·L-1)各0.8 μL， FastPfu聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，不足部分用ddH2O補(bǔ)齊。測序平臺為Illumina MiSeq。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

使用Excel 2016軟件整理數(shù)據(jù)，使用Origin 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜熱菌的篩選與鑒定

從共堆肥高溫期樣品中共分離、純化得到4株細(xì)菌和4株真菌，將得到的細(xì)菌菌株分別命名為B1、B2、B3和B4，真菌菌株分別命名為F1、F2、F3和F4。

據(jù)報(bào)道，嗜熱菌產(chǎn)生的降解酶具有較好的熱穩(wěn)定性，能夠在高溫期更有效地降解有機(jī)物和殺死病原微生物[9]。對分享得到的8株嗜熱菌的酶活進(jìn)行測定(圖1)。對于分離到的細(xì)菌菌株來說，B2和B4的糖化酶、纖維素酶、漆酶、脲酶、蛋白酶和木聚糖酶的活性均高于B1和B3，表明相較于另外2株細(xì)菌菌株，B2和B4在堆肥高溫期可更高效地降解葡萄糖、蛋白質(zhì)和木質(zhì)纖維素等有機(jī)物。對于分離到的真菌菌株來說，F(xiàn)1、F2、F3和F4的糖化酶活性分別為13.29、15.03、12.61、11.28 U·mL-1，說明其都具有一定的葡萄糖降解能力。但是，F(xiàn)1和F2的纖維素酶和漆酶活性要高于F3和F4，說明這2株真菌在堆肥高溫期可更高效地降解木質(zhì)纖維素。此外，對比細(xì)菌和真菌的酶活發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌在降解葡萄糖、蛋白質(zhì)、尿素和木聚糖方面更具優(yōu)勢，而真菌降解木質(zhì)纖維素的能力更強(qiáng)。綜上，選擇B2、B4、F1和F2為接種菌株用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 分離到的細(xì)菌(a)和真菌(b)菌株的酶活

對上述4株菌株進(jìn)行菌種鑒定，認(rèn)定B2為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，與編號MG593200.1(B.licheniformis)菌株的相似度為100.00%；B4為空氣芽孢桿菌(Bacillusaerius)，與編號KF879226.1(B.aerius)菌株的相似度為99.66%；F1為疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyceslanuginosus)，與編號MT316378.1(T.lanuginosus)菌株的相似度為100.00%；F2為煙曲霉(Aspergillusfumigatus)，與編號MW335144.1(A.fumigatus)菌株的相似度為100.00%。

2.2 堆肥過程中溫度的變化

堆肥過程中微生物的新陳代謝會產(chǎn)生和消耗能量，從而影響堆肥溫度[16]。在堆肥的第2天接種嗜熱菌劑后，接種組的升溫過程明顯加快，溫度逐漸高于空白組(圖2)，并在第7天達(dá)到峰值63.8 ℃，而空白組的溫度峰值為63.3 ℃。堆肥第8天，接種組和空白組的溫度均有所下降，此時(shí)進(jìn)行第二次接種。至第9天，兩組溫度又再次升高，且接種組的溫度比空白組高出2 ℃。這可能是因?yàn)椋航臃N組在再次接種菌劑后，嗜熱微生物的活性增強(qiáng)，對有機(jī)物的降解能力提高，因而溫度升高；而在空白組中，培養(yǎng)基的加入只是為堆肥原生境中的微生物提供了額外的養(yǎng)分。在整個(gè)堆肥過程中，接種組的溫度始終高于空白組，且接種組高溫期(>50 ℃)的持續(xù)時(shí)間(14 d)比空白組(12 d)多2 d，表明接種嗜熱菌劑可延長高溫期。Yu等[17]研究發(fā)現(xiàn)，嗜熱菌劑在蛋白質(zhì)和木質(zhì)纖維素降解方面具有優(yōu)勢，可在堆肥過程中積累更多熱量，從而提高堆肥溫度并延長堆肥高溫期。隨后，當(dāng)大部分有機(jī)物被消耗后，微生物活性降低，接種組和空白組的溫度降低，最終接近環(huán)境溫度，堆肥結(jié)束。

圖2 堆肥過程中的溫度(a)和種子發(fā)芽指數(shù)(GI)(b)變化

2.3 堆肥過程中有機(jī)質(zhì)和DOC的變化

在堆肥過程中，有機(jī)質(zhì)不斷進(jìn)行礦化和腐殖化，含量不斷減少[21]。在本試驗(yàn)的堆肥過程中，各處理組的有機(jī)質(zhì)含量均呈下降趨勢(圖3)。相對于空白組，接種組的有機(jī)質(zhì)降解速率明顯更快。最終，接種組和空白組的有機(jī)質(zhì)降解率分別為15.08%和12.09%。接種組的有機(jī)質(zhì)降解率高于空白組，這可能是因?yàn)榻臃N組具有更高的堆體溫度和微生物代謝活性，說明接種嗜熱菌劑可促進(jìn)堆肥過程中有機(jī)質(zhì)的生物降解。

圖3 堆肥過程中有機(jī)質(zhì)(a)和溶解性有機(jī)碳(DOC)(b)含量的變化

DOC是為微生物代謝提供碳源和能源的重要物質(zhì)[22]。在堆肥過程中，接種組和空白組的DOC含量均持續(xù)下降，最終分別從27.22、27.71 g·kg-1下降到14.53、16.63 g·kg-1。白玲等[14]在研究不同調(diào)理劑對秸稈沼渣堆肥的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，DOC在堆肥的2～5 d快速增加，這與本文結(jié)果不同。這可能是因?yàn)?，雖然木質(zhì)纖維素等聚合物的降解集中在高溫期(可釋放更多DOC)，但是高溫期的微生物活性最強(qiáng)，可快速降解DOC，且DOC的降解速率高于有機(jī)質(zhì)的降解速率，即釋放的DOC少于降解的DOC，因而在本試驗(yàn)條件下表現(xiàn)為堆肥過程中DOC含量的持續(xù)下降。兩組相比，接種組的DOC降解率明顯更高，說明接種嗜熱菌劑可提高DOC的降解率，有助于促進(jìn)微生物的生長繁殖[23]。

2.4 堆肥過程中腐殖質(zhì)組成和含量的變化

腐殖質(zhì)是堆肥過程中有機(jī)物轉(zhuǎn)化的重要產(chǎn)物，主要由富里酸和胡敏酸組成，可影響堆肥產(chǎn)品的肥效和穩(wěn)定性[24]。由于高溫不利于腐殖質(zhì)的形成，且堆肥原有的腐殖質(zhì)和在堆肥初期形成的腐殖質(zhì)易被微生物分解利用[25]，接種組和空白組的腐殖質(zhì)含量在前10 d均維持在較低水平(圖4)。第10天后，腐殖質(zhì)含量迅速升高。至堆肥結(jié)束時(shí)，接種組的腐殖質(zhì)含量(117.40 g·kg-1)高于空白組(107.95 g·kg-1)。這是因?yàn)?，腐殖質(zhì)形成的前體物質(zhì)是酚類化合物，而木質(zhì)素降解可提供酚類化合物[26]。嗜熱菌劑具有較強(qiáng)的木質(zhì)素降解能力，因而能為腐殖質(zhì)形成提供更多的前體物質(zhì)。在接種組和空白組中，隨著堆肥的進(jìn)行，富里酸含量均不斷減少，至堆肥結(jié)束時(shí)，分別降至29.27、29.43 g·kg-1。據(jù)Zhou等[27]報(bào)道，富里酸可通過縮合和聚合轉(zhuǎn)化為分子量更大、結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定的胡敏酸；因此，堆肥過程中胡敏酸含量持續(xù)上升。最終，接種組和對照組的胡敏酸含量分別達(dá)到88.14、78.52 g·kg-1。顯然，接種嗜熱菌劑提高了堆肥產(chǎn)品的胡敏酸含量，形成了更為穩(wěn)定的腐殖質(zhì)。胡富比(HA/FA)可反映堆肥的腐熟程度[28]。隨著堆肥進(jìn)行，接種組和空白組的胡富比均逐漸升高，說明有機(jī)物在向著腐殖質(zhì)轉(zhuǎn)化，腐殖化程度逐漸增加。最終，接種組和空白組的胡富比分別為3.01和2.67，說明接種嗜熱菌劑可強(qiáng)化堆肥的腐殖化程度。

圖4 堆肥過程中腐殖質(zhì)(a)、富里酸(b)、胡敏酸(c)含量和胡富比(d)的變化

2.5 堆肥過程中的三維熒光光譜變化

三維熒光光譜可用于評估和監(jiān)測堆肥的成熟度和穩(wěn)定性[29]。據(jù)Chen等[30]報(bào)道，不同類型的有機(jī)物具有不同的熒光特性，通?？梢苑譃?個(gè)區(qū)域：區(qū)域A，EX/EM (260～290) nm/(300～360) nm；區(qū)域B，EX/EM (225～230)/(330～340) nm；區(qū)域C，EX/EM (220～230)/(300～310) nm；區(qū)域D，EX/EM (240～245)/(420～430) nm；區(qū)域E，EX/EM (300～350)/(400～450) nm。區(qū)域A～E分別代表類酪氨酸物質(zhì)、類色氨酸物質(zhì)、可溶性微生物副產(chǎn)物、類富里酸物質(zhì)和類胡敏酸物質(zhì)。從堆肥原料，以及空白組和接種組堆肥產(chǎn)品的三維熒光光譜(圖5)可以看出，堆肥原料中區(qū)域A、B、C的熒光強(qiáng)度較高，說明其主要由簡單的芳香蛋白和可溶性微生物副產(chǎn)物組成。在堆肥結(jié)束后，接種組和空白組區(qū)域A、B、C的熒光強(qiáng)度降低，表明類蛋白物質(zhì)在堆肥過程中被降解為非熒光物質(zhì)或轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)[31]；但區(qū)域D、E的熒光強(qiáng)度有所增加，且接種組中區(qū)域D、E的熒光強(qiáng)度高于空白組，即接種組的類富里酸物質(zhì)和類胡敏酸物質(zhì)含量要高于空白組，說明接種嗜熱菌劑可以提高堆肥的腐殖化程度。

2.6 堆肥過程中的微生物群落結(jié)構(gòu)變化

微生物群落結(jié)構(gòu)的演變，尤其是細(xì)菌群落的演變，在堆肥過程中有機(jī)物的轉(zhuǎn)化和腐殖質(zhì)的形成中發(fā)揮著重要作用[32]。在空白組和接種組第5、15、30天的堆肥樣品中，在門水平上細(xì)菌群落主要由厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)組成(圖6)。在堆肥第5天，厚壁菌門在細(xì)菌群落中的相對豐度最高，在空白組和接種組中分別占70.99%和76.84%，其次是放線菌門，分別占14.10%和18.12%，變形菌門分別占8.45%和2.90%。擬桿菌門對高溫敏感，在堆肥的高溫階段難以生存，因此在第5天的堆肥樣品中幾乎不存在。值得注意的是，接種組的厚壁菌門和放線菌門的相對豐度均高于空白組。據(jù)報(bào)道，厚壁菌門可以分泌多種胞外酶來降解蛋白質(zhì)、果膠和纖維素等大分子底物[33]。同時(shí)，大多數(shù)厚壁菌門都能產(chǎn)生孢子以適應(yīng)高溫環(huán)境。放線菌門在木質(zhì)纖維素降解方面發(fā)揮重要作用，并能通過分泌各種抗生素抑制和殺死堆肥中的病原微生物[34]。從以上結(jié)果可以看出，接種嗜熱菌劑可以促進(jìn)堆肥高溫階段碳水化合物和木質(zhì)纖維素的降解，抑制或殺死堆肥中的病原菌，最終提高堆肥的效率和質(zhì)量。在堆肥的第15天，厚壁菌門的相對豐度顯著降低，在空白組和接種組中分別占41.94%和44.25%。相應(yīng)地，變形菌門開始變得活躍，相對豐度升高，在空白組和接種組中分別占36.32%和38.59%。據(jù)Zhang等[35]報(bào)道，變形菌門具有良好的固氮特性，在堆肥中可較其他細(xì)菌固定更多的氮。在堆肥的第30天，厚壁菌門的相對豐度進(jìn)一步降低，在空白組和接種組中分別占7.22%和10.52%；而變形菌門的相對豐度維持在較高水平，在空白組和接種組中分別占39.89%和40.38%。在此階段，擬桿菌門的相對豐度升高，在空白組和接種組中分別占39.65%和34.55%。這是因?yàn)?，此時(shí)堆體溫度已趨近于室溫，適宜擬桿菌門的生長繁殖。

除細(xì)菌外，真菌群落的演變對堆肥過程中纖維素、木質(zhì)素等難降解有機(jī)物的降解亦發(fā)揮著重要作用。對比空白組和接種組第5、15、30天堆肥樣品中真菌在目水平上的相對豐度變化情況可以看到，空白組與接種組在真菌群落結(jié)構(gòu)上存在明顯差異，說明接種嗜熱菌劑深刻影響了堆肥過程中真菌群落的演變。在堆肥的第5天，空白組中酵母菌目(Saccharomycetales)占主導(dǎo)地位，相對豐度達(dá)到了59.61%，散囊菌目(Eurotiales)、肉座菌目(Hypocreales)、座囊菌目(Dothideales)、格孢腔菌目(Pleosporales)和假毛球殼目(Trichosphaeriales)的相對豐度接近，在空白組中分別占9.39%、7.52%、4.98%、5.70%和3.72%。然而，在接種組中，酵母菌目的相對豐度僅占1.70%。這意味著，接種嗜熱菌劑抑制了酵母菌目的生長。相對地，在接種組中散囊菌目、肉座菌目、座囊菌目、格孢腔菌目和假毛球殼目的相對豐度均得到提升，分別占23.71%、20.24%、15.51%、13.87%和10.74%。這表明，接種嗜熱菌劑提高了堆肥高溫期真菌群落的多樣性。在堆肥的第15天，空白組中酵母菌目的相對豐度進(jìn)一步升高，達(dá)到67.79%，接種組酵母菌目的相對豐度也得到了提升，達(dá)到51.49%。這可能是由于嗜熱菌劑主要在高溫階段活躍，當(dāng)堆肥進(jìn)入降溫腐熟階段，酵母菌目逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位。此外，糞殼菌目(Sordariales)在此階段較活躍，在空白組和接種組中分別占11.74%和15.04%。同期，散囊菌目、肉座菌目、座囊菌目、格孢腔菌目和假毛球殼目，在空白組中分別占4.73%、4.59%、2.48%、2.34%和2.19%，在接種組中分別占14.38%、3.62%、2.66%、3.55%和2.06%，整體看，上述菌目在接種組中的占比高于空白組。在堆肥的第30天，酵母菌目的相對豐度降低，在空白組和接種組中分別占6.77%和1.00%，而糞殼菌目的相對豐度升高，在空白組和接種組中分別占34.54%和74.10%。

3 結(jié)論

本研究從餐廚有機(jī)漿液厭氧沼渣和黑水虻蟲糞共堆肥高溫期篩選出2株嗜熱細(xì)菌(分屬Bacilluslicheniformis、Bacillusaerius)和2株嗜熱真菌(分屬Thermomyceslanuginosus、Aspergillusfumigatus)。接種由上述菌株制成的嗜熱菌劑可延長堆肥高溫期的持續(xù)時(shí)間，促進(jìn)有機(jī)質(zhì)和DOC降解，強(qiáng)化堆肥腐殖化進(jìn)程，提高堆肥產(chǎn)品肥效。在堆肥的高溫期，接種嗜熱菌劑可提高厚壁菌門和放線菌門的相對豐度，減少酵母菌目的相對豐度，增加真菌群落多樣性。