磷酸酶和張力蛋白同源基因誘導激酶1與糖尿病難愈創(chuàng)面修復的研究進展

楊嘉琪，張培華，黃海麗

糖尿病是一種臨床高發(fā)的慢性代謝性疾病，易伴發(fā)包括血管病變及周圍神經(jīng)病變在內(nèi)的多種并發(fā)癥［1］。慢性難愈創(chuàng)面是糖尿病常見且嚴重的并發(fā)癥之一，且缺乏有效的治療方式，是導致糖尿病患者截肢率居高不下的主要原因［1-2］。磷酸酶和張力蛋白同源基因誘導激酶1（PINK1）可能通過調(diào)控線粒體功能以及炎性反應、脂質代謝等在糖尿病創(chuàng)面修復過程中發(fā)揮重要作用。本文就創(chuàng)面修復的機制，線粒體功能，PINK1與糖尿病難愈創(chuàng)面三者的關系，PINK1在創(chuàng)面修復過程不同階段中的作用等方面進行綜述。

本文文獻檢索策略：本文以“磷酸酶和張力蛋白同源基因誘導激酶1”“糖尿病難愈創(chuàng)面”“創(chuàng)面修復”為中文關鍵詞，以“Phosphatase and tensin homologueinduced putative kinase 1”“PTEN induced putative kinase 1”“PINK1”“diabetic refractory wounds”“wound repair”為英文關鍵詞檢索PubMed、萬方數(shù)據(jù)知識服務平臺、中國知網(wǎng)等數(shù)據(jù)庫，并手工檢索納入文獻的參考文獻；檢索時限為建庫至2022年5月；閱讀摘要及全文后納入與本文主題相關的文獻，排除信息量太少而無法有效參考的文獻。

1 皮膚創(chuàng)面修復的機制

1.1 創(chuàng)面修復的過程 創(chuàng)面修復包括4個階段：止血期、炎癥期、增生期以及重塑期。止血期自創(chuàng)面產(chǎn)生開始，創(chuàng)面處血管收縮并開始凝血級聯(lián)反應，血小板在此期間釋放出各種蛋白、細胞因子、化學介質，對后續(xù)的愈合過程有重要的調(diào)節(jié)作用［3］。凝血過程中被招募至創(chuàng)面周圍的肥大細胞、中性粒細胞及巨噬細胞相互配合、分工合作，共同清除創(chuàng)面部位的細菌、失活或壞死的組織并促進炎性因子的釋放，為新生肉芽組織提供一個干凈的場地，炎癥期的進展情況直接影響創(chuàng)面愈合的發(fā)展方向［4］。糖尿病創(chuàng)面屬于慢性難愈創(chuàng)面，有研究表明這與過度的炎性反應密切相關［5］。當中性粒細胞釋放的白介素1和腫瘤壞死因子α（TNF-α）激活成纖維細胞和上皮細胞，創(chuàng)面修復進入增殖期。在增殖期，修復細胞（角質形成細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞）遷移、增殖，基質生成和降解，新生血管形成，形成新鮮的肉芽組織［6］。重塑期開始于肉芽組織的成分沉積，最終形成瘢痕，完成創(chuàng)面修復［4］。這些活動的組合決定修復的最終結果。

1.2 糖尿病難愈創(chuàng)面的成因 血糖控制不佳、晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）蓄積、炎性反應加重、氧化應激反應增加、細胞凋亡增加、微循環(huán)障礙等多種病理因素均可導致創(chuàng)面難愈，有研究表明高糖環(huán)境誘發(fā)的氧化應激可能在延遲創(chuàng)面愈合中發(fā)揮關鍵作用［7］。糖尿病患者創(chuàng)面局部持續(xù)的高糖環(huán)境經(jīng)過復雜的糖基化過程產(chǎn)生AGEs，蓄積的AGEs與其主要細胞表面受體——晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）結合引發(fā)氧化應激，加重炎癥，影響細胞功能和代謝［8］。創(chuàng)面修復過程中，中性粒細胞在炎癥早期釋放適量氧自由基（ROS）清除細菌及異物［9］，吞噬細胞碎片后迅速凋亡并釋放基質金屬蛋白酶（MMP）和彈性蛋白酶等酶，進一步消化周圍的受損細胞［10］。為防止過度損傷，巨噬細胞會及時清除凋亡中的中性粒細胞并由促炎表型M1型向促愈合表型M2型極化，抑制炎癥發(fā)展，促進組織再生［11］，巨噬細胞表型轉化是促進創(chuàng)面修復進展的重要因素［12］。研究證實，AGEs蓄積會抑制中性粒細胞的遷移并促進其凋亡，無法及時到達創(chuàng)面基部的中性粒細胞在創(chuàng)面周圍聚集。在AGEs的作用下各種炎性因子的表達上調(diào)，ROS、MMP、彈性蛋白酶增加，同時內(nèi)源性抗氧化酶的表達被抑制，導致氧化應激反應增強［8］，細胞外基質（ECM）嚴重受損［13］，促進愈合的生長因子如血小板衍生生長因子和腫瘤壞死因子-β（TNF-β）減少［14］，研究證實ECM降解平衡異常是創(chuàng)面在炎癥期停滯的主要因素之一［10］。其次，KHANNA等［15］發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠創(chuàng)面處巨噬細胞清除功能下降，炎癥消除受阻。有研究證實AGE-RAGE通路阻礙巨噬細胞表型轉換［16］，主要分泌促炎因子的M1型巨噬細胞增多，分泌抗炎因子和促修復細胞因子的M2型巨噬細胞減少，導致修復細胞增殖和遷移減少，創(chuàng)面愈合受阻［17］。此外，研究證實AGEs可能會惡化糖尿病患者的血糖情況，導致炎性反應以及氧化損傷進行性加重［18］，最終形成糖尿病慢性難愈創(chuàng)面。

2 線粒體功能與糖尿病難愈創(chuàng)面的關系

2.1 2型糖尿病導致脂肪組織線粒體異常 線粒體在細胞穩(wěn)態(tài)、細胞凋亡、ROS生成、能量底物代謝中起重要作用［19-20］。線粒體除了作為能量供應細胞器，還可作為能量傳感器。線粒體的穩(wěn)態(tài)常與代謝相關的疾病密不可分［21］。線粒體可能在難愈創(chuàng)面的形成過程中發(fā)揮關鍵作用。有研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者或db/db小鼠（2型糖尿病動物模型）脂肪組織中線粒體表現(xiàn)出功能障礙或減少現(xiàn)象［22-23］。另有研究顯示，與非糖尿病正常體質量對照組相比，肥胖的2型糖尿病患者則會顯示出異位脂質的累積［24］，線粒體來源ROS增加，抗氧化酶下降［25］，其中抗氧化酶的減少被證實會降低胰島素敏感性［26］，加重高血糖狀態(tài)，形成惡性循環(huán)，加速疾病進展。

2.2 氧化應激損害細胞功能 線粒體是胞內(nèi)ROS的主要來源，卻也易受ROS引起的氧化損傷影響［27-28］，適量的ROS對于維持細胞功能是必要的，包括基因表達、分子信號傳達、蛋白質翻譯后修飾、控制細胞的增殖分化，維持細胞衰老等［29］。過量的ROS會導致氧化應激損害細胞生理功能［30］。通常，線粒體具有自限性反饋機制來減弱線粒體ROS的產(chǎn)生［31］，但AGEs蓄積會降低內(nèi)源性抗氧化酶的生成，破壞體內(nèi)氧化還原平衡；其次，過量的ROS會促進線粒體分泌細胞死亡相關分子（DAMPs）激發(fā)炎性反應［32］，線粒體分泌的多種DAMPs導致促炎細胞因子分泌增加、細胞代謝改變和炎癥誘導。

為保證線粒體的健康和穩(wěn)態(tài)、避免細胞凋亡，線粒體通過裂變/融合平衡進行質量控制。多數(shù)損傷線粒體通過裂變激活自噬進行降解，另一部分損傷程度輕的線粒體被選擇性融合進健康的線粒體網(wǎng)絡進行成分再分配，挽救線粒體功能，防止過度碎片化［33-34］。自噬是一種細胞自衛(wèi)機制，分為非選擇性和選擇性，在正常的生理件下，適度的自噬水平有利于維持穩(wěn)定的細胞內(nèi)環(huán)境和應對不利環(huán)境［35］。因此，在創(chuàng)面修復過程中線粒體調(diào)控細胞凋亡的這一功能較其他功能具有更重要的意義。

3 PINK1功能

3.1 PINK1介導線粒體自噬 PINK1是絲氨酸/蘇氨酸激酶家族中的一員。作為線粒體功能障礙的監(jiān)測器，PINK1能持續(xù)監(jiān)控線粒體狀態(tài)，識別受損線粒體，并啟動選擇性自噬程序清除受損線粒體，維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。PINK1主要分布于線粒體外膜，屬于線粒體自噬信號級聯(lián)反應中的上游因子，與其下游因子E3-泛素連接酶Parkin蛋白一起介導線粒體自噬。首先，PINK1在受損線粒體外膜上活化并蓄積［36］，通過磷酸化附著在線粒體外膜蛋白上的泛素絲氨酸（Ser）65觸發(fā)起始信號向細胞傳遞損傷信息［37］。近期研究發(fā)現(xiàn)，在PINK1中，Ser228磷酸化是將PINK1轉化為泛素激酶的先決條件［38］。隨后Parkin蛋白被選擇性地招募至受損線粒體外膜并被活化以促進線粒體自噬［39］，并泛素化線粒體外膜上相關蛋白，活化的Parkin蛋白通過延長泛素鏈形成泛素基團，泛素基團結合自噬受體蛋白，最后通過自噬適配器形成自噬小體，完成線粒體自噬［40］。在此過程中，完全活化的Parkin蛋白可以為PINK1提供更多磷酸化底物，又反過來募集和活化更多Parkin蛋白，形成正反饋環(huán)，從而擴大線粒體自噬信號［41］。此外，研究提出PINK1可以不通過Parkin蛋白通路直接激活線粒體自噬［41］，這表明PINK1可以通過不同途徑調(diào)控自噬。

3.2 PINK1其他功能 越來越多的證據(jù)表明，PINK1通過除自噬外的其他途徑參與調(diào)控細胞代謝和活性。ARENA等［42］發(fā)現(xiàn)PINK1能通過磷酸化Bcl-xL（一種抗凋亡蛋白）的Ser62對抗氧化損傷引起的細胞凋亡，其次，該作者在另一篇研究中提出PINK1也可能通過調(diào)節(jié)Ca2+穩(wěn)態(tài)以增強呼吸鏈功能維持線粒體功能［43］；PINK1的下調(diào)導致糖尿病患者體內(nèi)脂滴聚集和線粒體脂肪酸氧化證實了PINK1能夠影響脂質代謝［44］；PINK1對神經(jīng)元有保護作用，MARTELLA等［45］發(fā)現(xiàn)PINK1能夠提高線粒體對魚藤酮等線粒體毒性物質的拮抗能力；AKUNDI等［46］發(fā)現(xiàn)PINK1基因敲除的哺乳動物細胞內(nèi)出現(xiàn)線粒體碎片化、擴大及腫脹等異常形態(tài)，部分線粒體伴隨Parkin蛋白募集或去極化，證實PINK1能夠影響線粒體形態(tài)［47］。

4 PINK1與2型糖尿病及其難愈創(chuàng)面的關系

PINK1突變是帕金森綜合征的主要原因之一［48］，但PINK1除神經(jīng)保護作用外的其他功能正在被逐步挖掘［43］。實驗證實，PINK1介導的線粒體自噬可以通過影響胰島β細胞的Ca2+穩(wěn)態(tài)、葡萄糖感知及攝取能力和胰島素抵抗參與糖代謝過程調(diào)控2型糖尿病［49］。有研究表明，PINK1缺乏是2型糖尿病的潛在發(fā)病因素［50］。BHANSALI等［51］發(fā)現(xiàn)，輕度高血糖能上調(diào)線粒體自噬以保證β細胞功能，中度或高度高血糖會導致PINK1/Parkin表達下調(diào)損害線粒體自噬，高血糖誘導的氧化應激造成線粒體功能紊亂及ROS清除功能下降，進而導致過度的炎性反應和細胞修復能力下降。此外，線粒體自噬的下調(diào)會促進巨噬細胞向M1型極化［52］，進一步促進炎性反應。這些因素與前文所提到的難愈創(chuàng)面的成因高度契合，這證實PINK1對糖尿病及其難愈創(chuàng)面存在重要影響作用。

5 PINK1在創(chuàng)面修復中的作用

5.1 PINK1在創(chuàng)面修復炎性反應階段的作用

5.1.1 PINK1對抗內(nèi)外界氧化脅迫 2型糖尿病患者的創(chuàng)面在持續(xù)的高糖微環(huán)境下會產(chǎn)生大量AGEs、TNF-α、脂多糖等因子，增強氧化應激反應及加重炎性反應，而這是阻礙愈合的關鍵原因。過量的ROS會破壞抗氧化防御系統(tǒng)，引發(fā)氧化應激損傷細胞。研究表明，PINK1可以通過不同途徑參與對抗氧化應激。第一，為避免過度的細胞損傷，PINK1通過介導選擇性自噬不斷清除產(chǎn)生過量ROS的異常線粒體。在人腎皮質近曲小管上皮細胞（HK-2）中，當PINK1介導的線粒體選擇性自噬減少時，會導致線粒體ROS（mtROS）產(chǎn)生增多以及DNA氧化損傷，加重造影劑誘發(fā)的急性腎損傷［53］。同樣，在外界高氧誘導下，PINK1的缺乏會增加肺內(nèi)皮細胞中線粒體氧化劑和mtROS的產(chǎn)生，加重肺部損傷［54］。以上研究表明PINK1介導自噬能有效對抗內(nèi)外界氧化損傷。第二，PINK1通過自噬以外的途徑對抗氧化應激。QASIM等［55］報道了PINK1可以通過磷酸化Ser637位點的激肽相關蛋白1（DRP1）抑制細胞凋亡，減少在腸缺血再灌注時期過量的ROS釋放導致的細胞損傷。ARENA等［42］發(fā)現(xiàn)PINK1能通過磷酸化Ser62位點的Bcl-xL對抗細胞凋亡。此外，研究發(fā)現(xiàn)的調(diào)控PINK1表達的上游因子正在逐漸增多，MURATA等［56］對PINK1 mRNA在脅迫條件下的轉錄調(diào)控進行研究后提出，Nrf2（一種抗氧化劑轉錄因子）能夠上調(diào)人神經(jīng)母細胞瘤細胞（SH-SY5Y）中PINK1的轉錄表達，增強其線粒體保護作用，提高細胞存活率。值得注意的是，在不同細胞譜系中，Nrf2對PINK1的轉錄調(diào)節(jié)具有差異性。MEI等［57］發(fā)現(xiàn)FOXO3a在生長因子/血清減少時調(diào)節(jié)T淋巴細胞中PINK1的表達。但在SH-SY5Y細胞中，Nrf2誘導的PINK1表達水平遠高于FOXO3a。

5.1.2 PINK1介導線粒體自噬抑制NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）的激活 研究顯示，過量的mtROS［58］和氧化線粒體DNA（mtDNA）在中性粒細胞凋亡期間能夠激活NLRP3炎癥小體［59-60］。NLRP3炎癥小體是炎癥體中被研究的最廣泛的一種炎癥復合體，是激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase-1，細胞凋亡的主要介質之一）的多蛋白復合物，可誘導促炎細胞因子白介素1β和白介素18的成熟，也可被多種刺激物激活，并刺激自身免疫的加強，強化炎性反應［61］。從該角度出發(fā)，尋找調(diào)節(jié)NLRP3激活的相關機制或能成為防止過度炎性反應的重要突破口。研究顯示，線粒體自噬級聯(lián)反應能夠將功能異常的線粒體清除并降低 mtROS［62］；ZHOU 等［63］證實了 NLRP3 受到自噬的負性調(diào)節(jié)，且PINK1是介導自噬的主要上游因子之一。關于PINK1調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體激活具體機制的研究較少，現(xiàn)有的研究以PINK1調(diào)控自噬清除受損線粒體為主要機制多關注上游調(diào)節(jié)因素及其相關疾病。MOUTON-LIGER等［64］將PINK1與免疫細胞核因子κB（NF-κB）途徑的負調(diào)節(jié)因子的抗凋亡信號蛋白20AD（A20）聯(lián)系起來，提出PINK1介導的自噬導致A20的缺失會誘發(fā)NLRP3炎癥小體在體內(nèi)和體外過度激活，但這是在神經(jīng)細胞及骨髓來源的巨噬細胞中研究發(fā)現(xiàn)的結果，難愈創(chuàng)面相關細胞的情況是否相同還有待進一步研究。PINK1-NLRP3通路與各類疾病相關聯(lián)的證據(jù)近些年正逐步積累：PINK1介導的自噬通路能夠有效降低mtROS及NLRP3炎癥小體活化，以緩解或防治肝缺血-再灌注損傷［65］、致命的多微生物敗血癥［66］、急性胰腺炎［67］、神經(jīng)炎癥［64］、造影劑誘導的急性腎損傷［53］等涉及身體各個系統(tǒng)的損傷。以上說明PINK1介導的自噬對NLRP3炎癥小體的抑制對人體炎癥相關疾病存在重要且廣泛的保護作用，但其與糖尿病難愈創(chuàng)面關系的相關研究尚且較少。

5.2 PINK1在創(chuàng)面修復增生期的作用 創(chuàng)面修復時，糖尿病患者體內(nèi)的代謝應激狀態(tài)會引發(fā)細胞線粒體功能異常［68］。研究顯示，高糖微環(huán)境中的AGEs對人主動脈內(nèi)皮細胞中的線粒體動力學有顯著影響，通過促進融合和裂變動態(tài)平衡向裂變轉化，顯著增加線粒體裂變和細胞凋亡［69］。內(nèi)皮細胞狀態(tài)異常導致的血管增生障礙是創(chuàng)面修復增生過程受阻的重要原因。研究發(fā)現(xiàn)，PINK1在肥胖及糖尿病小鼠中表達上調(diào)，并對保護內(nèi)皮細胞免受損傷有重要作用［70］，這也許是PINK1促進難愈創(chuàng)面肉芽組織增生的作用機制之一，在糖尿病心血管疾病的研究中常有涉及。YANG等［71］發(fā)現(xiàn)匹伐他汀可以通過激活PINK1途徑保護內(nèi)皮祖細胞增殖。XI等［72］提出黃芩素可以通過上調(diào)PINK1介導的線粒體自噬，保護人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）免受氧化損傷。另一方面，ZHANG等［73］則認為利拉魯肽（一種胰高血糖素樣肽-1受體激動劑）是通過抑制PINK1介導的線粒體自噬來防止高糖誘導的HUVECs功能障礙。XIANG等［74］也提出沙爾維諾酸B通過下調(diào)內(nèi)皮細胞的凋亡和線粒體自噬來緩解糖尿病內(nèi)皮和線粒體功能障礙。為何通過上調(diào)或抑制自噬都能夠提高內(nèi)皮細胞的存活率？通過對比得出，損傷來源于高血糖導致的氧化損傷，PINK1介導線粒體自噬清除過量的mtROS是為了減少細胞凋亡，但當ROS過多，自噬功能失調(diào)，細胞的凋亡率提高。而當調(diào)節(jié)因子可直接降低ROS含量，PINK1的表達就會隨之降低。即自噬下調(diào)的前提是ROS的降低，自噬行為的減少為跟隨效應。因此這些研究的觀點并非相悖，相反其均肯定了PINK1介導的自噬對于維持線粒體穩(wěn)態(tài)、避免內(nèi)皮細胞凋亡的保護作用。對此，F(xiàn)AN等［75］提出PINK1途徑可能是氧化銅納米顆粒誘發(fā)的病理性血管內(nèi)皮損傷的治療策略。

5.3 PINK1在創(chuàng)面修復重塑期的作用 在創(chuàng)面修復的最后階段，成纖維細胞和角質形成細胞發(fā)揮主要作用，二者之間的相互影響在愈合過程中起重要作用。研究顯示，PINK1表達缺失的患者皮膚中的成纖維細胞更容易發(fā)生由應激引發(fā)的細胞凋亡，并且過表達組細胞中線粒體上的PINK1在應激條件下會被重新分配到細胞質，證實了PINK1發(fā)揮的細胞保護作用［76］。角質形成細胞中的自噬可通過調(diào)節(jié)CCL2表達激活成纖維細胞和角質形成細胞，促進創(chuàng)面再上皮化并促進創(chuàng)面愈合的進展［77］。自噬影響肌成纖維細胞分化并調(diào)節(jié)ECM降解，在調(diào)節(jié)組織重塑中起重要作用［78］。因此，PINK1可能通過調(diào)控線粒體自噬發(fā)揮重要作用。

6 間充質干細胞（MSCs）在創(chuàng)面修復中的應用

糖尿病難愈創(chuàng)面的治療方式一直在不斷進步和發(fā)展，近年來，MSCs治療逐漸步入人們的視野。作為一種重要的多功能自我更新細胞，MSCs分泌細胞因子、免疫調(diào)節(jié)、分化等能力使其在治療糖尿病難愈創(chuàng)面有著巨大的潛力。MSCs對糖尿病血管疾病的治療與PINK1介導的自噬密切相關。ZHU等［79］發(fā)現(xiàn)隨高糖處理的劑量升高和作用時間延長，PINK1和Parkin蛋白、自噬標志物LC3-Ⅱ蛋白表達量降低，促凋亡因子Bax和裂解的Caspase-3蛋白表達量升高，隨后mtROS的產(chǎn)生增加，說明高糖刺激會導致線粒體功能障礙，減少線粒體自噬，促進細胞凋亡。MSCs治療逆轉了這些改變，并且PINK1的上調(diào)抑制了Drp1的表達，減少線粒體裂變誘導的碎片化，這可能是降低mtROS的重要途徑。

7 小結與展望

PINK1介導的線粒體自噬在糖尿病難愈創(chuàng)面修復過程中發(fā)揮重要作用。PINK1通過調(diào)節(jié)自噬修復AGEs誘發(fā)的線粒體功能障礙，去除產(chǎn)生的過量的ROS以及損傷的DNA，對抗氧化應激，維持細胞的正常功能保護參與創(chuàng)面修復的細胞免受氧化應激損傷。PINK1參與調(diào)節(jié)炎性因子激活和炎癥信號傳導，抑制炎性反應的持續(xù)激活，其還能保護血管內(nèi)皮細胞免受高糖微環(huán)境引起的氧化損傷，促進新生血管的生成、健康肉芽組織的形成。在創(chuàng)面修復的重塑期，PINK1參與調(diào)節(jié)膠原生成，維持細胞間的信號傳導，促進成纖維細胞和角質形成細胞的增殖和遷移，加速創(chuàng)面修復。遺憾的是，本文總結的關于PINK1調(diào)控創(chuàng)面修復的機制均來源于體外實驗。目前仍缺乏PINK1調(diào)控糖尿病難愈創(chuàng)面修復的體內(nèi)研究；并且現(xiàn)有研究未能揭示創(chuàng)面修復的不同階段PINK1參與的分子機制與信號轉導過程的時序性和交互作用。因此，通過體內(nèi)研究進一步揭示PINK1在創(chuàng)面修復的具體作用機制，對研發(fā)治療糖尿病創(chuàng)面的有效措施具有重要意義。

作者貢獻：楊嘉琪進行文章的構思與設計、文獻 /資料收集及整理、論文撰寫及修訂；張培華負責文章的質量控制及審校，對文章監(jiān)督管理；黃海麗負責論文最終版的修訂，對論文負責。所有作者確認了論文終稿。

本文無利益沖突。