免疫評分系統(tǒng)在結(jié)直腸癌中應(yīng)用的研究進(jìn)展

沈璞，韓振國，張玉龍，霍宇琪

(山西醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院·山西白求恩醫(yī)院·山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院·同濟(jì)山西醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科，太原 030032)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，根據(jù)全球腫瘤流行病統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2020年全球CRC新發(fā)病例占全部癌癥新發(fā)病例的10.0%，死亡病例占9.4%，分別位于所有惡性腫瘤的第三位和第二位[1]。目前，臨床對CRC的預(yù)后及相關(guān)治療策略主要依據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會和國際抗癌聯(lián)盟發(fā)布的TNM分期系統(tǒng)，然而長期臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，盡管處于相同的腫瘤組織學(xué)分期，患者的臨床結(jié)果仍可能出現(xiàn)顯著差異[2]。一些晚期癌癥患者可以保持病情穩(wěn)定多年，而大約25%的TNM Ⅰ～Ⅱ期CRC患者盡管進(jìn)行根治性手術(shù)切除且無殘留腫瘤負(fù)荷或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,仍會出現(xiàn)快速的腫瘤進(jìn)展及死亡。這是由于傳統(tǒng)分期系統(tǒng)主要通過腫瘤細(xì)胞本身預(yù)測疾病進(jìn)展，忽略了宿主整體的免疫狀況及腫瘤組織微環(huán)境特征的影響[3]。研究證實(shí)，腫瘤的免疫環(huán)境(即免疫細(xì)胞的類型、功能定位、密度和位置)可能是臨床結(jié)果的決定性因素[4]。基于此，有學(xué)者提出了免疫評分(immunoscore，IS)系統(tǒng)，即通過免疫組化技術(shù)對腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞進(jìn)行量化分析，從而預(yù)測患者的生存周期[5]。目前，國內(nèi)外多項(xiàng)研究證實(shí)，IS系統(tǒng)對CRC患者預(yù)后的預(yù)測及療效評估有重要作用。本文將重點(diǎn)闡述IS系統(tǒng)在CRC中的研究進(jìn)展。

1 IS系統(tǒng)

目前認(rèn)為，腫瘤的進(jìn)展是侵襲性過程和宿主防御系統(tǒng)之間動(dòng)態(tài)作用的結(jié)果，臨床上所表現(xiàn)出的癌癥均提示免疫系統(tǒng)無法單獨(dú)消除或控制腫瘤細(xì)胞，并進(jìn)入到“免疫逃逸”階段。因此，為了控制腫瘤的繼續(xù)進(jìn)展和擴(kuò)散，免疫細(xì)胞在腫瘤腺體、周圍基質(zhì)、腫瘤浸潤邊緣和腫瘤附近形成的第三級淋巴結(jié)構(gòu)進(jìn)行免疫過濾[3]。早在1986年Jass[6]便首次提出，直腸腫瘤高淋巴細(xì)胞浸潤是獨(dú)立于TNM分期的良好預(yù)后因素。隨后這一結(jié)果在更多的實(shí)體瘤中得到證實(shí)，且隨著簇分化抗原識別技術(shù)的發(fā)展與革新，進(jìn)一步被用于鑒別和計(jì)數(shù)腫瘤部位的淋巴細(xì)胞亞群[7]。研究發(fā)現(xiàn)，由于腫瘤內(nèi)免疫浸潤的異質(zhì)性，CRC中腫瘤中心(tumor center, CT)和腫瘤浸潤邊緣(invasive margin, IM)區(qū)域的免疫細(xì)胞群密度與患者的無病生存率(disease-free survival，DFS)和總生存率(overall survival，OS)呈顯著相關(guān)性，且將這兩個(gè)腫瘤區(qū)域免疫細(xì)胞密度相結(jié)合，可進(jìn)一步提高預(yù)后準(zhǔn)確性[8]。因此，有學(xué)者將與腫瘤患者DFS和OS相關(guān)的各種獲得性免疫因素統(tǒng)稱為“免疫結(jié)構(gòu)”，即獲得性免疫細(xì)胞在不同腫瘤區(qū)域的類型、功能定位、密度和位置[4]。免疫結(jié)構(gòu)主要由CT及IM中的CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和記憶T細(xì)胞、第三級淋巴結(jié)構(gòu)、輔助T細(xì)胞相關(guān)因子(干擾素γ重組蛋白、T盒轉(zhuǎn)錄因子、干擾素調(diào)節(jié)因子1、白細(xì)胞介素12)以及趨化因子等構(gòu)成[5]。在此基礎(chǔ)上，Mlecnik等[9]提出了IS這一概念,即通過量化腫瘤免疫結(jié)構(gòu)中的T細(xì)胞和細(xì)胞毒T細(xì)胞密度來預(yù)測患者預(yù)后情況。

一項(xiàng)納入602例CRC患者的大型回顧性隊(duì)列研究對腫瘤區(qū)域(CT和IM)中CD8+、CD3+和CD45RO+進(jìn)行染色分析后發(fā)現(xiàn)，高免疫浸潤及低免疫浸潤患者5年復(fù)發(fā)率(4.8%和75%，P<0.000 1)及死亡率(13.8%和72.5%,P<0.000 1)有顯著差異[10]。其中，CD45RO+記憶T細(xì)胞密度與CD3+T細(xì)胞密度高度重疊，但由于CD45RO+腫瘤切片背景染色和抗原性極易丟失，其被排除在分析之外。最終，IS系統(tǒng)主要通過CT和IM區(qū)域中CD3+和CD8+淋巴細(xì)胞群體的計(jì)數(shù)進(jìn)行評分。隨后，為促進(jìn)IS系統(tǒng)應(yīng)用于臨床，Pagès等[11]建立了標(biāo)準(zhǔn)化的檢驗(yàn)方法：將相關(guān)CRC組織制作成石蠟組織切片，用免疫組織化學(xué)法對CD3+及CD8+進(jìn)行染色，并使用專用圖像分析軟件(Immunoscore?Analyzer)對CT和IM中的CD3+和CD8+細(xì)胞密度進(jìn)行檢測和量化，根據(jù)平均密度百分位數(shù)對IS進(jìn)行分類，IS=0～1分為低CD3+和CD8+淋巴細(xì)胞浸潤(0～25%)；IS=2分為中度CD3+和CD8+淋巴細(xì)胞浸潤(25%～75%)；IS=3～4分為高度CD3+和CD8+淋巴細(xì)胞浸潤(75%～100%)。

2 IS系統(tǒng)在CRC中應(yīng)用的研究進(jìn)展

2.1 對不同分期CRC預(yù)后的指導(dǎo)作用

2.1.1 局限性CRC 為進(jìn)一步驗(yàn)證IS系統(tǒng)在臨床中的可行性及其評估預(yù)后的具體效能，由美國癌癥免疫治療學(xué)會(society for immunotherapy of cancer，SITC)牽頭組成的國際聯(lián)盟對TNM Ⅰ～Ⅲ期(即未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移)的局限性結(jié)腸癌患者的IS進(jìn)行的回顧性研究發(fā)現(xiàn)：(1)IS對患者DFS和OS的預(yù)測價(jià)值明顯優(yōu)于現(xiàn)有的腫瘤預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)參數(shù)，如TNM分期、微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability，MSI)狀態(tài)、血管淋巴神經(jīng)侵犯及腫瘤分化程度等；(2)IS可作為預(yù)測局限性結(jié)腸癌復(fù)發(fā)時(shí)間的獨(dú)立預(yù)測因子，高IS的患者5年復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)最低(高、中和低IS組患者的5年復(fù)發(fā)率分別為8%、19%和32%，P<0.000 1)；(3)IS能有效預(yù)測II期局限性結(jié)腸癌高危及低?；颊撸M(jìn)一步證實(shí)了將免疫參數(shù)納入當(dāng)前TNM分期的可能性，可作為后續(xù)結(jié)腸癌患者預(yù)后的一個(gè)強(qiáng)有力的分層工具[11。隨后，多項(xiàng)多中心國際研究均證實(shí)了IS系統(tǒng)在預(yù)測局限性結(jié)腸癌患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)、DFS和OS等方面的可行性、可重復(fù)性、有效性和穩(wěn)定性[12-14]。Zeitoun等[15]及Anitei等[16]對局限性直腸癌患者預(yù)后的研究表明，IS與DFS和OS顯著相關(guān)(均P<0.005)，且在預(yù)測復(fù)發(fā)率及生存率方面明顯優(yōu)于TNM分期。2019年突尼斯醫(yī)院對106例局限性CRC患者預(yù)后標(biāo)志物的研究表明，IS同樣適用于非洲及阿拉伯CRC人群[17]。

2.1.2 轉(zhuǎn)移性CRC CRC肝轉(zhuǎn)移瘤的切除會顯著提高患者長期存活率，并提供了治愈的可能性。然而，經(jīng)切除轉(zhuǎn)移治療的患者腫瘤復(fù)發(fā)率為70%，其中一半復(fù)發(fā)將是致命的[18]。對轉(zhuǎn)移瘤標(biāo)本的分子病理表現(xiàn)和免疫參數(shù)的分析或可為腫瘤的侵襲性及治療效果評估提供重要信息。一項(xiàng)針對105例接受完全根治性轉(zhuǎn)移切除的IV期CRC患者所有轉(zhuǎn)移瘤的研究發(fā)現(xiàn)，同一患者的轉(zhuǎn)移瘤均為異質(zhì)性浸潤，且對治療的反應(yīng)各不相同，其中獲得病理和放射學(xué)應(yīng)答的轉(zhuǎn)移灶發(fā)生免疫高浸潤頻率明顯更高。浸潤最少的轉(zhuǎn)移瘤的IS與患者預(yù)后的相關(guān)性最強(qiáng)，且IS具有高特異性，能正確識別≥90%低免疫浸潤患者[19]。盡管如此，由于腫瘤的高轉(zhuǎn)移異質(zhì)性，要準(zhǔn)確識別高度浸潤的患者仍需要評估多個(gè)活檢[20]。在涉及轉(zhuǎn)移性切除術(shù)后相關(guān)臨床病理因素的多變量分析中，IS仍是影響DFS和OS的唯一有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的參數(shù)(P<0.001)，且效果優(yōu)于當(dāng)前腫瘤回歸分級等臨床病理因素。最新一項(xiàng)針對CRC肝轉(zhuǎn)移瘤的研究表明，IS是影響復(fù)發(fā)時(shí)間和OS的主要預(yù)后因素，同時(shí)證實(shí)了適應(yīng)性免疫反應(yīng)在預(yù)防轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌(metastatic colorectal cancer, mCRC)腫瘤復(fù)發(fā)中的重要作用[21]。自然免疫和記憶T細(xì)胞的持久能力以及免疫編輯的作用可能對患者的生存起著核心作用，這也為后續(xù)免疫治療提供進(jìn)一步支持，即把調(diào)節(jié)原有的免疫狀況作為癌癥治療的基礎(chǔ)。

總之，無論是在局限性或轉(zhuǎn)移性腫瘤中，還是在完全切除的腫瘤標(biāo)本或腫瘤活檢中，對免疫浸潤的評估都提供了大量的預(yù)后信息。臨床可通過IS預(yù)測CRC患者的預(yù)后，對患者進(jìn)行個(gè)性化管理。為了將IS的應(yīng)用擴(kuò)展到其他實(shí)體腫瘤中，目前正在進(jìn)行一些泛癌癥研究(臨床試驗(yàn)NCT01688232和NCT02274753)，以評估IS在多種實(shí)體惡性腫瘤中的預(yù)后價(jià)值。

2.2 IS系統(tǒng)對免疫治療的指導(dǎo)作用

IS不僅能有效指導(dǎo)CRC患者預(yù)后，還可識別從免疫檢查點(diǎn)抑制劑(immune checkpoint inhibitor, ICI)治療中獲益的患者。在對接受奧沙利鉑、氟尿嘧啶加貝伐珠單抗和不加貝伐珠單抗治療的mCRC患者的兩項(xiàng)隨機(jī)Ⅲ期試驗(yàn)的回顧性分析中發(fā)現(xiàn)，微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定(microsatellite instability-high, MSI-H)腫瘤患者的IS顯著高于其他人群(P≤0.000 1)，IS可作為錯(cuò)配修復(fù)功能缺陷(deficient mismatch repair, dMMR)mCRC的生物標(biāo)志物[22]。然而只有5%的mCRC患者是dMMR/MSI-H，由于缺乏足夠的臨床益處，目前暫無免疫療法被批準(zhǔn)用于錯(cuò)配修復(fù)功能完整(proficient mismatch repair, pMMR)或微衛(wèi)星穩(wěn)定性(microsatellite stable, MSS)的腫瘤。單一ICI對pMMR mCRC尚未顯示出臨床獲益，然而目前多項(xiàng)臨床試驗(yàn)均證明通過使用不同類型免疫療法進(jìn)行組合(癌癥疫苗、雙特異性抗體、抗淋巴細(xì)胞活化基因-3單抗、抗轉(zhuǎn)化生長因子β等)可打破腫瘤耐藥性[22]，因此迫切需要一個(gè)精確可靠的生物標(biāo)志物來預(yù)測患者對這些特定治療的反應(yīng)。Mlecnik等[23]研究發(fā)現(xiàn)，MSI早期腫瘤患者可從T細(xì)胞免疫激活療法中獲益最多，并且更頻繁地出現(xiàn)與程序性死亡受體1表達(dá)增強(qiáng)相關(guān)的高IS，且高IS的MSI及MSS患者可從T細(xì)胞療法中受益。隨后，一項(xiàng)對40例dMMR CRC和pMMR CRC患者(Ⅰ～Ⅲ期)療效評價(jià)的研究表明，治療后dMMR腫瘤均出現(xiàn)顯著腫瘤退縮，而只有少數(shù)PMMR腫瘤出現(xiàn)腫瘤退縮，且無病理反應(yīng)患者的IS明顯較低[24]。IS可對免疫療法獲益患者進(jìn)行預(yù)測和分層，并通過指導(dǎo)新輔助免疫治療進(jìn)一步改善早期CRC患者預(yù)后。

2.3 IS系統(tǒng)對輔助放化療的指導(dǎo)作用

SITC一項(xiàng)針對763例Ⅲ期結(jié)腸癌患者IS的研究表明，只有中或高IS的患者對化療有反應(yīng)，且相較于未接受化療的患者擁有更長的生存期(P=0.001)。相反，低IS的患者無論處于低危組(T1-3和/或N1)還是高危組(T4和/或N2)，均未從化療中明顯受益[15]。隨后一項(xiàng)3期臨床試驗(yàn)評估了接受FOLFOX(氟尿嘧啶+亞葉酸鈣+奧沙利鉑)或卡培他濱+奧沙利鉑輔助治療3或6個(gè)月的Ⅲ期結(jié)腸癌患者的非劣效性[25]，發(fā)現(xiàn)無論是在低危組還是高危組，中或高IS的患者均能從6個(gè)月治療中明顯受益(HR=0.53，95%CI0.37～0.75；P=0.000 4)，而低IS的患者不但未能從FOLFOX治療中受益，且同時(shí)面臨復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增高的危險(xiǎn)。

直腸癌目前主要通過全直腸系膜切除手術(shù)及新輔助放化療(neoadjuvant chemoradiotherapy, nCRT)等聯(lián)合治療策略減少局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。大約20%的局部進(jìn)展期直腸癌(locally advanced colon cancer，LARC)患者在nCRT后獲得完全的病理反應(yīng)(即無殘留腫瘤)，這種狀態(tài)與遠(yuǎn)處和局部復(fù)發(fā)的低風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[26]。因此，Jones等[27]提出一種“觀察等待”的保守治療策略，以避免根治性手術(shù)、術(shù)后并發(fā)癥和術(shù)后短期較差的生活質(zhì)量。盡管有專家提出部分腫瘤組織或血液中的分子生物標(biāo)記物可作為nCRT療效的預(yù)測指標(biāo)，但均未進(jìn)入臨床階段[28]?？紤]到nCRT引起的結(jié)構(gòu)和組織學(xué)變化不能通過經(jīng)典IS進(jìn)行評估，有學(xué)者提出在nCRT前對組織進(jìn)行診斷性活檢免疫評分(immunoscore in initial diagnostic biopsies, ISB)，以評價(jià)初始免疫浸潤情況。一項(xiàng)納入249例接受nCRT治療后行根治性手術(shù)的LARC患者的多中心隊(duì)列研究表明，ISB水平與nCRT的組織學(xué)反應(yīng)程度相關(guān)(P<0.001),80%～90%低水平ISB患者的nCRT治療效果差。ISB結(jié)合放化療后的T分期，可提高對病理組織學(xué)良好反應(yīng)者(TNM 0-I)預(yù)測的準(zhǔn)確性。并且在nCRT后臨床完全緩解(TNM 0)的“觀察等待患者”(n=73)隊(duì)列中，證實(shí)了復(fù)合生物標(biāo)記物的臨床實(shí)用性。在隨訪期間，ISB高的患者未觀察到復(fù)發(fā)[29]。因此，ISB可能作為一種新的標(biāo)志物用于臨床篩選符合觀察和等待策略的患者。此外，ISB同樣還可用于預(yù)測LARC患者對其他治療方法的反應(yīng)，如輔助化療、完全新輔助治療或大劑量CRT[30,31]。

3 總結(jié)與展望

最新的第5版世界衛(wèi)生組織消化系統(tǒng)腫瘤分類中首次提出“免疫反應(yīng)可作為CRC基本和理想的診斷標(biāo)準(zhǔn)”，并支持將IS引入到傳統(tǒng)TNM分期，即TNM-I分期[32]，這是第一個(gè)基于患者免疫狀況的標(biāo)準(zhǔn)化癌癥分類方法。IS不但可以為CRC患者提供更準(zhǔn)確的預(yù)后信息，還可對從輔助化療中受益的患者進(jìn)行分層，在活檢的IS基礎(chǔ)上識別可能對新輔助治療有反應(yīng)并符合非侵入性治療策略的直腸癌患者。同時(shí)，IS也可以作為評估免疫療法反應(yīng)的強(qiáng)有力工具。未來，有必要在更多腫瘤中驗(yàn)證IS的預(yù)測效能，增強(qiáng)其作為生物標(biāo)志物進(jìn)入臨床的可能性。