李瑭,白瑞雯,鄒利人,閆可,申海林,齊曉光,溫景輝
(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130118;2. 吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所,吉林公主嶺 136100)
休眠是指植物體或其器官在發(fā)育的某個(gè)時(shí)期生長(zhǎng)和代謝暫時(shí)停頓的現(xiàn)象[1-3],是落葉果樹生長(zhǎng)發(fā)育中必不可少的組成部分。果樹進(jìn)入休眠后,樹體外觀停止生長(zhǎng),但內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量和酶活性仍在發(fā)生變化[4-5],這些變化在增強(qiáng)植株抗逆性的同時(shí),也為果樹下一個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段積累養(yǎng)分和能量[6]。影響休眠的因素包括樹種與品種、外界因素(光照、溫度、水分等)、內(nèi)部因素(糖、酶、激素等)、休眠相關(guān)基因(PHY、CBF、CYC、DAM、SVP等)、表觀遺傳調(diào)控機(jī)制等[7]。葡萄具有產(chǎn)量高、適應(yīng)性廣、結(jié)果年限長(zhǎng)、經(jīng)濟(jì)效益高等特點(diǎn),是助力鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略實(shí)施的重要樹種。誘導(dǎo)葡萄提前休眠,可抵御北方早期斷崖式降溫產(chǎn)生的不良影響,有助于葡萄安全越冬,在生產(chǎn)上具有重要意義。
‘著色香’葡萄為東北地區(qū)主栽品種,色澤鮮艷、穗型美觀、味甜、口感好、抗逆性強(qiáng)[8]?!?50’葡萄為歐美雜交種,二倍體,果穗中等大,果皮紫紅色、味甜、口感好、中熟、抗逆性強(qiáng)[9],為東北地區(qū)極具發(fā)展?jié)摿Φ孽r食葡萄品種。前人研究表明,果實(shí)轉(zhuǎn)色期及成熟期摘葉能提高葡萄果實(shí)成熟度及葡萄酒品質(zhì)[10];還能提高山葡萄果實(shí)中糖、單寧、花色苷和總酚含量,同時(shí)降低果實(shí)酸含量[11],而關(guān)于人工摘葉誘導(dǎo)葡萄休眠的研究報(bào)道較少。本研究通過(guò)人工摘葉誘導(dǎo)葡萄提前進(jìn)入休眠,研究不同摘葉量對(duì)樹體內(nèi)養(yǎng)分含量、抗氧化酶活性、以及對(duì)休眠相關(guān)基因表達(dá)量的影響,旨在為寒地葡萄安全越冬和優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)提供新的技術(shù)支撐。
試驗(yàn)于2020年在吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所核心技術(shù)試驗(yàn)示范園(吉林省公主嶺市)進(jìn)行,果園土質(zhì)為壤土,土層深厚。以生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)一致的露地栽培5年生‘著色香’和‘日150’為試材。株距1.0 m,行距為4.0 m,廠形架式,常規(guī)水肥管理。冬季修剪后,低溫來(lái)臨前(10月中旬)將枝蔓下架,行間適量取土覆蓋枝蔓后,再覆蓋寬1.5 m、厚20 cm的玻璃絲棉防寒被,保證植株安全越冬。
果實(shí)采收后(9月17日),從枝條基部向上分別摘去葉片總量的20%、40%、60%、80%、100%,以不摘葉為對(duì)照(CK)。每處理5株。于11月8日(處理后52 d),各處理隨機(jī)采集一年生健壯枝20條,截取枝條中段20 cm的韌皮部,液氮研磨后放入﹣80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
可溶性糖與淀粉含量使用蒽酮法測(cè)定,氨基酸含量用茚三酮溶液顯色法測(cè)定,游離脯氨酸含量用茚三酮比色法測(cè)定,可溶性蛋白含量用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定[12]。超氧化物歧化酶(SOD)活性用氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)光化還原法測(cè)定,過(guò)氧化物酶(POD)活性用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定。使用上海儀電分析儀器有限公司生產(chǎn)N2型可見分光光度計(jì)進(jìn)行比色測(cè)定。
(1)在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查找5個(gè)氮代謝關(guān)鍵酶基因VvGDH(谷氨酸脫氫酶基因,JF796045)、VvNiR(亞硝酸還原酶基因,JF796046)、VvNR(硝酸還原酶基因,JF796047)、VvGS(谷氨酰胺合成酶基因,JF796048)和VvAS(天冬酰胺合成酶基因,JF796049);兩個(gè)赤霉素合成相關(guān)基因VvKO(貝殼杉烯氧化酶基因,JQ086553)、VvGA3ox-4(GA3β-羥化酶基因,JQ086556)以及一個(gè)脫落酸合成相關(guān)基因VvNCED1(9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶基因,EF625685)的DNA序列,采用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物。
(2)采集枝條樣品,用天根多糖多酚植物RNA試劑盒(DP441)提取總RNA,并用Power ScriptⅡTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成總cDNA。以cDNA為模板,分別設(shè)計(jì)5個(gè)氮代謝關(guān)鍵酶基因、兩個(gè)GA合成基因和一個(gè)ABA合成基因引物(表1),以葡萄UBI基因?yàn)榭醇一?,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物,觀察條帶熒光亮度,比較不同處理下的基因表達(dá)量。
表1 引物序列及目的片段大小Table 1 Primer sequence and target fragment size
采用MS Office 2013 和SPSS 20.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
由表2可知,摘葉處理后枝條中可溶性糖和淀粉含量均升高。其中,摘葉40%處理下兩個(gè)品種的枝條中可溶性糖含量均顯著高于CK,‘著色香’增加23.40%,‘日150’增加20.34%。說(shuō)明摘葉處理能促進(jìn)枝條內(nèi)可溶性糖的積累,摘葉40%處理效果最為顯著?!恪~40%處理后淀粉含量增加最多,較CK增加61.30%;‘日150’摘葉20%和摘葉40%處理下淀粉含量均顯著高于CK,摘葉20%處理增加11.08 mg·g-1,摘葉40%處理增加17.17 mg·g-1。
表2 摘葉處理對(duì)葡萄枝條可溶性糖和淀粉含量的影響Table 2 Effects of leaf picking treatment on content of soluble sugar and starch in grape branches mg·g-1
由表3可知,摘葉處理后枝條中氨基酸含量均升高。對(duì)于‘著色香’,摘葉40%和全摘葉處理后枝條氨基酸含量顯著高于CK,分別理增加70.54%和56.58%;對(duì)于‘日150’,摘葉20%、40%、60%處理后枝條氨基酸含量均顯著高于CK,分別增加25.91%、46.36%和30.91%。摘葉處理后枝條內(nèi)可溶性蛋白含量均降低,‘著色香’摘葉40%處理后枝條可溶性蛋白含量顯著低于CK22.47%?!?50’摘葉20%、40%、60%處理后枝條可溶性蛋白含量均顯著低于CK,分別降低18.24%、31.23%和19.66%?!恪~40%處理后枝條脯氨酸含量最高,為29.98 mg·g-1,顯著高于CK;‘日150’摘葉20%、40%、60%處理后枝條脯氨酸含量與CK差異顯著,分別增加19.25%、35.46%和18.68%。
表3 摘葉處理對(duì)葡萄枝條氨基酸、可溶性蛋白和脯氨酸含量的影響Table 3 Effects of leaf picking treatment on content of aminoacid, soluble protein and proline in grape branches mg·g-1
由表4可知,摘葉后枝條內(nèi)POD活性均升高?!恪~20%、40%、60%處理的枝條POD活性均顯著高于CK;摘葉40%處理枝條POD活性最高,比CK增加146.654%;摘葉20%和摘葉60%處理分別增加134.99%和56.53%?!?50’摘葉40%處理枝條POD活性顯著高于CK 75.00%。摘葉后枝條內(nèi)SOD活性均有所下降,‘著色香’摘葉20%、40%、60%處理后枝條SOD活性與CK差異顯著,分別降低14.43%、20.42%、15.54%;‘日150’摘葉40%處理枝條SOD活性顯著降低,較CK降低17.54%。
表4 摘葉處理對(duì)葡萄枝條POD和SOD活性的影響Table 4 Effects of leaf picking treatment on POD and SOD activity in grapevine branchesU·g-1
由圖1所示,‘著色香’谷氨酰胺合成酶基因(VvGS)在摘葉20%處理下的表達(dá)量下調(diào),天冬酰胺合成酶基因(VvAS)在摘葉20%、60%和全摘葉處理下的表達(dá)量下調(diào),硝酸還原酶基因(VvNR)在摘葉40%和摘葉60%處理下的表達(dá)量下調(diào),亞硝酸還原酶基因(VvNiR)在摘葉40%處理下的表達(dá)量下調(diào),谷氨酸脫氫酶基因(VvGDH)在各處理下的表達(dá)量差異不明顯。
圖1 五個(gè)氮代謝關(guān)鍵基因在葡萄枝條上的半定量表達(dá)結(jié)果Figure1 Semi-quantitative expression results of five key genes of nitrogen metabolism on grape branches
‘日150’谷氨酰胺合成酶基因(VvGS)在各處理下的表達(dá)量變化不明顯,天冬酰胺合成酶基因(VvAS)、硝酸還原酶基因(VvNR)、谷氨酸脫氫酶基因(VvGDH)在摘葉40%處理下的表達(dá)量均下調(diào),亞硝酸還原酶基因(VvNiR)在摘葉40%和摘葉60%處理下的表達(dá)量下調(diào)??傮w來(lái)看,5個(gè)氮代謝關(guān)鍵基因在各處理的表達(dá)量存在明顯差異,摘葉40%和摘葉60%處理下,多數(shù)基因的表達(dá)量下調(diào)明顯,說(shuō)明一定數(shù)量的摘葉處理能降低枝條內(nèi)氮素的同化和固定速率,誘導(dǎo)葡萄進(jìn)入休眠。
由圖2可知,‘著色香’貝殼杉烯氧化酶基因(VvKO)在各處理下基因表達(dá)量變化不明顯,GA3β-羥化酶基因(VvGA3ox4)在各處理的表達(dá)量均下調(diào);9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(VvNCED1)在摘葉20%、60%、80%和全摘葉處理下表達(dá)量均上調(diào)。
圖2 GA合成酶、ABA合成酶相關(guān)基因在葡萄枝條上的半定量表達(dá)結(jié)果Figure 2 Semi-quantitative expression results of genes related to GA synthesis and ABA synthesis on grape
‘日150’貝殼杉烯氧化酶基因(VvKO)在摘葉40%處理下表達(dá)量下調(diào),GA3β-羥化酶基因(VvGA3ox4)在摘葉20%和摘葉40%處理下表達(dá)量下調(diào);9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(VvNCED1)在各處理下的表達(dá)量均上調(diào)。總體上,摘葉40%處理下,GA合成酶相關(guān)基因表達(dá)量降低明顯,而ABA合成酶相關(guān)基因表達(dá)量在各處理下均有所上調(diào),說(shuō)明40%摘葉處理可有效抑制植株的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng),減緩生理代謝速率,誘導(dǎo)葡萄進(jìn)入休眠。
休眠期糖類物質(zhì)代謝與休眠進(jìn)程密切相關(guān),影響休眠的因素會(huì)引起糖類物質(zhì)的變化[4]。糖類物質(zhì)不僅能為植物提供能量,維持植株的正常生理代謝,還能增強(qiáng)植株的滲透作用,降低植株細(xì)胞的冰點(diǎn),并增強(qiáng)植株對(duì)不良環(huán)境的抵抗力。在棗、酥梨和油桃上的研究結(jié)果表明,在自然休眠過(guò)程中,枝芽?jī)?nèi)可溶性糖含量逐漸增加[13-15]。本研究中,摘葉40%處理下葡萄枝條的可溶性糖和淀粉含量均顯著升高,有利于植株進(jìn)入休眠。
落葉果樹休眠期間可溶性蛋白和游離氨基酸含量一般呈負(fù)相關(guān),這種變化是由可溶性蛋白與游離氨基酸之間互相轉(zhuǎn)化形成的[16]。有研究表明,枝條內(nèi)的脯氨酸含量隨著環(huán)境溫度的下降而升高[17]。李芙等[18]對(duì)不同葡萄品種的研究表明,隨著可溶性蛋白含量的顯著降低,葡萄花芽的休眠進(jìn)一步加深。本研究中,摘葉40%處理下葡萄枝條中可溶性蛋白含量顯著降低,氨基酸和脯氨酸含量顯著增加,有利于葡萄植株提前進(jìn)入休眠。
研究表明,植物的氧化還原可平衡調(diào)節(jié)芽端分生組織的活性,直接或間接影響芽休眠[19-22]。H2O2作為傳遞休眠的信號(hào)物質(zhì),與其密切關(guān)聯(lián)的抗氧化酶POD和SOD,在果樹休眠中起重要作用[23-24]。SOD可催化O2-形成H2O2,POD則將H2O2分解成O2和H2O[25-26]。高東升等[27]以油桃和蜜桃為試材,在自然落葉前20 d用脫葉劑處理,促進(jìn)了自然休眠進(jìn)程的發(fā)生,并提早解除自然休眠,期間SOD活性呈下降趨勢(shì),POD活性一直升高。本試驗(yàn)結(jié)果表明,摘葉40%處理下葡萄枝條的POD活性顯著升高,SOD活性顯著下降,這有利于H2O2維持在一定水平,在促進(jìn)休眠的同時(shí),避免細(xì)胞膜脂發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng),與前人研究結(jié)果相一致。
氮是植物體內(nèi)需求量最大的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素,影響植物正常生長(zhǎng)發(fā)育,是植物必需的營(yíng)養(yǎng)元素之一[28]。銨態(tài)氮和硝態(tài)氮是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的主要氮源,其中被植物體吸收的硝態(tài)氮需要在硝酸還原酶(NR)、亞硝酸還原酶(NiR)等的作用下,轉(zhuǎn)化成NH3,再借助谷氨酰胺合成酶(GS)進(jìn)行氨同化,合成蛋白質(zhì)[29]。這其中,天冬酰胺則作為有機(jī)氮運(yùn)輸和儲(chǔ)存的主要形式[30]。本試驗(yàn)摘葉40%處理后,多數(shù)氮代謝相關(guān)基因表達(dá)量下調(diào),說(shuō)明40%摘葉處理使植株內(nèi)氮的同化和固定速率降低,營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)減弱,生理代謝速率降低。
GA和ABA同屬植物激素,通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)調(diào)控植物的各項(xiàng)生長(zhǎng)發(fā)育[31],并且,GA和ABA含量與植物的休眠進(jìn)程密切相關(guān)[32-33]。有研究表明,ABA能促進(jìn)芽的休眠,并且間接地抑制GA20ox基因的表達(dá)[34]。葛會(huì)波等[35]研究證明,GA含量隨著休眠加深而逐漸降低,且GA除通過(guò)自身信號(hào)通路來(lái)調(diào)控休眠外,還與ABA信號(hào)通路相互影響。本試驗(yàn)中,摘葉40%處理下GA合成相關(guān)基因表達(dá)量下調(diào),ABA合成相關(guān)基因表達(dá)量上調(diào),說(shuō)明葡萄采收后摘葉40%處理能抑制植株的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、減緩生理代謝速率,促進(jìn)葡萄進(jìn)入休眠。
在公主嶺市,‘著色香’和‘日150’葡萄果實(shí)采收后摘葉40%處理,能有效促進(jìn)植株內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累,改變抗氧化酶活性,有效地抑制膜脂過(guò)氧化,有助于葡萄植株提前進(jìn)入休眠。
關(guān)于摘葉誘導(dǎo)葡萄休眠的研究報(bào)道相對(duì)較少,研究也不夠深入。在未來(lái)的研究中,應(yīng)進(jìn)一步利用高通量測(cè)序以及高效液相色譜等技術(shù),開展轉(zhuǎn)錄組和代謝組學(xué)聯(lián)合分析,結(jié)合內(nèi)源激素含量變化,挖掘調(diào)控葡萄休眠相關(guān)的重要基因,解析葡萄休眠的代謝網(wǎng)絡(luò)途徑,為葡萄休眠機(jī)理研究及誘導(dǎo)休眠技術(shù)的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。