拜禮文,焦興蘋,譚金華,肖華,海平*,張煒*(1. 青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院,西寧 810016;. 青海省藥品檢驗檢測院/青海省中藏藥現(xiàn)代化研究重點(diǎn)試驗室/國家藥品監(jiān)督管理局中藥(藏藥)質(zhì)量控制重點(diǎn)試驗室,西寧 810016)
石榴健胃制劑(包括石榴健胃丸、石榴健胃散、石榴健胃片,以下同)由石榴子、肉桂、豆蔻、蓽茇及紅花組成,處方源自《四部醫(yī)典》[1],對于治療腸易激綜合征[2]、功能性消化不良[3]、炎癥性腸病[4]及小兒再發(fā)性腹痛[5]等疾病有較好的療效。處方中豆蔻、肉桂、蓽茇均含有揮發(fā)性成分[6-14],其中桉油精具有抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)痛、神經(jīng)保護(hù)等作用[15];桂皮醛具有抗炎、抗腫瘤、抗菌等作用[16];胡椒堿具有鎮(zhèn)痛、抗炎、解痙等作用[17]。
目前,全國生產(chǎn)石榴健胃丸(片、散)的藏藥生產(chǎn)廠家有8家,對于石榴健胃制劑的定性和定量分析,各現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)參差不齊,難以全面評價該制劑的質(zhì)量。本文將采用薄層色譜鑒別法(TLC)和氣相色譜法(GC)對方中豆蔻、肉桂、蓽茇進(jìn)行定性鑒別和定量研究,建立石榴健胃制劑的定性定量方法,以期完善和提升石榴健胃制劑標(biāo)準(zhǔn),全面控制制劑質(zhì)量。
薄層點(diǎn)樣和成像系統(tǒng)(瑞士CAMAG公司);7890B型氣相色譜儀(Agilent科技有限公司);AR5120型百分之一電子天平(上海OHAUS公司);SQP型萬分之一電子天平、MSA225-ICEDI型十萬分之一電子天平(德國Sartrious公司);DT1028CH型超聲波提取器(德國BANDELIN公司);Milli-Q advantage A10超純水系統(tǒng)(Merck millipore);硅膠板(青島海洋化工廠/默克公司)。
對照藥材肉桂(批號:121363-201703)、蓽茇(批號:121023-201103);對照品桉油精(批號:110788-201105,純度:99.9%)、桂皮醛(批號:110710-202022,純度:99.5%)、胡椒堿(批號:110775-201706,純度:98.9%)(中國食品藥品檢定研究院)。石榴健胃制劑中石榴子(安石榴科植物石榴Punica granntumL.)、紅花(菊科植物紅花Carthamus tinctoriusL.)、肉桂(樟科植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl)、蓽茇(胡椒科植物蓽茇Piper longumL.)、豆蔻(姜科植物白豆蔻Amomum kravanhPierreex Gagnep.)等藥材飲片(四川荷花池藥材市場,經(jīng)青海省藥品檢驗檢測院藏藥檢測中心楊鳳梅主任藥師鑒定)。石榴健胃制劑共26個批次,來自青海、甘肅、西藏自治區(qū)的5家生產(chǎn)企業(yè),均為市售藥品(見表1)。
表1 石榴健胃制劑樣品信息Tab 1 Sample information of Shiliu Jianwei preparation
2.1.1 豆蔻鑒別 取石榴健胃丸、片適量,研細(xì),稱取5 g;石榴健胃散稱取5 g,加入300 mL的水,揮發(fā)油提取器加水至3 mL,加入2 mL正己烷,連接回流冷凝管,加熱至微沸繼續(xù)加熱3 h,放冷,取正己烷液,通過鋪有無水硫酸鈉約1 g的漏斗過濾,收集濾液,揮發(fā)油測定器內(nèi)壁用2 mL正己烷洗滌,洗液合并濾液,搖勻,濾過,濾液作為供試品溶液;取豆蔻對照藥材5 g,同法制成對照藥材溶液。取桉油精對照品,加正己烷制成每1 mL含1 mg的溶液,作為對照品溶液;按石榴健胃丸的處方和工藝制備缺豆蔻的陰性樣品5 g,并按供試品溶液方法制成陰性樣品溶液。按2020年版《中國藥典》四部TLC法,吸取供試品溶液10 μL,對照藥材溶液、對照品溶液各1 μL,陰性樣品溶液10 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯(15∶5∶0.5)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以5%香草醛硫酸溶液,在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰,日光下立即檢視。供試品色譜中,在與豆蔻對照藥材、桉油精對照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn),陰性樣品無干擾,結(jié)果見圖1。
圖1 豆蔻薄層色譜圖Fig 1 TLC chromatogram of Cardamom
2.1.2 肉桂鑒別 取石榴健胃丸、片適量,研細(xì),稱取3 g;石榴健胃散稱取3 g,加甲醇10 mL,超聲處理30 min,濾過,濾液作為供試品溶液;取肉桂對照藥材1 g,同法制成對照藥材溶液。取桂皮醛對照品,加甲醇制成每1 mL含1 mg的對照品溶液;按石榴健胃丸的處方和工藝制備缺肉桂的陰性樣品3 g,并按供試品溶液方法制成陰性樣品溶液。按2020年版《中國藥典》四部TLC法,吸取供試品溶液10 μL,對照藥材溶液、對照品溶液各2 μL,陰性樣品溶液10 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以石油醚(60~90℃)-乙酸乙酯(17∶3)為展開劑,展開,取出,晾干,噴二硝基苯肼乙醇試液,置日光燈下檢視。供試品色譜中,在與肉桂對照藥材、桂皮醛對照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn),陰性樣品無干擾,結(jié)果見圖2。
圖2 肉桂薄層色譜圖Fig 2 TLC chromatogram of Cinnamon
2.1.3 蓽茇鑒別 取石榴健胃丸、片適量,研細(xì),稱取3 g;石榴健胃散稱取3 g,加甲醇20 mL,超聲處理30 min,濾液濃縮至2 mL,作為供試品溶液;取蓽茇對照藥材1 g,同法制成對照藥材溶液。取胡椒堿對照品,加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液,作為對照品溶液;按石榴健胃丸的處方和工藝制備缺蓽茇的陰性樣品3 g,并按供試品溶液方法制成陰性樣品溶液。按2020年版《中國藥典》四部TLC法,吸取上述4種溶液10 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以環(huán)己烷-乙酸乙酯(3∶2)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以10%硫酸乙醇溶液,置紫外燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中,在與蓽茇對照藥材、胡椒堿對照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn),陰性樣品無干擾,結(jié)果見圖3。
圖3 蓽茇薄層色譜圖Fig 3 TLC chromatogram of Cubeb longum
2.2.1 色譜條件 色譜柱:Agilent DB-5毛細(xì)管柱(30 m×0.250 mm×0.25 μm);進(jìn)樣口溫度:230℃;分流比20∶1;檢測器(FID)溫度:250℃;流量控制模式:恒流模式;載氣(氮?dú)猓?0 mL·min-1;氫氣:40 mL·min-1;空氣:400 mL·min-1;流量:1.0 mL·min-1;柱溫為程序升溫,初始溫度:50℃,保持10 min;以5℃·min-1的速率升溫至180℃,保持30 min;再以5℃·min-1的速率升溫至240℃,保持30 min。
2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取桉油精59.13 mg、桂皮醛458.19 mg、胡椒堿31.34 mg分別置于25、50、10 mL棕色量瓶中,用無水乙醇溶解并定容至刻度,即得約含桉油精2.36 mg·mL-1、桂皮醛9.12 mg·mL-1和胡椒堿3.10 mg·mL-1的對照品儲備液。分別精密吸取上述各對照品儲備液0.5、0.3、2.0 mL置于10 mL量瓶中,用無水乙醇稀釋至刻度,即得混合對照品溶液(含桉油精0.12 mg·mL-1,桂皮醛0.27 mg·mL-1,胡椒堿0.62 mg·mL-1)。
2.2.3 供試品溶液的制備 取石榴健胃丸適量,研細(xì),稱取5.0 g;石榴健胃片20片,研細(xì),稱取5.0 g;石榴健胃散稱取5.0 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入無水乙醇20 mL,稱定重量,超聲處理30 min,放冷,再稱定重量,用無水乙醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。
2.2.4 陰性樣品溶液的制備 按石榴健胃制劑處方比,分別取缺豆蔻、缺肉桂、缺蓽茇陰性樣品,依照“2.2.3”項下方法,分別制備得缺豆蔻、缺肉桂、缺蓽茇的陰性樣品溶液,備用。
2.2.5 專屬性試驗 分別精密吸取“2.2.2”項下混合對照品、供試品及陰性樣品溶液進(jìn)樣測定,記錄色譜圖。供試品溶液色譜中,在桉油精、桂皮醛、胡椒堿混合對照品色譜峰相應(yīng)位置上有相同保留時間色譜峰,且陰性樣品無干擾,見圖4。
圖4 石榴健胃制劑的氣相色譜圖Fig 4 Gas chromatogram of Shiliu Jianwei preparation
2.2.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取不同量的桉油精(2.36 mg·mL-1)、桂皮醛(9.12 mg·mL-1)、胡椒堿(3.10 mg·mL-1)對照品儲備液置10 mL棕色量瓶中,加無水乙醇定容至刻度,搖勻,即得各系列濃度的混合對照品溶液,進(jìn)樣分析,記錄對應(yīng)的峰面積。待測成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)、峰面積為縱坐標(biāo)(Y),得到3種成分的線性關(guān)系,結(jié)果見表2。
2.2.7 檢測限與定量限 取混合對照溶液,按逐步稀釋法,按信噪比3∶1、10∶1分別測得各成分的檢測限和定量限,見表2。
表2 桉油精、桂皮醛和胡椒堿線性關(guān)系考察結(jié)果Tab 2 Linearity of eucalyptol,cinnamaldehyde and piperine
2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液(S17),分別在0、2、4、10、18及24 h進(jìn)樣測定,結(jié)果表明供試品中桉油精、胡椒堿在24 h內(nèi)均穩(wěn)定性良好,其峰面積RSD值分別為0.67%、0.95%;桂皮醛在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好,峰面積RSD為0.62%。
2.2.9 精密度試驗 精密吸取含桉油精(0.12 mg·mL-1)、桂皮醛(0.27 mg·mL-1)、胡椒堿(0.62 mg·mL-1)的混合對照品溶液,連續(xù)進(jìn)樣5次,計算桉油精、桂皮醛、胡椒堿峰面積的RSD值分別為1.4%、0.84%及0.61%。結(jié)果表明儀器精密度良好。
2.2.10 重復(fù)性試驗 取供試品(S17),精密稱取6份,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,測定桉油精、桂皮醛、胡椒堿的含量的平均值分別為0.24、0.39、1.51 mg·g-1,RSD值分別為1.4%、0.89%、0.20%,表明方法重現(xiàn)性良好。
2.2.11 回收試驗 取已知含量樣品(S17)6份,精密加入無水乙醇配制的桉油精(120.126 μg·mL-1)、桂皮醛(195.09 μg·mL-1)、胡椒堿(740.07 μg·mL-1)的混合對照品溶液5 mL,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,進(jìn)樣測定,計算平均回收率分別為99.42%、100.03%、99.79%,RSD值分別為1.4%、0.82%、0.30%。
2.2.12 樣品含量測定 將26批樣品按照“2.2.2”方法制成供試品溶液,進(jìn)樣測定,分別計算桉油精、桂皮醛、胡椒堿的含量,結(jié)果見表3。
依據(jù)表3測定結(jié)果并參照《中國藥典》2020年版一部對豆蔻、肉桂、蓽茇中桉油精、桂皮醛、胡椒堿含量限度要求[規(guī)定桉油精(豆蔻)不得低于3.0%;桂皮醛(肉桂)不得低于1.5%;胡椒堿(蓽茇)不得低于2.5%],同時考慮到3種成分均為揮發(fā)性成分,生產(chǎn)工藝中對溫度較為敏感。將桉油精的轉(zhuǎn)化率10%、桂皮醛的轉(zhuǎn)化率20%、胡椒堿的轉(zhuǎn)化率75%計算,則石榴健胃制劑中桉油精含量不得少于0.11 mg·g-1,桂皮醛含量不得少于0.20 mg·g-1,胡椒堿含量不得少于0.85 mg·g-1。
表3 石榴健胃制劑中桉油精、桂皮醛、胡椒堿含量測定結(jié)果(mg·g-1)Tab 3 Determination of eucalyptol,cinnamaldehyde and piperine in Shiliu Jianwei preparation (mg·g-1)
曾對各現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)薄層鑒別方法結(jié)果進(jìn)行了對比,發(fā)現(xiàn)各現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)存在著斑點(diǎn)Rf值過高、不清晰、專屬性不強(qiáng)等問題。為此課題組對展開劑、提取方法等進(jìn)行了考察,對肉桂、蓽茇分別選用了無水乙醇、乙醇及甲醇作為提取溶劑,選用超聲30 min、20 min,振搖20 min、30 min的提取方法進(jìn)行綜合交叉考察;豆蔻展開劑采用石油醚-乙酸乙酯(4∶1)、甲苯-乙酸乙酯(9∶1)等,肉桂展開劑采用石油醚(60~90℃)-乙酸乙酯(17∶3)及乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7∶2∶3∶0.4)進(jìn)行了考察;結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用本文方法可得到斑點(diǎn)清晰、分離度較好、專屬性較強(qiáng)的結(jié)果。
考察了超聲、加熱回流等不同提取方法進(jìn)行提取,結(jié)果超聲提取效果最好。同時對提取溶劑(正己烷、無水乙醇)、超聲時間(20、30、40 min)、取樣量(2、3、5 g)進(jìn)行考察,結(jié)果顯示,取5 g樣品加無水乙醇超聲30 min效果最好。
根據(jù)化學(xué)成分限度、檢測結(jié)果及前期對企業(yè)問卷調(diào)查和實地調(diào)研,對比各企業(yè)生產(chǎn)參數(shù),發(fā)現(xiàn)E企業(yè)產(chǎn)品干燥溫度為80℃,而其他企業(yè)產(chǎn)品干燥溫度均≤60℃,這表明部分生產(chǎn)企業(yè)在質(zhì)量控制方面存在一定差異。造成這種差異的原因是原藥材質(zhì)量參差不齊或生產(chǎn)工藝不穩(wěn)定。為了加強(qiáng)石榴健胃制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),需加強(qiáng)對其中豆蔻、肉桂、蓽茇等藥材的質(zhì)量控制;還需考察生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性,設(shè)置合理生產(chǎn)工藝參數(shù)。
綜上,本研究在現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上,對豆蔻、肉桂、蓽茇的TLC鑒定方法進(jìn)行了提升,建立了可同時測定石榴健胃制劑中桉油精、桂皮醛、胡椒堿含量的新方法,以便提高對豆蔻、肉桂、蓽茇等揮發(fā)性藥味在制劑中的質(zhì)量均一性。本方法具有較好的精密度和準(zhǔn)確度,可以為藏成藥石榴健胃制劑的質(zhì)量評價及標(biāo)準(zhǔn)制訂提供依據(jù)。