• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    通俗環(huán)毛蚓、參環(huán)毛蚓、赤子愛勝蚓的分子鑒定及纖溶、抗凝活性對(duì)比

    2023-04-01 05:29:12楊麒琳馬韞楠楊萬青汪文杰鐘宛凌樊簫雨楊天姿杜守穎李鵬躍北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院北京100029
    中南藥學(xué) 2023年2期
    關(guān)鍵詞:赤子沉淀物纖溶

    楊麒琳,馬韞楠,楊萬青,汪文杰,鐘宛凌,樊簫雨,楊天姿,杜守穎,李鵬躍(北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院,北京 100029)

    2020年版《中國藥典》收錄的地龍為鉅蚓科動(dòng)物參環(huán)毛蚓Pheretima aspergillum(E. Perrier)、通俗環(huán)毛蚓Pheretima vulgarisChen(P. vulgaris)、威廉環(huán)毛蚓Pheretima guillelmi(Michaelsen)或櫛盲環(huán)毛蚓Pheretima pectiniferaMichaelsen 的干燥體[1]。前一種習(xí)稱“廣地龍”,主產(chǎn)地為廣東、廣西、海南等;后3種習(xí)稱“滬地龍”,主產(chǎn)地為上海、江蘇、浙江等[2]。我國地龍藥材的基原動(dòng)物主要有14個(gè)品種,分別屬于鉅蚓科(Megascolec-idae)、正蚓科(Lmubricidae)和鏈胃蚓科(Moniligastridae)5 個(gè)屬[3]。赤子愛勝蚓Eisenia foetida(Savigny)為正蚓科愛勝蚓屬,俗稱紅蚯蚓,其繁殖率高,適宜人工養(yǎng)殖,是目前世界上養(yǎng)殖最普遍的蚯蚓品種[4]。地龍及混淆品的基原動(dòng)物種類繁多,且形態(tài)極其相似,容易造成品種混雜和摻假的現(xiàn)象[5]。通過 DNA 分子水平進(jìn)行物種的鑒別是近年來興起的物種鑒定新方法,在中藥材鑒定領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用。格小光等[6]采集全國多個(gè)藥材市場(chǎng)的地龍,進(jìn)行 DNA分子鑒定,與數(shù)據(jù)庫比對(duì),發(fā)現(xiàn) 55% 的市售地龍均非藥典規(guī)定的基原。因此采用 DNA 分子鑒定地龍是有效的手段。

    現(xiàn)代研究表明,地龍中含有的化學(xué)成分主要有蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、核苷、有機(jī)酸、脂質(zhì)等[7],其中地龍內(nèi)含有的蛋白多肽類成分高達(dá) 55%~68%[8]。目前有關(guān)赤子愛勝蚓的研究大多集中在其對(duì)環(huán)境污染物的富集、生物降解等方面[9]。而赤子愛勝蚓不僅在環(huán)境保護(hù)方面發(fā)揮功能,同時(shí)也是一種有效的抗血栓藥材。赤子愛勝蚓是藥典地龍品種之外研究抗血栓活性較多的蚯蚓品種。20世紀(jì) 80年代日本學(xué)家 Mihara[10]首次從赤子愛勝蚓中分離得到具有纖溶酶活性的蛋白酶,后來研究者們開始研究蚯蚓具有抗血栓功效的蛋白多肽類成分,發(fā)現(xiàn)地龍蛋白中的纖維蛋白溶解酶、蚓激酶、蚓膠原酶對(duì)體內(nèi)凝血系統(tǒng)具有顯著的影響,是抗凝血活性物質(zhì)的主要成分[11]。乙醇沉淀法是純化蛋白常用方法,是利用蛋白的溶解度進(jìn)行分離純化,彭洪兵等[12]對(duì)比鹽析法和水提醇沉法對(duì)地龍蛋白活性的影響,結(jié)果表明水提醇沉法的蛋白提取率及纖溶活性均高于鹽析法。因此本實(shí)驗(yàn)選擇藥典內(nèi)的滬地龍品種之一通俗環(huán)毛蚓和廣地龍的品種參環(huán)毛蚓與藥典外的赤子愛勝蚓,對(duì)比這3種蚯蚓水提液以及乙醇沉淀物的抗血栓活性大小,為今后地龍抗血栓類產(chǎn)品的開發(fā)選擇蚯蚓品種提供參考。

    1 材料

    電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(PHGT-9140A),臺(tái)式高速離心機(jī)(5418 R,Eppendorf),超微量分光光度計(jì)(NanoDrop 2000,Thermo),PCR儀(C1000,Bio-Rad)、電泳儀(PowerPac,Bio-Rad),凝膠成像儀(UVP,Upland),微量移液器(Eppendorf),Milli Q 超純水機(jī)(Millipore),pH計(jì)(FE20,Mettler Toledo),恒溫空氣浴搖床(INNOVA 40R,New Brunswick),勻漿機(jī)(QSJ1 型,OIDIRE),電動(dòng)攪拌器(OES20 型,BNCH),臺(tái)式離心機(jī)(TDL80-2B 型,上海安亭科學(xué)儀器廠),Multiscan Go 全波長酶標(biāo)儀(Thermo Scientific),電子天平(BS224S 型,Sartorius),Sysmex CA500 全自動(dòng)血凝分析儀(Sysmex)。

    鮮體通俗環(huán)毛蚓(上海市地龍養(yǎng)殖基地),鮮體赤子愛勝蚓(天津市蚯蚓培養(yǎng)基地),鮮體參環(huán)毛蚓(廣西蚯蚓養(yǎng)殖基地),基因組提取試劑盒Mollusc DNA Kit D3373(OMEGA Bio-tek,America),F(xiàn)ast Pure Gel DNA Extraction Mini Kit、5minTM TA /Blunt-Zero Cloning Kit、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、Fast-T1 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞C505-02/03(Vazyme,南京諾唯贊生物科技有限公司),無水乙醇(Fisher),氯仿(北京科華經(jīng)緯科技有限公司),異戊醇(X1,西隴化工股份有限公司),氯化鈉、氫氧化鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),Tris、EDTA(Bioruler,America),冰醋酸(北京化工股份有限公司),Tryptone、Yeast Extract(OXOID),瓊脂糖(Biowest Agarose,北京拜爾迪生物有限公司),6x SuperStain Loading Buffer(北京康為試劑生物科技有限公司),Agar粉(北京索萊寶科技有限公司),氨芐青霉素鈉(北京百瑞極生物科技有限公司),COI通用引物(COI-F:5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3',COI-R:5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3',Tm 值為 54),纖維蛋白原(牛血)(批號(hào):140607-202042)、凝血酶(牛血)(批號(hào):140606-201826)、蚓激酶(批號(hào):140650-201703)(中國食品藥品檢定研究院),生理鹽水(山東華魯制藥有限公司,批號(hào):SD21061115),瓊脂糖(上海貝晶),藥用級(jí)95%乙醇。

    2 方法

    2.1 3種蚯蚓的分子鑒定

    2.1.1 蚯蚓DNA的提取 在研缽中放入活體蚯蚓2 cm的肌肉組織,加入液氮冷凍,快速研磨成粉,按照軟體動(dòng)物基因組提取試劑盒(Mollusc DNA Kit D3373)說明書提取蚯蚓基因組 DNA,通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量,并通過NanoDrop 2000 進(jìn)行濃度及純度檢測(cè)。

    2.1.2 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè) 根據(jù)PCR擴(kuò)增試劑盒(Fast Pure Gel DNA Extraction Mini Kit)說明書加入通用引物、DNA 和試劑,PCR的反應(yīng)程序以50 μL反應(yīng)體系建立,具體程序見表1。1% 瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè),將擴(kuò)增產(chǎn)物連接至質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌,將菌液送華大基因進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序完成后,將克隆的基因片段在National Center for Biotechnology Information(NCBI)中進(jìn)行 BLAST 搜索比對(duì)。

    表1 PCR反應(yīng)程序Tab 1 PCR reaction procedure

    2.2 3種蚯蚓水提液及乙醇沉淀物的纖溶、抗凝活性對(duì)比

    2.2.1 3種蚯蚓水提液的制備 將鮮體蚯蚓切碎,用打漿機(jī)制成蚯蚓泥,加4倍量純水,勻漿處理,離心(4000 r·min-1,15 min),收集上清液,稀釋適當(dāng)倍數(shù)至檢測(cè)范圍內(nèi)作為測(cè)試樣品。

    2.2.2 3種蚯蚓乙醇沉淀物的制備 取鮮體蚯蚓制備的水提液,加定量 95% 乙醇,調(diào)至乙醇濃度為80%,靜置后收集沉淀,凍干。稱取 10 mg 乙醇沉淀物加 10 mL 生理鹽水溶解,稀釋適當(dāng)倍數(shù)至檢測(cè)范圍內(nèi)作為測(cè)試樣品。

    2.2.3 纖維蛋白平板法評(píng)價(jià)纖溶活性 參考劉濤等[13]利用纖維蛋白平板法,以尿激酶為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定地龍中蛋白酶的活性,本實(shí)驗(yàn)采用蚓激酶作為標(biāo)準(zhǔn)品。取一次性平皿,加入0.5 mL凝血酶(40 BP·mL-1)。將8 mL纖維蛋白原(2 mg·mL-1)與10 mL的瓊脂糖溶液(5 mg·mL-1)迅速混合后加入皿中,輕輕搖勻,室溫水平放置1 h后打孔,分別吸取10 μL濃度為4000、6000、8000、10 000、12 000、16 000 U·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品蚓激酶以及“2.2.1”項(xiàng)下制得的測(cè)試樣品進(jìn)行點(diǎn)樣加蓋,置37℃恒溫箱中孵育18 h,取出,測(cè)量溶圈垂直兩直徑,以標(biāo)準(zhǔn)品蚓激酶單位數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),垂直兩直徑乘積的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo),繪制回歸方程,計(jì)算樣品效價(jià)單位數(shù)作為纖溶活性,利用公式1計(jì)算纖溶比活(U·μg-1)。

    公式 1:纖溶比活(U·μg-1)=纖溶活性(U·mL-1)/蛋白濃度(μg·mL-1)

    2.2.4 Fibg-TT法評(píng)價(jià)抗凝活性 參考吳婭麗等[14]利用全自動(dòng)血凝分析儀測(cè)定纖維蛋白原-凝血酶時(shí)間(Fibg-TT)來評(píng)價(jià)地龍及其相關(guān)制劑的體外抗凝活性。以生理鹽水為空白對(duì)照,測(cè)定系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品蚓激酶液(250、500、1000、1500、2000 U·mL-1)和測(cè)試樣品,以標(biāo)準(zhǔn)品蚓激酶的單位數(shù)為橫坐標(biāo),以系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品蚓激酶 Fibg-TT 的對(duì)數(shù)與空白組 Fibg-TT 的對(duì)數(shù)的差值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得樣品效價(jià)單位數(shù)作為抗凝活性,利用公式 2 計(jì)算抗凝比活(U·μg-1)。

    公式2:抗凝比活(U·μg-1)=抗凝活性(U·mL-1)/蛋白濃度(μg·mL-1)

    2.3 蛋白含量測(cè)定

    采用BCA法測(cè)定蚯蚓蛋白含量,測(cè)試樣品用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定,以系列濃度BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白含量。

    2.4 SDS-PAGE 凝膠電泳

    采用 SDS-PAGE檢測(cè)3種蚯蚓乙醇沉淀物的分子量,每個(gè)樣品上樣 10 μL。采用 12% 電泳預(yù)制膠,電壓為 150 V,電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)蛋白膠快速染色液染色,最后用純水脫色至背景清晰,重復(fù)2次。

    2.5 數(shù)據(jù)處理

    每種蚯蚓從提取到測(cè)試重復(fù) 3 次,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用 SPSS 20.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1 3種蚯蚓的分子鑒定結(jié)果

    3.1.1 蚯蚓 DNA 的提取、PCR 擴(kuò)增 對(duì)3種蚯蚓提取的 DNA 進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè),DNA 條帶均清晰明亮,無彌散情況,如圖 1。3種蚯蚓提取的 DNA 的A260/280均在 1.8~2.0,表明提取的DNA 純度較高,無蛋白質(zhì)污染。利用通用引物COI對(duì)3種蚯蚓提取的 DNA 片段進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶均呈現(xiàn)整齊、單一明亮的條帶,如圖 2。

    圖1 3種蚯蚓提取的 DNA 的瓊脂糖電泳Fig 1 Agarose electrophoresis of DNA of the three earthworms

    圖2 3種蚯蚓 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳Fig 2 Agarose electrophoresis of PCR products of the three earthworms

    3.1.2 PCR 產(chǎn)物測(cè)序分析 去除載體 TOPO 序列及引物端可知擴(kuò)增的COI基因片段大小分別是:參環(huán)毛蚓為 709 bp、赤子愛勝蚓為 768 bp、通俗環(huán)毛蚓為 765 bp。BLAST 相似性比對(duì)結(jié)果顯示本實(shí)驗(yàn)3種蚯蚓都能成功匹配上對(duì)應(yīng)物種。其中本實(shí)驗(yàn)樣品通俗環(huán)毛蚓與 NCBI 基因庫中報(bào)道的所有已知基原的蚯蚓序列相似度最高的為通俗腔蚓(Metaphire Vulgaris)線粒體基因COIKF205980.1,相似度為 99.27%。通俗腔蚓與通俗環(huán)毛蚓為同名異物現(xiàn)象,該現(xiàn)象是由于蚯蚓分類系統(tǒng)的改進(jìn)而出現(xiàn)的結(jié)果[15]。本實(shí)驗(yàn)樣品赤子愛勝蚓與 NCBI 基因庫中報(bào)道的所有已知基原的蚯蚓序列相似度最高的為赤子愛勝蚓(Eisenia fetida)線粒體基因COILC006114.1,相似度為98.87%。本實(shí)驗(yàn)樣品參環(huán)毛蚓與 NCBI 基因庫中報(bào)道的所有已知基原的蚯蚓序列相似度最高的為參環(huán)毛蚓(Pheretima aspergillum)線粒體基因COIMN729554.1,相似度為 99.85%。

    3.2 3種蚯蚓水提液的纖溶、抗凝活性對(duì)比

    計(jì)算3批參環(huán)毛蚓、通俗環(huán)毛蚓、赤子愛勝蚓水提液的纖溶比活、抗凝比活和蛋白含量百分比,具體結(jié)果如表 2 所示。3種蚯蚓的水提液纖溶比活用單因素方差分析檢驗(yàn),LSD 法進(jìn)行兩兩比較,F(xiàn)=1753.750,P<0.05;3種蚯蚓的水提液抗凝比活用單因素方差分析檢驗(yàn),LSD 法進(jìn)行兩兩比較,F(xiàn)=274.35,P<0.05。因此3種蚯蚓水提液的纖溶比活之間與抗凝比活之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果顯示參環(huán)毛蚓水提液的纖溶比活和抗凝比活最強(qiáng),通俗環(huán)毛蚓次之,赤子愛勝蚓水提液的纖溶比活和抗凝比活遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于參環(huán)毛蚓和通俗環(huán)毛蚓,而赤子愛勝蚓水提液的蛋白含量最高。

    表2 參環(huán)毛蚓、通俗環(huán)毛蚓、赤子愛勝蚓水提液的纖溶比活、抗凝比活與蛋白含量(n=3)Tab 2 Specific activity of fibrinolysis,specific activity of anticoagulation and protein content of water extracts from Pheretima aspergillum,Pheretima vulgaris and Eisenia fetida (n=3)

    3.3 3種蚯蚓乙醇沉淀物的纖溶、抗凝活性對(duì)比

    3批參環(huán)毛蚓、通俗環(huán)毛蚓、赤子愛勝蚓乙醇沉淀物的纖溶比活、抗凝比活和蛋白含量百分比結(jié)果見表 3。3種蚯蚓的乙醇沉淀物纖溶比活用單因素方差分析檢驗(yàn),LSD 法進(jìn)行兩兩比較,F(xiàn)=1053.967,P<0.05;3種蚯蚓的乙醇沉淀物抗凝比活用單因素方差分析檢驗(yàn),LSD 法進(jìn)行兩兩比較,F(xiàn)=127.904,P<0.05。因此3種蚯蚓乙醇沉淀物的纖溶比活之間和抗凝比活之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果參環(huán)毛蚓乙醇沉淀物的纖溶比活最強(qiáng),通俗環(huán)毛蚓乙醇沉淀物的抗凝比活最強(qiáng),赤子愛勝蚓的纖溶比活、抗凝比活、蛋白含量均小于參環(huán)毛蚓和通俗環(huán)毛蚓。

    表3 參環(huán)毛蚓、通俗環(huán)毛蚓、赤子愛勝蚓乙醇沉淀物的纖溶比活、抗凝比活與蛋白含量(n=3)Tab 3 Specific activity of fibrinolysis,specific activity of anticoagulation and protein content of ethanol precipitates from Pheretima aspergillum,Pheretima vulgaris and Eisenia fetida (n=3)

    3.4 SDS-PAGE 結(jié)果分析

    重復(fù)2次結(jié)果一致性較好,典型圖譜見圖3,通俗環(huán)毛蚓與參環(huán)毛蚓乙醇沉淀物的條帶集中在25~70 kDa,但條帶分布有所差異,而赤子愛勝蚓乙醇沉淀物的條帶集中在 25~40 kDa,條帶數(shù)量較前兩種蚯蚓少。其中參環(huán)毛蚓乙醇分級(jí)沉淀物在 55~70 kDa分布一個(gè)較為清晰的條帶,通俗環(huán)毛蚓乙醇分級(jí)沉淀物在 25~35 kDa 分布一個(gè)較為清晰的條帶。3種蚯蚓的乙醇分級(jí)沉淀物均在 10~15 kDa 有一條較寬的條帶。

    圖3 3種蚯蚓乙醇沉淀物的 SDS-PAGE 圖Fig 3 SDS-PAGE of ethanol precipitates from three earthworms

    4 討論

    雖然形態(tài)鑒定是傳統(tǒng)鑒定方法,但地龍的外表形態(tài)特征相似,僅通過形態(tài)鑒定無法確定品種,容易受主觀因素影響,且混雜品種較多,采用 DNA 分子鑒定可以更準(zhǔn)確、高效地鑒定地龍品種。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用基于COI基因?qū)︴r體地龍進(jìn)行DNA 分子鑒定,序列結(jié)果與 NCBI 中的基因庫對(duì)比,與已知地龍品種的序列相似度均在 98% 以上,以此相似度可確定品種,有效鑒定出參環(huán)毛蚓、通俗環(huán)毛蚓和赤子愛勝蚓。

    不同地龍含有的抗血栓活性蛋白有所區(qū)別,抗血栓的能力也有差別。本研究結(jié)果表明,參環(huán)毛蚓的水提液抗凝比活和纖溶比活最強(qiáng);參環(huán)毛蚓乙醇沉淀物的纖溶比活最強(qiáng),而通俗環(huán)毛蚓乙醇沉淀物的抗凝比活最強(qiáng);赤子愛勝蚓的水提液和乙醇沉淀物的抗凝比活和纖溶比活都遠(yuǎn)小于前兩者。赤子愛勝蚓中發(fā)揮抗血栓作用的主要是蚓激酶,這說明藥典內(nèi)的兩種地龍?bào)w內(nèi)含有除蚓激酶之外獨(dú)特的蛋白,其具有較高的抗血栓活性。通過縱向?qū)Ρ龋球疽掖汲恋砦锏目鼓然钆c纖溶比活均強(qiáng)于蚯蚓的水提液,可知通過乙醇沉淀法可以有效純化富集抗血栓地龍蛋白。

    參環(huán)毛蚓的水提液抗凝活性更強(qiáng),而通俗環(huán)毛蚓的乙醇沉淀物抗凝活性更強(qiáng),可能因?yàn)橥ㄋ篆h(huán)毛蚓水提液中含有非抗凝血蛋白和非蛋白物質(zhì)含量較高,且雜蛋白中可能有促凝血的蛋白,用乙醇純化后,去除了部分雜質(zhì),使得通俗環(huán)毛蚓中抗凝蛋白能更充分地發(fā)揮其作用。同時(shí)也說明地龍蛋白是主要具有抗凝活性的物質(zhì),且純度越高作用越明顯。赤子愛勝蚓用水提取后的蛋白含量在三者間最高,再用乙醇純化后蛋白含量反而最低,推測(cè)赤子愛勝蚓體內(nèi)含有大量非抗血栓活性蛋白和非蛋白物質(zhì),或者用乙醇純化赤子愛勝蚓蛋白效率較低,應(yīng)該另尋找更適合的純化方法。

    3種蚯蚓乙醇沉淀物在 25~40 kDa 均有較明顯的條帶,說明地龍具有抗血栓活性的獨(dú)特蛋白分子量分布于此,但條帶分布有明顯差異,說明3種蚯蚓中具有抗血栓活性蛋白有所差異。

    從本研究結(jié)果可看出,藥典內(nèi)的兩種蚯蚓的水提液和乙醇沉淀物的抗凝活性和纖溶活性都遠(yuǎn)強(qiáng)于赤子愛勝蚓,而目前研究較多的是藥典以外的蚯蚓品種(赤子愛勝蚓、粉正蚓)等,關(guān)于藥典內(nèi)的地龍研究較少,且通俗環(huán)毛蚓和參環(huán)毛蚓分布廣,數(shù)量多,因此深入研究藥典內(nèi)地龍的基原蚯蚓的抗血栓活性蛋白具有重大意義。本實(shí)驗(yàn)僅研究了3種蚯蚓水提液和乙醇沉淀物的纖溶和抗凝活性,后續(xù)可進(jìn)一步純化參環(huán)毛蚓和通俗環(huán)毛蚓蛋白的抗血栓活性部位,研究其體內(nèi)外的活性及物質(zhì)基礎(chǔ)。

    猜你喜歡
    赤子沉淀物纖溶
    過敏性紫癜兒童凝血纖溶系統(tǒng)異常與早期腎損傷的相關(guān)性
    纖維蛋白原聯(lián)合D二聚體檢測(cè)對(duì)老年前列腺增生術(shù)后出血患者纖維蛋白溶解亢進(jìn)的應(yīng)用價(jià)值
    赤子
    心聲歌刊(2022年6期)2022-02-14 13:20:18
    鷓鴣天·赤子賦
    黃河之聲(2021年17期)2021-12-16 01:59:54
    美國FDA批準(zhǔn)Ryplazim用于成人和兒童治療1型纖溶酶原缺陷癥
    “海外赤子”指的是誰
    高濃度硫酸體系中鈾與鐵的HDEHP萃取分離
    濕法冶金(2018年6期)2018-12-13 09:19:58
    胸腔積液沉淀物在惡性胸腔積液診斷中的臨床應(yīng)用價(jià)值
    沉淀物對(duì)安塞油田原油計(jì)量的影響及應(yīng)對(duì)措施
    引導(dǎo)萬千赤子行
    中國火炬(2015年4期)2015-07-31 17:39:29
    美女大奶头视频| 日韩成人在线观看一区二区三区| 黄色视频不卡| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产69精品久久久久777片 | 精品午夜福利视频在线观看一区| 最近视频中文字幕2019在线8| 99久久精品热视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| 色老头精品视频在线观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 日日爽夜夜爽网站| 精品久久久久久久久久久久久| 制服人妻中文乱码| 精品国产乱子伦一区二区三区| 看片在线看免费视频| 不卡av一区二区三区| 国产精品98久久久久久宅男小说| 身体一侧抽搐| 最好的美女福利视频网| 国产精品久久久久久精品电影| av在线播放免费不卡| 国产一级毛片七仙女欲春2| 身体一侧抽搐| 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲av五月六月丁香网| 亚洲成a人片在线一区二区| 香蕉国产在线看| 18美女黄网站色大片免费观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 久久久久久久精品吃奶| 香蕉av资源在线| 午夜影院日韩av| 午夜福利18| 身体一侧抽搐| 亚洲午夜理论影院| 亚洲欧美日韩高清专用| 亚洲欧美日韩无卡精品| av中文乱码字幕在线| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产区一区二久久| 桃色一区二区三区在线观看| 欧美色视频一区免费| 两性夫妻黄色片| 麻豆久久精品国产亚洲av| 中文字幕av在线有码专区| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 日韩欧美国产在线观看| 麻豆国产av国片精品| 亚洲av电影在线进入| 又黄又粗又硬又大视频| 老司机午夜福利在线观看视频| 一本久久中文字幕| 99在线视频只有这里精品首页| 俺也久久电影网| 制服诱惑二区| 精品熟女少妇八av免费久了| 久久九九热精品免费| 久久午夜亚洲精品久久| 99精品久久久久人妻精品| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 欧美3d第一页| 日本三级黄在线观看| 久久热在线av| 日日爽夜夜爽网站| 欧美日本视频| av免费在线观看网站| 久久久久久免费高清国产稀缺| 日韩欧美 国产精品| 亚洲欧美日韩无卡精品| 日韩欧美三级三区| 亚洲中文av在线| 日本a在线网址| 给我免费播放毛片高清在线观看| 老司机午夜福利在线观看视频| 中文在线观看免费www的网站 | 欧美日韩黄片免| 99热只有精品国产| 久久香蕉激情| 中文字幕久久专区| 波多野结衣高清无吗| a级毛片a级免费在线| 久久久久性生活片| 欧美精品啪啪一区二区三区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲国产欧美一区二区综合| 欧美久久黑人一区二区| 成人av一区二区三区在线看| 露出奶头的视频| 欧美色欧美亚洲另类二区| 午夜日韩欧美国产| 亚洲乱码一区二区免费版| 精品久久久久久久毛片微露脸| 精品无人区乱码1区二区| 91九色精品人成在线观看| 日本五十路高清| 亚洲性夜色夜夜综合| 成年免费大片在线观看| 国产黄片美女视频| 亚洲av美国av| 免费在线观看黄色视频的| 成人欧美大片| 2021天堂中文幕一二区在线观| 日韩欧美免费精品| 国产成人啪精品午夜网站| 黄色成人免费大全| 亚洲av美国av| 免费在线观看成人毛片| 色老头精品视频在线观看| 99久久精品热视频| 久久香蕉激情| netflix在线观看网站| av中文乱码字幕在线| 一夜夜www| 亚洲精品国产一区二区精华液| 成年版毛片免费区| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国内精品久久久久精免费| 亚洲av片天天在线观看| 国产精品99久久99久久久不卡| 久久欧美精品欧美久久欧美| 精品乱码久久久久久99久播| 精品久久久久久久毛片微露脸| 十八禁人妻一区二区| 亚洲人成伊人成综合网2020| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲avbb在线观看| 91大片在线观看| 欧美日本视频| 动漫黄色视频在线观看| 国产一级毛片七仙女欲春2| 国产成人系列免费观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲九九香蕉| 久久久久国内视频| 首页视频小说图片口味搜索| 黄色a级毛片大全视频| 日韩国内少妇激情av| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲精品色激情综合| 成年人黄色毛片网站| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产精品国产高清国产av| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 人妻久久中文字幕网| 看片在线看免费视频| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 俄罗斯特黄特色一大片| 一夜夜www| 国产麻豆成人av免费视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 老司机深夜福利视频在线观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 91麻豆精品激情在线观看国产| 久久精品国产亚洲av高清一级| 美女 人体艺术 gogo| 亚洲在线自拍视频| 欧美精品亚洲一区二区| 午夜影院日韩av| 久久精品综合一区二区三区| 欧美色视频一区免费| 天堂影院成人在线观看| 又黄又爽又免费观看的视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 免费高清视频大片| 欧美丝袜亚洲另类 | 午夜视频精品福利| 亚洲一码二码三码区别大吗| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 久久国产乱子伦精品免费另类| 老鸭窝网址在线观看| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 村上凉子中文字幕在线| 精品欧美国产一区二区三| 国产熟女xx| 丰满的人妻完整版| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 久久精品91蜜桃| 精品久久久久久久毛片微露脸| 国产成人啪精品午夜网站| 黄色 视频免费看| 黄色视频,在线免费观看| 精品久久久久久成人av| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 麻豆av在线久日| 真人做人爱边吃奶动态| 国产精品久久久人人做人人爽| 欧美日韩福利视频一区二区| av免费在线观看网站| 久久久久久国产a免费观看| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲电影在线观看av| 极品教师在线免费播放| 久久久久久久久免费视频了| 在线观看一区二区三区| 无人区码免费观看不卡| 国产精品亚洲一级av第二区| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 亚洲成人中文字幕在线播放| 可以在线观看的亚洲视频| 99国产精品一区二区三区| 欧美日本亚洲视频在线播放| a级毛片a级免费在线| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 2021天堂中文幕一二区在线观| 黄频高清免费视频| 99热这里只有精品一区 | 国产亚洲欧美98| 真人做人爱边吃奶动态| av天堂在线播放| 成在线人永久免费视频| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲午夜理论影院| 国产高清视频在线播放一区| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 国产真实乱freesex| 中文字幕久久专区| 悠悠久久av| videosex国产| 午夜老司机福利片| 午夜日韩欧美国产| 日本五十路高清| 亚洲九九香蕉| 老司机午夜福利在线观看视频| 国内精品一区二区在线观看| 一a级毛片在线观看| 欧美zozozo另类| 亚洲avbb在线观看| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 在线观看一区二区三区| 99在线视频只有这里精品首页| 超碰成人久久| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 亚洲精品国产一区二区精华液| 18禁观看日本| 两个人视频免费观看高清| 免费观看精品视频网站| www日本黄色视频网| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 又紧又爽又黄一区二区| 99国产精品一区二区蜜桃av| 9191精品国产免费久久| 国产精品九九99| svipshipincom国产片| 亚洲真实伦在线观看| 99riav亚洲国产免费| 国产免费男女视频| 亚洲无线在线观看| 夜夜躁狠狠躁天天躁| www日本黄色视频网| 一进一出抽搐动态| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 日本 欧美在线| 欧美日韩国产亚洲二区| 亚洲中文av在线| 制服人妻中文乱码| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 99精品久久久久人妻精品| 在线观看66精品国产| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 丰满的人妻完整版| 欧美中文综合在线视频| 五月伊人婷婷丁香| 少妇的丰满在线观看| 成人av一区二区三区在线看| 毛片女人毛片| 又紧又爽又黄一区二区| a级毛片在线看网站| 黑人操中国人逼视频| 99热只有精品国产| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 首页视频小说图片口味搜索| 人人妻人人澡欧美一区二区| 免费在线观看亚洲国产| 精品电影一区二区在线| 麻豆国产av国片精品| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产熟女xx| 国产高清视频在线观看网站| 级片在线观看| 久久久国产欧美日韩av| 一级片免费观看大全| 看片在线看免费视频| 婷婷六月久久综合丁香| 97碰自拍视频| av天堂在线播放| 一本大道久久a久久精品| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 日本在线视频免费播放| 身体一侧抽搐| 国产精品av久久久久免费| 色av中文字幕| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 女人被狂操c到高潮| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 午夜福利免费观看在线| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲成人免费电影在线观看| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 欧美成人免费av一区二区三区| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 成在线人永久免费视频| 国产久久久一区二区三区| 悠悠久久av| 一夜夜www| 久久久精品大字幕| 国产三级在线视频| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 成人三级做爰电影| 国产三级在线视频| 欧美黄色淫秽网站| 亚洲国产精品sss在线观看| 免费在线观看成人毛片| 亚洲精品在线观看二区| 久久这里只有精品19| 一进一出抽搐gif免费好疼| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲一区中文字幕在线| 色播亚洲综合网| 欧美性长视频在线观看| 国产高清有码在线观看视频 | 19禁男女啪啪无遮挡网站| 黄色a级毛片大全视频| 国产91精品成人一区二区三区| 色av中文字幕| avwww免费| 国产单亲对白刺激| 欧美av亚洲av综合av国产av| 免费在线观看成人毛片| 国产三级在线视频| 免费看日本二区| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产成人aa在线观看| 欧美日韩黄片免| 国产精华一区二区三区| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 午夜精品在线福利| 999精品在线视频| 禁无遮挡网站| 悠悠久久av| 国产熟女午夜一区二区三区| 精品电影一区二区在线| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产三级中文精品| 国内精品久久久久久久电影| 午夜免费成人在线视频| 亚洲成a人片在线一区二区| 99国产极品粉嫩在线观看| 免费在线观看黄色视频的| 国产高清视频在线播放一区| 国产麻豆成人av免费视频| 日韩免费av在线播放| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产三级中文精品| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 一级a爱片免费观看的视频| 国产成人欧美在线观看| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 免费看日本二区| 国产成人系列免费观看| 精品久久久久久成人av| 免费av毛片视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 国产精品久久电影中文字幕| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产av一区二区精品久久| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国内揄拍国产精品人妻在线| 欧美国产日韩亚洲一区| 日韩欧美三级三区| 日日夜夜操网爽| 五月玫瑰六月丁香| 看免费av毛片| 久久香蕉国产精品| 国产熟女xx| 欧美日韩乱码在线| 亚洲色图av天堂| 一级片免费观看大全| 亚洲色图av天堂| 国产精品久久视频播放| 日本黄色视频三级网站网址| 在线观看日韩欧美| 国产男靠女视频免费网站| 免费在线观看成人毛片| 成人三级黄色视频| 精品久久久久久成人av| 宅男免费午夜| 国内精品久久久久精免费| 十八禁网站免费在线| 高潮久久久久久久久久久不卡| 天堂√8在线中文| 国产精品野战在线观看| 精品久久久久久久毛片微露脸| 中文资源天堂在线| 99国产综合亚洲精品| 国产亚洲精品一区二区www| 丝袜美腿诱惑在线| 色老头精品视频在线观看| 亚洲国产精品成人综合色| 黄色成人免费大全| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲中文字幕日韩| 久久久国产成人免费| 在线观看www视频免费| 99在线视频只有这里精品首页| 两个人的视频大全免费| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 波多野结衣高清无吗| 99久久精品国产亚洲精品| 日韩欧美国产一区二区入口| 国产成人欧美在线观看| 在线观看一区二区三区| 正在播放国产对白刺激| 变态另类丝袜制服| 欧美日韩国产亚洲二区| 18禁美女被吸乳视频| www日本在线高清视频| 男女视频在线观看网站免费 | 国产成人av教育| 国产野战对白在线观看| 欧美极品一区二区三区四区| 欧美午夜高清在线| 脱女人内裤的视频| 中文字幕熟女人妻在线| 欧美乱码精品一区二区三区| av视频在线观看入口| 国语自产精品视频在线第100页| 久久精品91无色码中文字幕| 悠悠久久av| 久久久久性生活片| av欧美777| 级片在线观看| 久久久久久国产a免费观看| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 黄频高清免费视频| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 国产三级在线视频| 色尼玛亚洲综合影院| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲午夜理论影院| 啪啪无遮挡十八禁网站| 久久婷婷成人综合色麻豆| 99热6这里只有精品| 一级a爱片免费观看的视频| 在线播放国产精品三级| АⅤ资源中文在线天堂| 国产熟女xx| 色播亚洲综合网| 精品国产亚洲在线| 三级毛片av免费| 搡老岳熟女国产| 一本精品99久久精品77| 一本综合久久免费| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 我的老师免费观看完整版| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产成人精品久久二区二区免费| 色在线成人网| 操出白浆在线播放| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| cao死你这个sao货| 久久久久久久久中文| 亚洲av美国av| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 嫩草影视91久久| 欧美色视频一区免费| av福利片在线观看| 日韩欧美免费精品| 波多野结衣巨乳人妻| 99精品欧美一区二区三区四区| 亚洲国产中文字幕在线视频| 日韩欧美精品v在线| 三级毛片av免费| 我的老师免费观看完整版| www.www免费av| 日韩精品中文字幕看吧| 啪啪无遮挡十八禁网站| 国产99白浆流出| 精品一区二区三区四区五区乱码| av国产免费在线观看| 国产精品久久电影中文字幕| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲av成人一区二区三| 夜夜爽天天搞| 精品不卡国产一区二区三区| 99精品久久久久人妻精品| 在线视频色国产色| 天堂影院成人在线观看| 久久久久久大精品| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲五月婷婷丁香| 男女午夜视频在线观看| 国产精品永久免费网站| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲av五月六月丁香网| 亚洲人成电影免费在线| 在线观看一区二区三区| 成人欧美大片| 亚洲国产精品成人综合色| 国产99白浆流出| 成人国语在线视频| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 一级毛片女人18水好多| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产乱人伦免费视频| 青草久久国产| 亚洲一区二区三区色噜噜| 欧美日韩福利视频一区二区| 成人国产一区最新在线观看| av片东京热男人的天堂| 国产一区二区在线观看日韩 | 欧美日本亚洲视频在线播放| 精品久久蜜臀av无| 宅男免费午夜| 中文字幕av在线有码专区| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 一本大道久久a久久精品| 国产精品久久视频播放| 不卡一级毛片| 国内精品久久久久久久电影| 精华霜和精华液先用哪个| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 1024香蕉在线观看| 男男h啪啪无遮挡| 两个人视频免费观看高清| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 日韩有码中文字幕| 国产av在哪里看| 欧美3d第一页| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国产精品一区二区免费欧美| or卡值多少钱| 天天一区二区日本电影三级| 午夜精品在线福利| 国产男靠女视频免费网站| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 午夜免费观看网址| 中文字幕高清在线视频| cao死你这个sao货| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产日本99.免费观看| www日本黄色视频网| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 亚洲欧美日韩东京热| 午夜福利视频1000在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产精品久久电影中文字幕| 久久中文看片网| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 国产99白浆流出| 两人在一起打扑克的视频| 在线永久观看黄色视频| 麻豆一二三区av精品| 一夜夜www| 久久精品91蜜桃| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 高潮久久久久久久久久久不卡| 久久中文字幕一级| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 久久这里只有精品19| 午夜福利欧美成人| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 三级国产精品欧美在线观看 | 级片在线观看| 一个人免费在线观看的高清视频| 欧美精品亚洲一区二区| 精品熟女少妇八av免费久了| www日本黄色视频网| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 91av网站免费观看| 亚洲电影在线观看av| 两人在一起打扑克的视频| 久久天堂一区二区三区四区| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| www.www免费av| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产片内射在线| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 手机成人av网站| 久久久国产成人免费| 午夜a级毛片| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 69av精品久久久久久| 国产一区二区三区视频了| 欧美中文日本在线观看视频| 精品乱码久久久久久99久播| 日韩国内少妇激情av| 午夜精品在线福利| 美女大奶头视频| 国产精品一区二区免费欧美| 免费观看人在逋| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产精品一及| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 成人三级黄色视频| 一区二区三区国产精品乱码| 国产成人影院久久av| 美女午夜性视频免费|