半邊旗二萜化合物5F對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡和自噬的影響

羅夢(mèng)花，陳佩文，陳志紅，吳民華，龔先玲*（. 廣東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 東莞 53808；. 廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 東莞 53808）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見的消化道惡性腫瘤之一?；熓悄[瘤的治療方式之一，雖然在臨床上出現(xiàn)了許多抗腫瘤的化療藥物，并且配合放療可以使患者的病情有所好轉(zhuǎn)，延長(zhǎng)了壽命，但這些化療藥物常常會(huì)導(dǎo)致人體出現(xiàn)各種不良反應(yīng)和毒副作用，從而使腫瘤患者在治療過程中產(chǎn)生其他疾病或損傷。中草藥具有使用歷史悠久，毒副作用相對(duì)較小，效果較好等優(yōu)勢(shì)，因此從中草藥中開發(fā)新的防治腫瘤的天然藥物是研究方向之一。5F是嶺南草藥半邊旗中的一種二萜類成分，全稱為11β-hydroxy-15-oxo-16-ent-kaur-16-en-19-oic acid或 ent-11α-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic-acid[1]，具有抗炎、抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖等作用[2-5]。但關(guān)于5F對(duì)結(jié)直腸癌的影響報(bào)道很少。本研究探討二萜化合物5F對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡及自噬的影響，并初步探究其抗腫瘤作用的機(jī)制。

1 材料

1.1 試藥

5F（HPLC純度≥98%；廣東醫(yī)科大學(xué)天然藥物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制）[4]。二甲基亞砜（DMSO）、MTT（法國MP公司）；Hoechst 33342（Beyotime公司）；z-VAD-fmk（R&D systems公司）；吖啶橙（AO）、氯喹（CQ）（美國Sigma公司）。人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480、HCT116（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）。RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清（美國Gibco公司）；青-鏈霉素混合液（北京Solarbio科技有限公司）；蛋白定量試劑盒（美國Thermo公司）；Anti-Pro-Caspase-3、Cleaved Caspase-3、PARP、Bax、Bcl-2、LC3A/B抗體（美國Cell Signalling Technology公司）；β-actin（北京中杉金橋公司）；辣根過氧化物（HRP）標(biāo)記山羊抗兔、HRP標(biāo)記山羊抗鼠二抗（武漢Boster 公司）；ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國Millipore公司）。

1.2 儀器

Nikon Ti-S型倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司），Thermo Scientific Multiskan Sky全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國Thermo公司），化學(xué)發(fā)光成像儀MiniChemi Ⅱ（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480、HCT116生長(zhǎng)在含1% 青-鏈霉素、10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈單層貼壁狀態(tài)生長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。每2日細(xì)胞傳代一次。

2.2 MTT法測(cè)定5F對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)活力的影響

分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480、HCT116細(xì)胞，棄上清液，PBS漂洗2次，用0.25%的胰酶消化，完全培養(yǎng)液中和胰酶，離心，棄上清液，將細(xì)胞密度調(diào)整成8×104個(gè)·mL-1。并以每孔100 μL接種在96孔板中，培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后，每孔加100 μL 5F溶液，使藥物的終濃度分別為0（空白組）、6.25、12.5、25、50、100 μmol·L-1，每個(gè)處理設(shè)5個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)24、48 h后每孔加5 g·L-1MTT 20 μL，反應(yīng) 4 h，吸出上清液，加200 μL DMSO，振蕩溶解甲瓚結(jié)晶，用酶標(biāo)儀在490 nm 處測(cè)OD值。

2.3 Hoechst 33342染色

將細(xì)胞密度為8×104個(gè)·mL-1的SW480、HCT116細(xì)胞分別接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜待細(xì)胞貼壁后，加入0（空白組）、25、50、100 μmol·L-1的5F溶液，培養(yǎng)48 h，吸出舊培養(yǎng)液，PBS洗2次，加Hoechst 33342后于37℃孵育15 min，PBS漂洗2次，然后用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.4 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

5F分別處理SW480、HCT116細(xì)胞相應(yīng)時(shí)間后，棄去舊液，收集細(xì)胞，加RIPA裂解液裂解，并于4℃、12 000 r·min-1離心25 min，取上清液，得總蛋白。采用BCA法檢測(cè)各組總蛋白含量。每組蛋白分別加一定量的上樣緩沖液并混合均勻，在沸水浴中變性5 min。各組取等量蛋白經(jīng)SDSPAGE電泳，分離結(jié)束后，用轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，然后將PVDF膜放入5% 脫脂奶粉中封閉1 h。加一抗Anti-Pro-Caspase-3、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP、Bax、Bcl-2、LC3A/B（1∶1000），4℃孵育過夜。用稀釋10 000倍的HRP酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育 60 min，吸出二抗，TBST洗滌3次，每次5 min。在避光條件下，混合化學(xué)發(fā)光液A和B，再在膜上滴加混合均勻的化學(xué)發(fā)光試劑，然后將膜置于化學(xué)發(fā)光成像儀的暗室中曝光，拍照并分析相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。

2.5 AO染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)酸性細(xì)胞器

將細(xì)胞密度為8×104個(gè)·mL-1的SW480、HCT116細(xì)胞分別接種于12孔板中，培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的5F溶液，培養(yǎng)24 h，吸出舊液，PBS洗1遍，4%多聚甲醛室溫固定15 min，每孔加入1 μg·mL-1的 AO工作液，室溫避光孵育15 min，去除AO工作液，PBS 洗2次，于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析；兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 二萜化合物5F對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

圖1為MTT 法檢測(cè)不同濃度5F對(duì)SW480、HCT116細(xì)胞活力的影響。5F分別作用結(jié)直腸癌細(xì)胞24 h、48 h后，隨著藥物濃度增加，細(xì)胞存活率均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。同一濃度下，隨著5F作用時(shí)間增加，細(xì)胞活力也降低。

圖1 5F對(duì)人結(jié)直腸癌SW480、HCT116細(xì)胞活力的影響Fig 1 Effect of 5F on cell viability of SW480 and HCT116 cells

3.2 倒置熒光顯微鏡觀察5F對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞形態(tài)的影響

圖2為倒置熒光顯微鏡觀察5F對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480、HCT116形態(tài)的影響。倒置顯微鏡下，空白組細(xì)胞貼壁正常生長(zhǎng)；不同濃度5F分別處理結(jié)直腸癌細(xì)胞48 h，隨著5F濃度增加，SW480和HCT116細(xì)胞的形態(tài)變圓，密度變小。Hoechst 33342染色，空白組細(xì)胞的細(xì)胞核呈正常均勻的藍(lán)色熒光；5F作用SW480和HCT116細(xì)胞后出現(xiàn)細(xì)胞核固縮現(xiàn)象，細(xì)胞核呈現(xiàn)明顯的亮藍(lán)色熒光，且隨著5F濃度的增加，呈現(xiàn)明顯亮藍(lán)色熒光的細(xì)胞核數(shù)目也增加。

圖2 5F對(duì)SW480、HCT116細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響（×200）Fig 2 Effect of 5F on morphology of SW480 and HCT116 cells（×200）

3.3 5F處理結(jié)直腸癌細(xì)胞后凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

Hoechst 33342染色顯示5F處理結(jié)直腸癌細(xì)胞后表現(xiàn)出凋亡的特征，細(xì)胞死亡是否由凋亡引起，還需進(jìn)一步證明。因此本研究用 Western blot檢測(cè)了與凋亡相關(guān)的蛋白表達(dá)，結(jié)果見圖3。不同濃度的5F分別處理SW480、HCT116細(xì)胞24 h，隨著5F 濃度的增大，Pro-Caspase-3蛋白的表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì)，而Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP蛋白的表達(dá)逐漸增加；與空白組比較，Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP 表達(dá)顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）。說明5F有誘導(dǎo)SW480、HCT116細(xì)胞凋亡的作用。

圖3 5F對(duì)SW480、HCT116細(xì)胞相關(guān)凋亡蛋白的影響Fig 3 Effect of 5F on apoptosis-related proteins in SW480 and HCT116 cells

3.4 5F誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡與Caspase的相關(guān)性

為了進(jìn)一步明確5F 誘導(dǎo)的凋亡是否與Caspase依賴的機(jī)制有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)使用了Caspase廣譜抑制劑z-VAD-fmk。分別將SW480、HCT116細(xì)胞在加或不加z-VAD-fmk（50 μmol·L-1）培養(yǎng)1 h后，再加或者不加5F（100 μmol·L-1）作用24 h。如圖4所示，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與5F單獨(dú)處理的結(jié)直腸癌細(xì)胞Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP蛋白表達(dá)明顯相比；5F和z-VAD-fmk共同作用的結(jié)直腸癌細(xì)胞Cleaved Caspase-3（P＜0.01）、Cleaved PARP（P＜0.01）蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，表明z-VAD-fmk可阻斷caspase激活。說明5F誘導(dǎo)的凋亡與Caspase 依賴的機(jī)制有關(guān)。

圖4 5F聯(lián)合z-VAD-fmk處理對(duì)SW480、HCT116細(xì)胞Caspase-3及PARP蛋白的影響Fig 4 Effect of 5F combined with z-VAD-fmk on Caspase-3 and PARP proteins in SW480 and HCT116 cells

3.5 5F誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡與Bax 和Bcl-2的相關(guān)性

如圖5所示，不同濃度的5F分別處理SW480、HCT116細(xì)胞24 h，隨著5F濃度的增大，Bax蛋白表達(dá)升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平下降。表明5F可通過改變Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

圖5 5F對(duì)SW480、HCT116細(xì)胞Bax和Bcl-2蛋白的影響Fig 5 Effect of 5F on the expression of Bax and Bcl-2 proteins in SW480 and HCT116

3.6 AO染色觀察5F對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞酸性小泡細(xì)胞器的影響

AO染色可使細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)染成綠色，酸性囊泡被染成紅色[6]。圖6所示，AO染色法觀察不同濃度的5F對(duì)SW480、HCT116細(xì)胞酸性小泡細(xì)胞器的影響。結(jié)果顯示，25、50 μmol·L-1的5F分別處理結(jié)直腸癌細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)被AO染成紅色的酸性小泡有增加趨勢(shì)；100 μmol·L-1的5F處理結(jié)直腸癌細(xì)胞24 h后，代表酸性小泡的紅色熒光反而減少。

圖6 AO染色觀察5F對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞酸性小泡細(xì)胞器的影響（×200）Fig 6 Effect of 5F on acidic vesicular organelles in CRC cells by acridine orange staining（×200）

3.7 5F對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞LC3蛋白表達(dá)的影響

LC3在自噬的發(fā)生中扮演著重要的角色。LC3-Ⅱ是自噬體形成的特異性蛋白標(biāo)志物，LC3-Ⅱ的量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率可能與細(xì)胞內(nèi)自噬囊泡的量成正相關(guān)。圖7所示，Western blot顯示，SW480、HCT116細(xì)胞經(jīng)5F處理 24 h后，在0～50 μmol·L-1內(nèi)，隨著5F 濃度的增加，LC3-Ⅱ的蛋白條帶逐漸變深；而100 μmol·L-1的5F處理組，LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)明顯減少。提示一定濃度的5F有誘導(dǎo)SW480、HCT116細(xì)胞自噬的作用，而100 μmol·L-1的5F處理結(jié)直腸癌細(xì)胞主要引起細(xì)胞凋亡。

圖7 5F對(duì)SW480、HCT116細(xì)胞LC3蛋白的影響Fig 7 Effect of 5F on LC3 proteins in SW480 and HCT116 cells

3.8 5F處理結(jié)直腸癌細(xì)胞自噬與凋亡的關(guān)系

為探討5F誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌細(xì)胞自噬與凋亡相互關(guān)系以及對(duì)細(xì)胞存活率的影響，本實(shí)驗(yàn)用50 μmol·L-1的5F聯(lián)合10 μmol·L-1的氯喹處理結(jié)直腸癌細(xì)胞，檢測(cè)其對(duì)自噬標(biāo)志蛋白LC3、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)和細(xì)胞存活情況的影響。結(jié)果如圖8所示，與5F組相比，5F聯(lián)合氯喹處理組LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)增加，Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP表達(dá)明顯減少（P＜0.01）。說明自噬受到抑制，凋亡也下降。圖9所示，與50 μmol·L-1的5F組比，同濃度的5F聯(lián)合氯喹處理結(jié)直腸癌細(xì)胞后細(xì)胞存活率增加（P＜0.01）；與100 μmol·L-1的5F組比，同濃度的5F聯(lián)合氯喹處理結(jié)直腸癌細(xì)胞后細(xì)胞存活率幾乎不變。

圖8 5F與氯喹聯(lián)用對(duì)SW480、HCT116細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白LC3以及凋亡相關(guān)蛋白的影響Fig 8 Effect of 5F combined with chloroquine on LC-3 and apoptosisrelated proteins in SW480 and HCT116 cells

圖9 5F聯(lián)合氯喹對(duì)SW480、HCT116細(xì)胞存活率影響（n＝5）Fig 9 Effect of 5F combined with chloroquine on cell viability of SW480 and HCT116 cells（n＝5）

4 討論

細(xì)胞凋亡是機(jī)體細(xì)胞在發(fā)育過程中或一定條件下，受內(nèi)在基因調(diào)控的細(xì)胞自主有序死亡，其在生理及病理性死亡、機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育以及細(xì)胞分化等方面發(fā)揮重要作用[7]。腫瘤細(xì)胞過度增殖，凋亡通路受阻可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。很多中藥有效成分通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮抗腫瘤活性。本研究發(fā)現(xiàn)半邊旗二萜化合物5F能顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，濃度越高抑制作用越強(qiáng)；Hoechst 33342染色表明5F處理結(jié)直腸癌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡特征。依賴胱天蛋白酶（Caspase）的信號(hào)傳導(dǎo)途徑是細(xì)胞凋亡的途徑之一[7-9]，z-VADfmk是應(yīng)用非常廣泛的Caspase廣譜性蛋白抑制劑[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)z-VAD-fmk可減弱5F誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡，說明5F誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡是Caspase依賴的凋亡。Caspase 家族中最重要的凋亡執(zhí)行者Caspase-3更被稱為“死亡執(zhí)行蛋白酶”，是多種凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分，是死亡受體通路和線粒體通路執(zhí)行細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行子[12]。PARP[poly（ADP-ribose）polymerase]是一種蛋白翻譯后修飾酶，在細(xì)胞修復(fù)與凋亡的調(diào)控中起重要作用，是 Caspase-3的底物之一，可被活化的 Caspase-3 切割分解而失活，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[13]。本課題的研究表明5F可誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞中Pro-Caspase-3 轉(zhuǎn)化為Cleaved Caspase-3 蛋白，效應(yīng)性的 Caspase可裂解下游的PARP，出現(xiàn)Cleaved PARP，而PARP的降解失活使染色質(zhì)DNA遭到破壞，使結(jié)直腸癌細(xì)胞失去保持穩(wěn)態(tài)的能力從而發(fā)生凋亡。Bcl-2家族蛋白對(duì)細(xì)胞的凋亡起調(diào)節(jié)作用，Bcl-2是抗凋亡的負(fù)調(diào)節(jié)因子之一，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)能保護(hù)細(xì)胞免于凋亡；Bax是促凋亡的正調(diào)節(jié)因子之一，能促進(jìn)細(xì)胞凋亡；Bax/Bcl-2 比值可作為判斷細(xì)胞是否凋亡的參考[14-16]。5F可通過上調(diào)Bax，下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

自噬和凋亡是細(xì)胞命運(yùn)調(diào)節(jié)的兩種基本病理生理機(jī)制[17]。自噬和凋亡之間的相互作用非常復(fù)雜，然而，這些相互作用可分為三類：① 自噬與凋亡，兩者均以同步方式誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，或在促進(jìn)細(xì)胞死亡中起主導(dǎo)作用（協(xié)同作用）；② 自噬通過誘導(dǎo)凋亡促進(jìn)細(xì)胞死亡；③ 自噬抑制凋亡誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[18]。姜黃素類似物EF24對(duì)A549細(xì)胞處理中自噬促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而EF24濃度為16 μmol·L-1時(shí)，A549細(xì)胞以凋亡為主[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，AO染色表明5F處理結(jié)直腸癌細(xì)胞出現(xiàn)自噬特征，但100 μmol·L-1的5F誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬明顯減少。與此結(jié)果一致，低濃度5F處理結(jié)直腸癌細(xì)胞時(shí)，自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)增加，而100 μmol·L-1的5F處理的結(jié)直腸癌細(xì)胞LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)明顯降低。5F與自噬抑制劑聯(lián)用，削弱了低濃度5F對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的抑制作用，表明5F通過自噬從而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。但當(dāng)100 μmol·L-1的5F與自噬抑制劑聯(lián)用時(shí)，并沒改變結(jié)直腸癌細(xì)胞的存活率，表明100 μmol·L-1的5F處理結(jié)直腸癌細(xì)胞主要引起細(xì)胞凋亡。

綜上所述，5F可通過增加Bax蛋白，降低Bcl-2蛋白，影響下游成員Cleaved Caspase-3 以及Cleaved PARP等蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡；低濃度的5F還可誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生自噬，自噬對(duì)凋亡起促進(jìn)作用；高濃度的5F主要誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡。本研究為5F防治結(jié)直腸癌奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為將來進(jìn)一步利用自噬促進(jìn)劑從而達(dá)到細(xì)胞死亡的目的以及選擇最優(yōu)的藥物濃度防治結(jié)直腸癌提供研究方向。