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    蘆薈大黃素通過激活Caspase-3/GSDME焦亡通路發(fā)揮抗膠質(zhì)瘤作用

    2023-04-01 05:28:46方興剛汪嫚陳卓張思思羅杰湖北中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院武漢40065胚胎干細(xì)胞研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室湖北醫(yī)藥學(xué)附屬太和醫(yī)院湖北十堰44000湖北醫(yī)藥學(xué)院藥護(hù)學(xué)院湖北十堰44000
    中南藥學(xué) 2023年2期
    關(guān)鍵詞:焦亡膠質(zhì)瘤孵育

    方興剛,汪嫚,陳卓,張思思,羅杰*(. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院,武漢 40065;. 胚胎干細(xì)胞研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北醫(yī)藥學(xué)附屬太和醫(yī)院,湖北 十堰 44000;. 湖北醫(yī)藥學(xué)院藥護(hù)學(xué)院,湖北 十堰 44000)

    神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤,簡稱膠質(zhì)瘤,是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤,約占全部顱內(nèi)惡性腫瘤的 80%[1]。其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma,GBM)為第Ⅳ級膠質(zhì)瘤,約占膠質(zhì)瘤總數(shù)的54%,具有高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高病死率和低治愈率的特點(diǎn)[1]。GBM的浸潤性生長方式?jīng)Q定其惡性生物學(xué)行為,手術(shù)難以完全切除。由于血腦屏障(bloodbrain barrier,BBB)以及腦-腫瘤細(xì)胞屏障(brain tumor cell barrier,BTB)的存在以及化療抗性,化療的療效也不盡理想[2-5],且因GBM免疫抑制的微環(huán)境,目前蓬勃發(fā)展的PD-1等免疫檢查點(diǎn)抑制劑效果欠佳[6-8]。因此,從治療的角度來看,需要其他治療途徑和治療靶點(diǎn)來改善預(yù)后。

    焦亡是由GSDM家族(GSDMs)介導(dǎo)的具有免疫原性的程序性的細(xì)胞死亡,在活化的Caspase家族及顆粒酶B的作用下,GSDMs被活化,釋放具有細(xì)胞膜成孔功能的N端結(jié)構(gòu)域,誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓失衡,導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、死亡[9]。由于GSDME途徑的焦亡會誘導(dǎo)乳酸脫氫酶(LDH)和HMGB1細(xì)胞外釋放而和適應(yīng)性免疫相聯(lián)系,在抗腫瘤治療中日益受到重視。GSDME途徑的焦亡依賴于GSDME在組織中的表達(dá)水平,TCGA數(shù)據(jù)庫(http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html)顯示,GBM特異性高表達(dá)GSDME,故我們認(rèn)為GSDME是抗GBM治療的良好靶點(diǎn)。而激活GBM高表達(dá)的GSDME,促進(jìn)GSDME途徑的焦亡進(jìn)而激活適應(yīng)性免疫,可能為GBM治療提供新的策略。

    蘆薈大黃素(aloe-emodin,AE)是一種蒽醌衍生物,是從大黃、虎杖、何首烏、蘆薈、決明子等傳統(tǒng)中藥中提取的有效成分,具有較好的血腦屏障通透性。近年來,AE已被證明具有廣泛的藥理作用,如抗病毒、抗菌、抗過敏、抗骨質(zhì)疏松、抗糖尿病、免疫抑制、神經(jīng)保護(hù)和肝保護(hù)活性以及抗腫瘤作用[10]。既往研究顯示AE通過多種機(jī)制作用于腫瘤細(xì)胞,如誘導(dǎo)DNA損傷[11],阻滯細(xì)胞周期[12-14],抑制腫瘤細(xì)胞遷徙[15]。AE可以通過誘導(dǎo)線粒體功能障礙及激活Caspase-9/3/GSDME軸誘導(dǎo)Hela細(xì)胞焦亡,顯示AE具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞焦亡的潛力[16]。本研究以AE作為候選藥物,應(yīng)用于GSDME特異性高表達(dá)的GBM細(xì)胞(U87MG、GL261),以明確AE對GBM細(xì)胞的抑制作用及焦亡誘導(dǎo)作用。目前,AE通過激活CASP3/GSDME通路促進(jìn)GBM細(xì)胞焦亡發(fā)揮抗膠質(zhì)瘤作用的研究尚未見任何報(bào)道。本研究可能為臨床膠質(zhì)瘤的治療提供一種新的選擇。

    1 材料和方法

    1.1 細(xì)胞株與試藥

    U87MG、GL261細(xì)胞均來源于本實(shí)驗(yàn)室(胚胎干細(xì)胞湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,凍存細(xì)胞);蘆薈大黃素(規(guī)格:100 mg,純度:98%,成都埃法生物科技有限公司,結(jié)構(gòu)式見圖1);重組Anti-Cleaved Caspase-3抗體、重組Anti-DFNA5/GSDME抗體[EPR19859]-N-terminal、重組Anti-cleavedN-terminal GSDMD抗體(Abcam公司);ABScriptⅡReverse Transcriptase(ABclonal);蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合液、高敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(新賽美);MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒、2×PCR Master Mix、SDSPAGE凝膠配制試劑盒、LDH釋放檢測試劑盒、β-Tubulin Rabbit Monoclonal Antibody、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、順鉑(Cisplatin)、NAC、Caspase抑制劑Z-VAD-FMK(碧云天);PageRuler 預(yù)染蛋白Marker(賽默飛);DCFHDA 活性氧(ROS)熒光探針細(xì)胞檢測試劑盒(索萊寶);Taq-HS Probe qPCR Premix、線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)(蘭博利德)。

    圖1 蘆薈大黃素分子結(jié)構(gòu)式Fig 1 Molecular formula of aloe-emodin

    1.2 儀器

    生物安全柜、CO2恒溫培養(yǎng)箱、多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher 公司);倒置顯微鏡(德國Leica 公司);超速低溫離心機(jī)(德國Eppendorf公司);熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司);流式細(xì)胞分析儀(美國Beckman公司)。

    2 方法和結(jié)果

    2.1 AE對GBM細(xì)胞活力的影響

    選擇GBM細(xì)胞系U87MG(人)、GL261(鼠)作為實(shí)驗(yàn)對象,以濃度梯度的AE作用于膠質(zhì)瘤細(xì)胞系48 h,MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞存活率:復(fù)蘇U87MG、GL261細(xì)胞,傳代至96孔板中,預(yù)設(shè)每個梯度濃度5孔重復(fù),每孔4000個/100 μL,12 h后給予包含梯度濃度(6.25、12.5、25、50、75、100 μmol·L-1)AE的培養(yǎng)基共培養(yǎng),其中0.2%DMSO作為對照組(Con),48 h后每孔加入10 μL MTT 液(5 mg·mL-1)避光孵育 4 h,離心,棄上清液,每孔加入100 μL Formazan(甲瓚)溶解液,適當(dāng)混勻,在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)再繼續(xù)孵育3 h。光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)甲瓚全部溶解。用酶標(biāo)儀于 490 nm波長處測量各孔的光密度(OD)并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率,使用Graphpad軟件統(tǒng)計(jì)細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示:AE以濃度依賴的方式抑制U87MG(見圖 2A)及GL261(見圖2B)的活性,其對U87MG細(xì)胞的半抑制濃度(IC50)為24.76 μmol·L-1,對GL261細(xì)胞的IC50為43.38μmol·L-1,提示AE對膠質(zhì)瘤細(xì)胞有明確的抑制作用。

    圖2 AE對U87MG細(xì)胞(A)和GL261細(xì)胞(B)活性的影響( ±s,n=5)Fig 2 Effect of AE on the viability of U87MG cell(A)and GL261 cell(B)detected( ±s,n=5)

    2.2 AE對GBM細(xì)胞焦亡的影響

    為明確AE對GBM細(xì)胞的作用方式,對AE處理的U87MG、GL261細(xì)胞在倒置顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)動態(tài)觀察:U87MG、GL261細(xì)胞鋪至24孔板中,每孔4000個/100 μL,細(xì)胞貼壁后給予50μmol·L-1的AE共孵育,分別于2、6、12、24、36、48、60 h時間點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞拍照,記錄細(xì)胞形態(tài)。60 h后AE處理的U87MG及GL261(見圖 3)細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞腫脹、吐泡等焦亡特異性細(xì)胞外觀(藍(lán)色箭頭標(biāo)識),提示AE可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞焦亡。

    圖3 AE處理的U87MG和GL261細(xì)胞外觀(藍(lán)色箭頭指向焦亡細(xì)胞,比例尺:×200)Fig 3 Appearance of U87MG and GL261 cells treat with AE(The blue arrows pointed to pyroptosis cells,scale bar:×200)

    焦亡的另一特征是細(xì)胞膜成孔,細(xì)胞內(nèi)容物如LDH從細(xì)胞內(nèi)釋放,為此我們開展了LDH釋放實(shí)驗(yàn)。U87MG細(xì)胞鋪至96孔板中,每孔4000 個/100μL,待其密度生長至90%左右,加入梯度濃度AE共孵育24 h,收集各孔上清至新的96孔板中,采用通過乳酸脫氫酶釋放檢測試劑盒(LDH Release Assay Kit,碧云天)對LDH含量進(jìn)行檢測,采用SpectraMax 190酶標(biāo)儀檢測上清液在490 nm的吸光度進(jìn)而計(jì)算LDH釋放水平。結(jié)果顯示,LDH以濃度依賴的方式實(shí)現(xiàn)細(xì)胞外釋放(見圖 4)。結(jié)果顯示AE對膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有明確的抑制作用,這種抑制作用是通過介導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞焦亡實(shí)現(xiàn)的。

    圖4 AE對U87MG細(xì)胞中LDH釋放的影響( ±s,n=3)Fig 4 Effect of AE on the LDH release of U87MG cells( ±s,n=3)

    2.3 AE對CASP3/GSDME焦亡通路活化的影響

    焦亡的發(fā)生主要是通過經(jīng)典的CASP1/GSDMD通路及非經(jīng)典的CASP3/GSDME通路,為了明確AE通過哪種通路介導(dǎo)GBM細(xì)胞焦亡,我們開展了Western blot實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)了這兩條通路的關(guān)鍵蛋白GSDME-N和GSDMD-N:U87MG細(xì)胞在6孔板中與濃度梯度AE(按實(shí)驗(yàn)需求合用或單用caspase抑制劑Z-VAD-FMK,CASP3途徑焦亡陽性對照藥物順鉑,抗氧化劑NAC)共孵育48 h,以包含1%PMSF的RIPA裂解液裂解后提取蛋白,BCA法分析蛋白濃度,通過SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上,以5%脫脂奶粉封閉2 h,裁膜后分別給予CASP3、GSDMD-N、GSDME-N、β-tubulin一抗4℃孵育過夜,TBST洗膜3次,每次10 min,加入對應(yīng)二抗,室溫孵育1 h,TBST洗膜3次,每次10 min,ECL顯影液顯影,運(yùn)用Image J軟件對條帶進(jìn)行灰度分析。結(jié)果顯示:AE處理的U87MG細(xì)胞出現(xiàn)了CASP3、GSDME蛋白活化(C-CASP3、GSDME-N)表達(dá)水平上升,而GSDMD蛋白未受影響(未見GSDMD-N表達(dá))(見圖5A),這提示AE活化了CASP3/GSDME焦亡通路而非GSDMD通路。為進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果,我們給予CASP3/GSDME焦亡通路陽性對照藥順鉑和caspase阻斷劑(Z-VAD-FMK)進(jìn)行處理,結(jié)果顯示,AE處理組出現(xiàn)和順鉑組類似的GSDME-N的表達(dá),而AE處理組(100 μmol·L-1AE)給予Z-VAD-FMK共處理,GSDME-N的表達(dá)明顯減少(見圖5B),這進(jìn)一步證明AE可以引起焦亡關(guān)鍵蛋白GSDME的活化,且這種活化依賴于caspase的表達(dá)。

    圖5 AE激活U87MG細(xì)胞CASP3/GSDME焦亡通路( ±s,n=3)Fig 5 AE activate CASP3/GSDME pyroptosis pathway on U87MG cells( ±s,n=3)

    蛋白免疫熒光是檢測蛋白表達(dá)水平的另一種手段,為了進(jìn)一步證實(shí)AE對GSDME活化的影響,我們開展了GSDME-N免疫熒光實(shí)驗(yàn):細(xì)胞鋪至12孔板中,梯度濃度AE共孵育48 h,去上清,PBS清洗后加入免疫熒光固定液,室溫固定30 min,去固定液,PBS清洗三次,每次5 min,加入免疫熒光封閉液,室溫封閉30 min,清洗三次。加入1∶200 GSDME-N一抗,4℃搖床過夜,回收一抗,清洗三次;加入FIFC標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)二抗,室溫避光孵育2 h,回收二抗,清洗3遍;加入DAPI染色液,室溫孵育10 min,去染色液,PBS清洗三次,于熒光顯微鏡下檢測GSDME-N的表達(dá)。結(jié)果顯示,AE增強(qiáng)了GSDME-N在U87MG細(xì)胞的熒光強(qiáng)度(見圖6),這進(jìn)一步證明AE能增強(qiáng)GSDME蛋白的活化。

    圖6 AE對U87MG細(xì)胞GSDME-N蛋白表達(dá)的影響(比例尺:×200)Fig 6 Effect of AE on the expression of GSDME-N in U87MG cells(scale bar:×200)

    2.4 AE對GSDME在膠質(zhì)瘤細(xì)胞mRNA水平的影響

    為明確AE對GSDME mRNA表達(dá)水平的影響,我們進(jìn)行了qPCR實(shí)驗(yàn):梯度濃度AE處理U87MG、GL261 細(xì)胞48 h,Trizol提取總RNA,測定總RNA濃度及純度,使用ABScript Ⅱ Reverse Transcriptase(RK21400)試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,使用Taq-HS Probe qPCR Premix預(yù)混液進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)。條件如下:95℃:2 min,94℃:20 s,58℃:20 s,72℃:20 s,40個循環(huán),最后在72℃下延伸4 min。以β-actin作為內(nèi)參計(jì)算GSDME的相對表達(dá)水平,實(shí)驗(yàn)相關(guān)引物列表如表1,結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

    表1 引物序列Tab 1 Primers used in the experiment

    結(jié)果顯示,無論是在U87MG細(xì)胞,還是在GL261細(xì)胞中,AE均可促進(jìn)GSDME在mRNA水平的表達(dá),在U87MG細(xì)胞中其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖7)。

    圖7 AE對U87MG(A)、GL261(B)細(xì)胞GSDME在mRNA水平的表達(dá)影響( ±s,n=3)Fig 7 Effect of AE on the expression of GSDME in U87MG(A)and GL261(B)cells at the mRNA level(x±s,n=3)

    2.5 AE對膠質(zhì)瘤細(xì)胞線粒體功能及ROS的影響

    有研究顯示線粒體功能障礙及ROS和CASP3/GSDME 途徑的焦亡密切相關(guān)[17-18],為了明確AE介導(dǎo)GBM過程中是否發(fā)生線粒體功能障礙,我們對AE處理的U87細(xì)胞線粒體膜電位和ROS水平進(jìn)行檢測。U87細(xì)胞鋪入6孔板中,細(xì)胞生長至70%~80%分別給予含0.2%DMSO,50 μmol·L-1和100 μmol·L-1AE 的培養(yǎng)液共孵育24 h,除去培養(yǎng)液,PBS洗滌細(xì)胞一次,加入1 mL含血清細(xì)胞培養(yǎng)液。再加入1 mL JC-1 染色工作液,充分混勻,細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20 min。在孵育期間,按照每 1 mL JC-1 染色緩沖液(5×)加入4 mL蒸餾水的比例,配制適量的JC-1染色緩沖液(1×),并放置于冰浴。37℃孵育結(jié)束后,吸除上清,用JC-1染色緩沖液(1×)洗滌2次。再加入2 mL含血清細(xì)胞培養(yǎng)液,用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示(見圖8):未經(jīng)AE處理的U87MG細(xì)胞線粒體膜電位處于正常高電位(紅色熒光標(biāo)識),而經(jīng)AE處理的線粒體膜電位降低(綠色熒光標(biāo)識)。熒光顯微鏡活性氧檢測顯示(見圖9A):經(jīng)AE處理后U87MG細(xì)胞ROS熒光明顯增強(qiáng);應(yīng)用DCFH-DA 活性氧ROS熒光探針對細(xì)胞ROS標(biāo)記,通過熒光顯微鏡及流式細(xì)胞術(shù)檢測ROS水平。U87細(xì)胞鋪入6孔板中,細(xì)胞生長至70%分別給予含0.2%DMSO,50 μmol·L-1和100 μmol·L-1的培養(yǎng)基共孵育24 h,除去培養(yǎng)基,加入DCFH-DA濃度為5 μmol·L-1的培養(yǎng)基1 mL,37℃培養(yǎng)箱孵育30 min,除去含探針培養(yǎng)基,PBS清洗三次,分別進(jìn)行熒光拍照及流式細(xì)胞分析。結(jié)果顯示(見圖9B),DCFH-DA標(biāo)識的陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多,這說明AE可提高U87細(xì)胞ROS水平。為進(jìn)一步明確ROS的表達(dá)是否會影響GSDME的活化,AE處理的U87MG細(xì)胞與抗氧化劑NAC共孵育,顯示NAC可以顯著減輕AE(100μmol·L-1)所誘導(dǎo)的GSDME的活化(P<0.0001)(見圖9C),這提示AE誘導(dǎo)ROS介導(dǎo)了GSDME的活化及細(xì)胞焦亡。

    圖8 線粒體膜電位檢測(比例尺:×200)Fig 8 Detection of mitochondrial membrane potential(scale bar:×200)

    圖9 AE誘導(dǎo)U87MG細(xì)胞ROS產(chǎn)生及抗氧化劑NAC對GSDME活化的影響Fig 9 AE induced ROS production in GBM cells and the effect of antioxidants NAC on GSDME activation

    2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    所有定量數(shù)據(jù)均以算術(shù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。采用雙尾獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組平均值,使用單因素方差分析與Bonferroni的事后分析比較兩組以上的平均值。其余數(shù)據(jù)均采用非參數(shù)單向Kruskal-Wallis檢驗(yàn),再進(jìn)行Dunnett多重比較。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 討論

    膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見、惡性程度最高、預(yù)后最差的惡性腫瘤[2]。Westphal等[19]認(rèn)為,癌癥相關(guān)凋亡誘導(dǎo)和執(zhí)行缺陷是治療失敗的重要原因[20-21]。AE作為一種從天然中草藥中提取的單體化合物,可通過多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用,而AE應(yīng)用于抗GBM的治療尚不多見。我們的研究首次發(fā)現(xiàn)AE通過激活CASP3/GSDME通路誘導(dǎo)GBM焦亡發(fā)揮抗膠質(zhì)瘤作用,可能為膠質(zhì)瘤的治療提供新的策略。

    焦亡是新發(fā)現(xiàn)的程序性細(xì)胞死亡方式,而GSDME途徑的焦亡被認(rèn)為具有良好的抗腫瘤應(yīng)用前景,是GBM的一個重要的預(yù)后預(yù)測因子[22]?;熕幬锉徽J(rèn)為是誘導(dǎo)焦亡發(fā)生的重要途徑之一,其誘發(fā)焦亡是通過激活凋亡關(guān)鍵蛋白CASP3來實(shí)現(xiàn)的[23-24]。CASP3是天冬氨酸特異酶切的半胱氨酸蛋白酶,正常狀況下以無活性的酶原形式存在于細(xì)胞質(zhì)中,既往研究認(rèn)為CASP3是凋亡相關(guān)關(guān)鍵蛋白,CASP3激活后,細(xì)胞進(jìn)入凋亡途徑,近年研究表明CASP3的剪切和活化,可進(jìn)一步剪切和活化焦亡關(guān)鍵蛋白GSDME,釋放的GSDME-N端片段具有細(xì)胞膜及線粒體成孔功能,細(xì)胞膜的成孔會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物如LDH、HMGB1的釋放,細(xì)胞內(nèi)外滲透壓失衡,誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡[25-27]。而HMGB1等抗原物質(zhì)的釋放能激活抗原遞呈細(xì)胞,進(jìn)而激活殺傷性T細(xì)胞,同時引起腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的活化及浸潤,起到免疫放大作用,擴(kuò)大抗腫瘤效應(yīng)[28-29]。故GSDME途徑的焦亡發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)受到直接的細(xì)胞成孔及間接的免疫激活雙重作用。目前的研究顯示乳腺癌、黑色素瘤、胃癌細(xì)胞的焦亡有明顯的腫瘤抑制作用[30-31]。

    GSDME的表達(dá)可促使細(xì)胞從凋亡向焦亡轉(zhuǎn)變[23],GSDME在GBM中高表達(dá),使其成為誘導(dǎo)焦亡抗GBM治療的天然靶點(diǎn),故篩選合適的焦亡激活藥物尤為重要。目前的研究顯示多種化學(xué)藥物如順鉑、阿霉素等具有GSDME途徑焦亡誘導(dǎo)作用[29],但血腦屏障的存在及其毒副作用限制了其顱內(nèi)應(yīng)用。AE具有血腦屏障能力[32],本研究顯示AE具有確切的CASP3、GSDME活化作用及GBM細(xì)胞抑制作用,故AE可以作為誘導(dǎo)GBM焦亡抗腫瘤的良好候選藥物。中等濃度的AE可明顯抑制GBM活性,但未見明顯的CASP3與GSDME的活化,這提示誘導(dǎo)焦亡是AE抑制GBM細(xì)胞的途徑之一,目前有文獻(xiàn)顯示AE可抑制DNA合成、阻滯細(xì)胞周期[11-12],故認(rèn)為AE抗GBM的機(jī)制為包括誘導(dǎo)焦亡在內(nèi)的多種途徑滲入,其焦亡誘導(dǎo)作用也是有限的。GSDME在正常腦組織及機(jī)體器官有表達(dá),GSDME的完全激活會引起正常組織損傷,這也被認(rèn)為與多種化療藥物的毒副反應(yīng)相關(guān)[26],而AE有限的焦亡誘導(dǎo)作用既有利于其發(fā)揮對腫瘤的抑制作用,又可避免焦亡過度激活所引起的正常組織損傷,是一種適合臨床應(yīng)用的理想的焦亡誘導(dǎo)藥物,當(dāng)然其更明確的抗GBM作用及安全性有待體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確。

    焦亡的發(fā)生與線粒體的功能障礙以及ROS產(chǎn)生密切相關(guān)[17],Yang等[33]研究顯示:ROS產(chǎn)生可激活JNK/Cytochrome C/CASP9/CASP3通路,而誘導(dǎo)高表達(dá)GSDME的細(xì)胞出現(xiàn)焦亡;An等[18]研究顯示:線粒體ROS的產(chǎn)生可激活CASP3/GSDME,進(jìn)而誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞焦亡。以上研究顯示,線粒體功能障礙和ROS產(chǎn)生是CASP3/GSDME 途徑焦亡的啟動因素之一,我們的研究也顯示AE處理的GBM細(xì)胞在晚期(60 h)出現(xiàn)細(xì)胞焦亡,而在早期(24 h)檢測ROS水平,顯示ROS表達(dá)水平明顯升高,而用抗氧化劑阻斷ROS可抑制AE所誘導(dǎo)的GSDME的活化,說明AE介導(dǎo)GBM細(xì)胞焦亡和誘發(fā)線粒體功能障礙和ROS產(chǎn)生相關(guān)。

    綜上,本文以膠質(zhì)瘤細(xì)胞為研究對象,通過體外實(shí)驗(yàn)證明AE以濃度依賴的方式抑制GBM細(xì)胞活性,誘導(dǎo)GBM細(xì)胞出現(xiàn)焦亡特異性外觀及LDH釋放,介導(dǎo)CASP3、GSDME蛋白水平的剪切活化,上調(diào)GSDME在mRNA的表達(dá),誘導(dǎo)線粒體功能障礙和ROS的產(chǎn)生。證實(shí)激活CASP3/GSDME通路是AE抗GBM的機(jī)制之一,可為膠質(zhì)瘤的治療提供一種新的選擇。

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