三種羅漢松根際土壤微生物群落功能多樣性

霍燦燦 朱栗瓊 招禮軍 甘遠(yuǎn)東 黃相玲

（廣西大學(xué)林學(xué)院/廣西森林生態(tài)與保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣西南寧 530004）

羅漢松[Podocarpus maerophyllus(Thunb.)]隸屬裸子植物亞門(mén)（Gymnospermae）松柏綱（Coniferopsida）羅漢松科（Podocarpaceae）羅漢松屬（Podocarpus），別名羅漢杉、羅漢柏，是國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物[1]，主要分布于我國(guó)長(zhǎng)江以南各省，因其樹(shù)形美觀，寓意“長(zhǎng)壽”成為我國(guó)南方庭院觀賞、園林綠化優(yōu)先考慮的樹(shù)種，我國(guó)約有 2屬14種。羅漢松在醫(yī)學(xué)上也有藥用價(jià)值，因其根皮果實(shí)均可入藥，可以治療多種疑難雜癥[2-3]。

植物根系土壤微生物量是植物根系微環(huán)境及根系生長(zhǎng)發(fā)育良好的重要表征，對(duì)于根系發(fā)達(dá)的喬木或灌木，根系土層深度的差異會(huì)在土壤微生物的數(shù)量、組成及功能上體現(xiàn)。羅漢松是古老的裸子植物，為喬木或灌木，根系發(fā)達(dá)，在自然界中羅漢松屬植物普遍具有共生結(jié)瘤的現(xiàn)象，同時(shí)存在共生菌，如細(xì)菌、放線(xiàn)菌、真菌等，根系微生物豐富多樣。根瘤內(nèi)生固氮菌具有一定的固氮酶活性，其生物固氮體系與豆科植物具有高度的相似性[4]，羅漢松根系菌根及根系結(jié)瘤內(nèi)生菌的特性隨著土層深度的變化而變化。主要體現(xiàn)在不同的土層深度，羅漢松根際土壤微環(huán)境、根系結(jié)瘤量、生物固氮能力具有不同程度的差異。土層深度及根系特征與根際微生物群落的功能和代謝的相關(guān)性研究主要集中在農(nóng)作物連作方面，而有關(guān)羅漢松科植物方面的研究報(bào)道鮮見(jiàn)。如有研究表明，0～20 cm土層內(nèi)紫花苜蓿田間土壤細(xì)菌和放線(xiàn)菌數(shù)量高于20～40 cm土層，而真菌數(shù)量變化不大[5-8]。因此，本研究采用Biolog微平板法，以3 種羅漢松的 0～10、10～20、20～30 cm 三個(gè)不同土層深度為研究對(duì)象，從根際微生物群落碳源利用的角度，研究不同土層深度羅漢松根際土壤微生物群落功能多樣性，以了解羅漢松根際土壤微生物功能的變化，分析羅漢松復(fù)雜的共生體與土壤環(huán)境的相關(guān)性，為羅漢松的撫育管理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材 以采自中國(guó)廣西南寧市隆安縣金穗園林花木場(chǎng)3種羅漢松，即臺(tái)灣大葉羅漢松（Podocarpus nakaii）、金鉆羅漢松（P. annamiensis）、羅漢松（Podocarpus macrophyllus），（以下分別用A、B、C 表示），根際的 0～10、10～20、20～30 cm三個(gè)不同土層深度的土壤為試驗(yàn)材料。

1.1.2 樣地概況 金惠園林花木場(chǎng)，位于中國(guó)廣西的西南部，地處東經(jīng) 107°40'～108°11′，北緯22°18′～23°14′，屬南亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候，炎熱多雨，冬短夏長(zhǎng)。年平均降雨量1 301 mm，年內(nèi)降雨量分配不均勻，季節(jié)性較強(qiáng)，降雨多集中在夏季。年平均氣溫 21.8℃，年最高平均氣溫月 7月28.4℃，最低平均氣溫月1月13.2℃。采集樣地土壤，測(cè)得土壤 pH 5.8～7.6，有機(jī)質(zhì)為12.37～17.32 g/kg，全氮含量為 1.02～1.66 g/kg，全磷含量為 0.42～2.94 g/kg，全鉀含量為 3.69～5.54 mg/kg。（因樣地不同樹(shù)種間種植距離較近，土壤條件基本一致，且測(cè)量的樣地中不同品種不同土層土壤理化性質(zhì)未顯現(xiàn)出一定的規(guī)律性，故未分析土壤微生物多樣性與土壤理化性質(zhì)之間的關(guān)系）。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 于2017年10月上旬，選擇晴朗的天氣在金穗園林花木場(chǎng)金鉆羅漢松（A）、臺(tái)灣大葉羅漢松（B）、羅漢松（C）基地分別采樣。植株的選擇采用傳統(tǒng)的“5點(diǎn)法”。將植物地表0～2 cm 土壤去除，再用鐵鏟分別挖至距離地表0～10 cm（標(biāo)記 1）、10～20 cm（標(biāo)記 2）、20～30 cm（標(biāo)記 3）處，將根暴露出來(lái)，輕輕抖掉根系外圍土壤后，用軟毛刷將粘附在根系上的土壤輕輕刷下來(lái)，作為根際土壤。用無(wú)菌封口袋將各土層深度根際土壤裝好并做好標(biāo)識(shí)，放入冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室研磨過(guò)2 mm篩后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 土壤微生物功能多樣性的研究 羅漢松根際土壤微生物功能多樣性的研究分析參照Classen等[9]方法。將土樣從冰箱中取出，放在25℃條件下活化24 h，取10 g土樣于250 mL三角瓶中，加入90 mL經(jīng)滅菌的NaCl溶液（濃度為0.85%），將三角瓶置于旋禍振蕩器上以 200 r/min震蕩30 min，靜置后取一定量上清液并采用無(wú)菌NaCl溶液稀釋至 1 000倍，制備出接種液并移至儲(chǔ)液槽。使用 8孔道排槍向 ECO板培養(yǎng)基孔中加150 μL接種液，每個(gè)樣品3次重復(fù)；將接種好的微孔板放入25℃恒溫培養(yǎng)箱中；分別于24、48、72、96、120、144、168、192、216和240 h使用Biolog微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)測(cè)定吸光度，測(cè)定波長(zhǎng)分別為590（顏色+濁度）和750 nm（濁度）。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 采用Excel 2010和SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用主成分（PCA）法分析羅漢松根際土壤微生物對(duì)碳源利用情況。繪圖在Excel 2010中完成。

羅漢松根際土壤微生物代謝強(qiáng)度用AWCD描述，表征微生物利用單一碳源的能力[10]。計(jì)算公式為：AWCD=[(Ci-R)]/31。式中Ci為i個(gè)非對(duì)照孔測(cè)出的吸光度值，R為對(duì)照孔的吸光度值，若Ci-R為負(fù)數(shù)則可記為0。

用 Shannon多樣性指數(shù)、Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)及McIntosh均勻度指數(shù)（U）表示羅漢松根際土壤微生物代謝功能多樣性。其計(jì)算方法如下：

式中，ni為第i個(gè)孔測(cè)出的吸光度值，Pi為ni與整個(gè)平板相對(duì)吸光值總和的比值。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅漢松根際土壤微生物利用全部碳源動(dòng)力學(xué)分析

由圖1可知，羅漢松根際土壤微生物隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)碳源的利用強(qiáng)度呈逐漸遞增的趨勢(shì)。不同種羅漢松根際土壤微生物平均顏色變化率（AWCD）存在差異（表 1）。在培養(yǎng)時(shí)間96 h后增長(zhǎng)幅度逐漸減小并趨于穩(wěn)定不變的趨勢(shì)，在培養(yǎng)初期（24 h）羅漢松根際土壤微生物AWCD值較小，表明在培養(yǎng)初期土壤微生物對(duì)碳源的利用程度較低，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，土壤微生物逐漸適應(yīng)Biolog板孔中的微環(huán)境，迅速進(jìn)入快速增長(zhǎng)期，AWCD值也迅速增大。在 96 h后AWCD值增長(zhǎng)逐漸平緩直到培養(yǎng)末期Biolog平板中碳源逐漸被消耗減少，土壤微生物進(jìn)入增長(zhǎng)衰退期，AWCD值也逐漸趨于穩(wěn)定。同種不同土層深度土壤微生物AWCD值為 10～20 cm＞0～10 cm＞20～30 cm；同土層深度不同種間土壤微生物AWCD值為羅漢松＞臺(tái)灣大葉羅漢松＞金鉆羅漢松。

圖1 羅漢松根際土壤微生物群落AWCD隨著培養(yǎng)時(shí)間的變化

表1 羅漢松根際土壤微生物群落AWCD隨著培養(yǎng)時(shí)間變化顯著差異情況

2.2 羅漢松根際土壤微生物群落多樣性指數(shù)分析

羅漢松根際土壤微生物經(jīng)過(guò)96 h的培養(yǎng)后，在不同土層和不同種間AWCD值及生物多樣性指數(shù)表現(xiàn)出不同的差異。由表2可見(jiàn)，AWCD值在3種羅漢松種間變化規(guī)律為：羅漢松＞臺(tái)灣大葉羅漢松＞金鉆羅漢松，同種不同土層深度下AWCD值差異明顯。10～20 cm土層深度AWCD值最大，金鉆羅漢松為1.257，臺(tái)灣大葉羅漢松為1.557，羅漢松為1.820。Shannon多樣性指數(shù)在同種不同土層深度下差異明顯，10～20 cm土層深度Shannon多樣性指數(shù)明顯高于0～10、20～30 cm土層。金鉆羅漢松與臺(tái)灣大葉羅漢松Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)在同種不同土層深度變化幅度較小，其值在 0.94～0.95變化且差異不顯著。金鉆羅漢松與羅漢松McIntosh指數(shù)總體要低于臺(tái)灣大葉羅漢松。

表2 羅漢松根際土壤微生物群落AWCD和多樣性指數(shù)

2.3 羅漢松根際土壤微生物利用碳源類(lèi)型分析

Biolog微平板上共有31種碳源，可將其分為六大類(lèi)，即氨/胺類(lèi)、羧酸、聚合物、氨基酸、糖類(lèi)、其他化合物，土壤微生物在培養(yǎng)生長(zhǎng)的過(guò)程中對(duì)各種碳源的利用強(qiáng)度也存在差異。如圖2所示，羧酸、糖類(lèi)、氨基酸是羅漢松根際土壤微生物主要的利用碳源。同種不同土層深度下，0～10 cm土層深度羅漢松根際土壤微生物對(duì) 6種碳源的利用強(qiáng)度明顯高于其他土層深度的微生物。隨土層深度的加深，羅漢松根際土壤微生物對(duì)這，6種碳源的利用強(qiáng)度逐漸降低。不同種同一土層深度下，對(duì)6種碳源的利用強(qiáng)度為：羅漢松＞金鉆羅漢松＞臺(tái)灣大葉羅漢松。3種羅漢松根際土壤微生物對(duì)氨/胺類(lèi)、聚合物、其他化合物這3種碳源的利用強(qiáng)度明顯低于羧酸、糖類(lèi)、氨基酸這3種碳源。在氨/胺類(lèi)碳源中，羅漢松0～10 cm土層根際土壤微生物利用強(qiáng)度最大，相比于金鉆羅漢松 0～10 cm 根際土壤微生物利用強(qiáng)度高出19.0%，比臺(tái)灣大葉羅漢松0～10 cm根際土壤微生物高出38.89%，3種羅漢松對(duì)聚合物碳源的平均利用強(qiáng)度最大是羅漢松，為 2.97，比臺(tái)灣大葉羅漢松高出18.8%，比金鉆羅漢松高出6.1%。

圖2 羅漢松根際土壤微生物對(duì)6種碳源的利用分析

2.4 羅漢松根際土壤微生物對(duì)碳源利用的主成分分析

對(duì) 3種羅漢松在不同土層深度下根際土壤微生物對(duì)單一碳源的利用進(jìn)行主成分分析。如表 3所示，從31種碳源中提取3個(gè)主成分因子分別能夠解釋變量方差的 27.8%、25.9%、18.4%，主成分1和2的累積貢獻(xiàn)率可以達(dá)到53.7%。表明羅漢松根際土壤微生物對(duì)碳源利用強(qiáng)度的變異來(lái)源主要是主成分1和2，因此大部分信息都可以用這2個(gè)主成分來(lái)解釋。不同土層深度不同種間，羅漢松根際土壤微生物利用碳源強(qiáng)度存在明顯差異。

表3 主成分的貢獻(xiàn)率和累積貢獻(xiàn)率 單位：%

如圖3所示，在PC1軸上金鉆羅漢0～10 cm土層、臺(tái)灣大葉羅漢松 0～10、10～20及 20～30 cm土層均分布在負(fù)方向，得分系數(shù)為-0.169 ～ -0.002，說(shuō)明這4個(gè)土層深度下羅漢松根際土壤微生物對(duì)單一碳源利用與主成分1相關(guān)系數(shù)為負(fù)，呈負(fù)相關(guān)。在PC2軸上除了羅漢松20～30 cm土層分布在負(fù)方向，得分系數(shù)為-0.106，其余種不同土層均分布正方向，說(shuō)明羅漢松根際土壤微生物對(duì)單一碳源的利用基本與主成分2相關(guān)系數(shù)為正，呈正相關(guān)。在PC1軸上金鉆羅漢松A1土層與臺(tái)灣大葉羅漢松B1、B2、B3各土層主成分的分析均無(wú)明顯差異，表明金鉆羅漢松 A1土層與臺(tái)灣大葉羅漢松在主成分1中對(duì)碳源的利用具有相似性，金鉆羅漢松 A2、A3土層、羅漢松 C1、C2土層相互之間主成分得分系數(shù)均無(wú)明顯差異，說(shuō)明在0～20 cm 土層內(nèi)金鉆羅漢松與羅漢松具有相似的方式利用碳源。在 PC1、PC2軸上，羅漢松 C3土層與各土層之間及其它種不同土層深度下主成分得分均差異明顯，表明羅漢松20～30 cm土層對(duì)碳源的利用與其他品種各土層根際土壤微生物對(duì)碳源的利用模式存在較大差異。

圖3 羅漢松根際土壤微生物利用碳源的主成分分析

對(duì)31種碳源與主成分1、主成分2的相關(guān)性進(jìn)行分析可知（表4），與主成分1顯著相關(guān)的糖類(lèi)碳源有5種，氨基酸類(lèi)碳源有3種，羧酸類(lèi)碳源有2種，聚合物類(lèi)碳源1種，共11種碳源與主成分1有顯著的相關(guān)性。與主成分2顯著相關(guān)的碳源共15種，其中糖類(lèi)碳源有2種，氨基酸類(lèi)碳源有3種，羧酸類(lèi)碳源7種，氨/胺類(lèi)碳源有2種，其他類(lèi)碳源1種。綜合分析可知，羅漢松根際土壤微生物對(duì)碳源的利用主要是糖類(lèi)、羧酸類(lèi)、氨基酸、胺類(lèi)四大類(lèi)碳源，說(shuō)明糖類(lèi)、氨基酸、羧酸、胺類(lèi)在主成分分析中起主導(dǎo)貢獻(xiàn)。

表4 三十一種碳源與主成分1、2的相關(guān)系數(shù)

3 討論

土壤是微生物天然的生活場(chǎng)所。一方面，土壤中水分、礦物質(zhì)、有機(jī)質(zhì)為微生物提供了必要的生存條件；另一方面土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及功能多樣性能夠直接反映土壤生態(tài)系統(tǒng)的健康狀況[11-12]。土壤微生物在土壤生態(tài)系統(tǒng)中扮演著重要的角色，影響著農(nóng)林牧業(yè)的發(fā)展。有研究表明，微生物在土壤中通過(guò)一系列的“搬運(yùn)”及轉(zhuǎn)化，為作物提供養(yǎng)分，如大豆作物中的根瘤固氮菌通過(guò)一系列的氨化、硝化作用將空氣中的氮?dú)饧巴寥乐械挠袡C(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化為作物可利用的氮和養(yǎng)分[13-14]。微生物在土壤中的分布及功能是土壤環(huán)境與微生物自身共同決定的，而植物可以通過(guò)改變土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)來(lái)改變土壤環(huán)境。一方面，植物根系分泌物可以影響微生物的生長(zhǎng)類(lèi)型及分布，不同根系分泌物的含量及成分會(huì)不同程度地改變根際土壤微生物的代謝；另一方面，植物根系結(jié)構(gòu)及在土壤層中的分布也會(huì)影響土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)及功能多樣性。研究表明，在10～20 cm的土層深度下紫花蓿苜土壤中的細(xì)菌要高于 20～30 cm的土層，而真菌數(shù)量低于20～30 cm土層[6]。

Biolog微平板法是一種現(xiàn)代研究土壤微生物功能多樣性的較新方法，原理是微生物利用碳源而發(fā)生氧化還原反應(yīng)，其顯色深淺可以表征微生物對(duì)碳源的利用程度，來(lái)間接反映土壤微生物的種類(lèi)多樣性[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，3種羅漢松不同土層深度根際土壤微生物的生長(zhǎng)模式基本一致，都要經(jīng)歷適應(yīng)期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期；但隨時(shí)間的推移，各土層根際土壤微生物AWCD增長(zhǎng)幅度變化存在差異，微生物在各生長(zhǎng)階段AWCD值也不同，表明微生物對(duì)碳源的利用強(qiáng)度也不同。研究表明，AWCD值變化幅度越大，對(duì)碳源的利用強(qiáng)度越大，土壤中微生物越豐富[16]。本試驗(yàn)中在同種下10～20 cm土層AWCD值最大，各土層微生物均在培養(yǎng)96 h后開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，這說(shuō)明3種羅漢松在10～20 cm土層微生物最豐富，對(duì)碳源的利用強(qiáng)度最大，在這一土層深度中微生物相對(duì)較活躍參與土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化供植物生長(zhǎng)，各土層微生物有一個(gè)基本相同的適應(yīng)期。經(jīng)觀測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，在同一土層深度不同種間，其AWCD值也存在差異，在各培養(yǎng)時(shí)間段其變化幅度也存在較大的差異，表明不同種羅漢松根系特征對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)也會(huì)產(chǎn)生影響。也有研究發(fā)現(xiàn)，羅漢松根系具有與豆科植物相似的性狀特性，其根系結(jié)瘤呈橢圓形狀似米粒大小[17-19]。本研究中3種羅漢松的AWCD值為羅漢松＞臺(tái)灣大葉羅漢松＞金鉆羅漢松，表明在同一生長(zhǎng)環(huán)境下，羅漢松的根際土壤微生物更豐富，對(duì)碳源的利用強(qiáng)度更強(qiáng)。

為進(jìn)一步研究羅漢松根際不同土層土壤微生物功能多樣性的規(guī)律，用Shannon多樣性指數(shù)、Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)以及McIntosh均勻度指數(shù)來(lái)衡量[20-22]。研究表明，植物根冠區(qū)有利于維持其生命力，并且植物殘根可增加土壤肥力[23-25]。本研究中，在相同種下10～20 cm土層Shannon多樣性指數(shù)、McIntosh均勻度指數(shù)均明顯高于其他土層，羅漢松主根發(fā)達(dá)能夠深入土壤，使土壤具有較強(qiáng)的水土保持能力；而根冠區(qū)在土壤中穿越，既疏松了土壤又使自身根冠區(qū)細(xì)胞不斷更新保持活力不會(huì)腐朽；在10～20 cm土層，主要是羅漢松的側(cè)根及細(xì)根的分布層，根系遺留下的殘根及地面上的枯枝落葉經(jīng)過(guò)腐化后形成腐殖質(zhì)，使土壤的孔隙度、通透性、保水能力增大，良好的土壤環(huán)境為微生物提供了一個(gè)優(yōu)良的生存場(chǎng)所。

綜上所述，根際土壤層深度、羅漢松種類(lèi)對(duì)羅漢松根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及功能多樣性的影響均有差異。在相同品種下同一環(huán)境中10～20 cm土層深度微生物群落多樣性明顯高于 0～10、20～30 cm土層，說(shuō)明10～20 cm土層是根際土壤微生物優(yōu)良的天然生活場(chǎng)所，是微生物對(duì)植物發(fā)揮根際效應(yīng)及土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化的良好空間。在相同土層深度下不同種間，羅漢根松際土壤微生物群落多樣性明顯高于其他2個(gè)品種。因此，在土壤健康狀況的保護(hù)中，在羅漢松引種種植上可以?xún)?yōu)先考慮對(duì)土壤微生物群落影響較小、微生物功能多樣較高的羅漢松。