番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒N和NSm基因的VIGS載體構(gòu)建

崔 玥, 趙立華, 陳 思, 文俊元, 邱潤(rùn)霜, 張仲凱, 趙明富

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，昆明 650201；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，昆明 650205)

【研究意義】番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒(Tomato zonate spot tospovirus，TZSV)屬于布尼亞病毒目(Bunyaviridae)、番茄斑萎病毒科(Tospovirus)、正番茄斑萎病毒屬(Orthotospovirus)，是正番茄斑萎病毒屬在云南省的優(yōu)勢(shì)種，主要通過(guò)薊馬傳播[1]。近年來(lái)，TZSV在云南、貴州、廣西及東南亞國(guó)家普遍流行發(fā)生，導(dǎo)致大量觀賞植物和重要蔬菜品質(zhì)下降、產(chǎn)量損失，對(duì)當(dāng)?shù)氐霓r(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅[2]。TZSV病毒為球形病毒粒子，主要在葉肉細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中分布[3]。與Orthotospovirus屬的其他成員相似，TZSV基因組具有3條負(fù)單鏈RNA，分別命名為大(L)、中(M)和小(S)RNA。L RNA是負(fù)義鏈，編碼RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)，用于復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。M RNA編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NSm和病毒糖蛋白前體(Gn/Gc)。S RNA編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NSs和核衣殼蛋白N。其中NSs蛋白具有RNA沉默抑制活性，N蛋白負(fù)責(zé)包裹病毒基因組RNA[4-5]。本研究通過(guò)構(gòu)建N和NSm基因沉默載體為基因功能的研究提供材料，為田間病毒病的防控提供一定的理論基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)(Virus induced gene silencing，VIGS)是一種通過(guò)基因瞬時(shí)表達(dá)研究基因功能的方法。目前，煙草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)誘導(dǎo)的基因沉默系統(tǒng)是從不同的RNA和DNA病毒中發(fā)現(xiàn)的幾十個(gè)VIGS載體中具有宿主范圍廣、能夠?qū)φ曛参镞M(jìn)行沉默的優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用[6]。TRV VIGS技術(shù)目前已應(yīng)用于本氏煙(Nicotianabenthamiana)、大麻(CannabissativaL.)、落葉松[Larixgmelinii(Rupr.)Kuzen.]、小麥(TriticumaestivumL.)、大豆(Glycinemax)、辣椒(CapsicumannuumL.)等植物[7-11]。病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)廣泛應(yīng)用于非生物脅迫、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和次生代謝產(chǎn)物的生物合成以及抗病毒等方面的研究。TRV誘導(dǎo)番茄LeCTR1基因沉默后，活性氧(ROS)含量顯著下降，而AOS2、PR1、NPR1、和PR5等抗性相關(guān)基因表達(dá)量上升，進(jìn)而提高了番茄對(duì)番茄卷葉病毒(Tomato leaf curl virus，ToLCV)的抗性[12]。沉默H2B和CoI1基因后，本氏煙中水楊酸(SA)和茉莉酸(JA)含量增加，導(dǎo)致馬鈴薯X病毒(Potato virus X，PVX)和番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt orthotospovirus，TSWV)的侵染受到抑制[13-14]。Macharia等[15]通過(guò)VIGS體系研究發(fā)現(xiàn)植物體的自噬作用與NbHYPK和ATG8基因有關(guān)，有助于防御TMV侵染。邱潤(rùn)霜等[16]將TSWVN基因插入TRV載體以進(jìn)一步研究基因功能，但尚未有將TZSV基因插入VIGS載體的報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】VIGS是目前報(bào)道鑒定植物基因功能的重要技術(shù)手段，已有多種RNA病毒被成功開(kāi)發(fā)成VIGS載體，但在TZSV上尚未見(jiàn)報(bào)道，通過(guò)構(gòu)建的TZSV重組載體結(jié)構(gòu)或許可用于研究TZSV基因的功能，在防治TZSV方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】目前田間采用傳統(tǒng)的化學(xué)藥劑，物理和生物防治等方法控制和預(yù)防TZSV侵染，由于各種措施的弊端使TZSV的侵染仍嚴(yán)重威脅經(jīng)濟(jì)作物和觀賞植物產(chǎn)量和質(zhì)量。本研究將TZSVN和NSm基因構(gòu)建到pTRV-pTV00的VIGS載體上，抑制基因和蛋白的表達(dá)，為田間防控TZSV提供了技術(shù)手段和試驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

pTV00、pBINTRA和pTV00-PDS載體均由昆明植物研究所吳建強(qiáng)教授提供。TZSV YN-Chili分離株從中國(guó)云南省元謀縣受感染的番茄植株中獲取，并在本氏煙中繁毒[12]。K326和本氏煙在云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所溫室中栽培。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)布的TZSVN和NSm基因序列(注冊(cè)號(hào): MG656995.1，NC_010490.1)設(shè)計(jì)引物(表1)。

表1 VIGS 和RT-qPCR擴(kuò)增引物

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 TZSV接種 采用摩擦接種法將TZSV接種到K326和本氏煙植株上。將新鮮毒源加入PBS緩沖液(100 mg/mL)進(jìn)行研磨，每株3個(gè)葉片接種TZSV 1 mL。接種TZSV 10 min后，用ddH2O沖洗植株葉片。用PBS緩沖液接種的植株作為對(duì)照。接種5 d后，當(dāng)癥狀出現(xiàn)時(shí)采集樣品，每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)重復(fù)。

1.2.2 RNA提取和RT-PCR 感病植株葉片總RNA按照RNA提取試劑盒(Roche，America)說(shuō)明書(shū)提取，cDNA由cDNA第一鏈合成試劑盒(全式金，中國(guó))逆轉(zhuǎn)錄獲得，目的片段則Q5高保真DNA聚合酶(High-fidelity DNA Polymerase，NEB，England)進(jìn)行PCR得到。PCR體系由1 μL DNA、10 μL Q5 反應(yīng)緩沖液、1 μL 2.5 mmol/L dNTPs、2.5 μL 正向引物、2.5 μL 反向引物、0.5 μL Q5 DNA聚合酶及32.5 μL ddH2O組成。PCR反應(yīng)條件為98 ℃ 40 s；98 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸2 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的凝膠電泳30 min后，紫外凝膠成像分析系統(tǒng)觀察。

1.2.3 VIGS載體構(gòu)建 目的DNA純化后，連接到pEASY-Blunt-Zero載體(全式金，北京)上送往廣州華大基因有限公司進(jìn)行測(cè)序，以確保堿基序列不發(fā)生突變。將含N和NSm基因序列的pEASY-Blunt-Zero載體和pTRV-pTV00載體用BamHI和HindIII限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，并將酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，純化后產(chǎn)物與pTRV-pTV00載體使用T4 DNA連接酶連接。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選出陽(yáng)性克隆送往廣州華大基因技術(shù)有限公司測(cè)序。用序列正確的重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞。

1.2.4 農(nóng)桿菌注射 通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化法將重組載體pTRV-PTV00-N和pTRV-PTV00-NSm轉(zhuǎn)到GV3101農(nóng)桿菌中。將等體積已轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌的pTRV-pBINTRA重懸菌液分別與pTRV-PTV00-N和pTRV-PTV00-NSm的重懸菌液充分混合，制成注射菌液，對(duì)本氏煙和K326進(jìn)行注射侵染。

使用1 mL注射器，每株注射3個(gè)葉片。PDS陽(yáng)性對(duì)照葉片在接種后約10～14 d發(fā)白，接種TZSV。陽(yáng)性對(duì)照為注射空載后pTRV-pTV00接種TZSV和只接種TZSV的植株。接種后約5 d，采集樣品，以健康植株作為空白對(duì)照。

1.2.5 RT-qPCR 將N和NSm基因序列構(gòu)建到pEASY-T1 Simple載體上，構(gòu)建成重組質(zhì)粒。連續(xù)10倍梯度稀釋獲得(10-1～10-6)質(zhì)粒，作為標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)體系：cDNA 1 μL，正向引物2.5 μL，反向引物2.5 μL，F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master(Rox)10 μL，ddH2O補(bǔ)足到10 μL。反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)40次。

沉默效率(%)=(C-T)/C×100

式中，C為接種TZSV的葉片中N和NSm基因的平均拷貝數(shù);T為N和NSm基因在接種沉默載體葉片中的平均拷貝數(shù)。

1.2.6 ID-ELISA 取葉片0.2 g在500 μL PBS緩沖液中研碎成汁液。將100 μL粗提物加入酶聯(lián)免疫吸附板孔中，37 ℃ 孵育2 h，用加0.05% TWeen-20的PBS制成PBST緩沖液洗滌。用抗體緩沖液(含2%牛血清蛋白的PBS緩沖液)稀釋TZSV N和NSm多克隆抗體。隨后，每孔加入100 μL ap標(biāo)記的山羊抗兔IgG(Sigma，美國(guó))。將底物顯色劑在底物緩沖液中溶于對(duì)硝基苯基磷酸二鈉(Sigma-Aldrich)至最終濃度為1 mg/mL。用ELx808酶標(biāo)儀(Bio-Tek，USA)測(cè)定405 nm處的吸光度。以健康葉片為陰性對(duì)照，PBS緩沖液為空白對(duì)照，接種TZSV葉片為陽(yáng)性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 N和NSm基因的VIGS載體

通過(guò)RT-PCR獲得目的片段，結(jié)果顯示N和NSm目的基因的片段長(zhǎng)度分別為208、186 bp，與預(yù)期結(jié)果一致(圖1A～B)。將含有N和NSm基因序列分別連接到pTRV-pTV00載體上，通過(guò)雙酶切進(jìn)行驗(yàn)證，從圖1C～D可以看出，雙酶切后N和NSm目的基因片段長(zhǎng)度符合要求，說(shuō)明重組pTRV-pTV00-N、pTRV-pTV00-NSm病毒載體成功構(gòu)建，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

A: PCR擴(kuò)增N 基因序列; B: PCR擴(kuò)增NSm基因序列; C: 酶切驗(yàn)證構(gòu)建的N基因VIGS載體; D:酶切驗(yàn)證構(gòu)建的NSm基因VIGS載體; M: DNA Marker 2000。

2.2 N和NSm基因的RT-qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

含N和NSm基因的重組質(zhì)粒濃度分別為230.39、147.19 ng/μL，OD260/280值分別為1.82、1.91，質(zhì)粒質(zhì)量符合RT-qPCR要求。通過(guò)軟件自動(dòng)分析得到TZSVN和NSm基因RT-qPCR的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中，N和NSm基因標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為Y=-3.333X+33.66、Y=-3.815X+36.07；擴(kuò)增效率分別為95.01%、96.31%；相關(guān)系數(shù)分別為0.993、0.991。結(jié)果表明，重組質(zhì)?？梢宰鳛闃?biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)。

2.3 RT-qPCR檢測(cè)TZSV沉默效率

接種TZSV 5 d后通過(guò)癥狀觀察發(fā)現(xiàn)，未注射pTRV-pTV00-N、pTRV-pTV00-NSm重組載體而只接種TZSV的陽(yáng)性對(duì)照植株心葉表現(xiàn)出嚴(yán)重皺縮癥狀(圖2-C)，注射含有pTRV-pTV00-N、pTRV-pTV00-NSm重組載體后接種TZSV的處理植株葉片未表現(xiàn)病毒侵染癥狀(圖2A～B)，初步說(shuō)明載體構(gòu)建成功且對(duì)病毒侵染具有防御作用。為進(jìn)一步確定N、NSm基因的沉默效率，采用RT-qPCR技術(shù)來(lái)檢測(cè)TZSVN和NSm基因的表達(dá)量。RT-qPCR分析表明，與只接種TZSV未注射任何載體的陽(yáng)性對(duì)照相比，N和NSm基因在本式煙和栽培煙K326體內(nèi)的表達(dá)量均顯著降低，TZSVN和NSm基因在本氏煙中的沉默效率分別為99.75%、90.07%；N和NSm基因在栽培煙K326中的沉默效率為94.31%、90.32%(圖3)。綜上所述，構(gòu)建的 pTRV-pTV00-N 和pTRV-pTV00-NSm載體可用于后續(xù)基因功能和抗病性的研究，2種煙草類(lèi)型均可作為試驗(yàn)材料。

A: 先注射TRV-PTV00-N載體，后接種TZSV植株; B: 注射pTRV-PTV00-NSm載體,后接種TZSV植株; C:只接種TZSV未注射其它載體的植株。

A.本氏煙中N和NSm基因沉默后接種TSZV 5 d后的沉默效率;B.K326中N和NSm基因沉默后接種TSZV 5 d后的沉默效率;VIGS-N:注射pTRV-pTV00-N沉默載體后接種TZSV; VIGS-NSm: 注射pTRV-pTV00-NSm 沉默載體后接種TZSV; pTV00-TZSV: 注射pTRV-pTV00空載體后接種TZSV; TZSV:只接種TZSV未注射其它載體;柱形圖上帶有不同*表示不同處理與對(duì)照差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

2.4 ID-ELISA檢測(cè)N和NSm蛋白表達(dá)量

為進(jìn)一步分析N和NSm基因沉默后對(duì)N和NSm蛋白表達(dá)量的影響以及對(duì)TZSV侵染的抑制情況，采用ID-ELISA法測(cè)定N和NSm的蛋白含量。N蛋白和NSm蛋白在本氏煙和栽培煙K326 兩種寄主內(nèi)第7天的表達(dá)量最高。N蛋白在本氏煙和K326 兩種寄主內(nèi)處理(先注射pTRV-pTV00-N，后接種TZSV)與對(duì)照(只接種TZSV)相比降低，且N蛋白在第5和7天顯著降低(表2)；NSm蛋白的表達(dá)量在本氏煙和K326 兩種寄主內(nèi)處理(先注射pTRV-pTV00-NSm，后接種TZSV)與對(duì)照(只接種TZSV)相比在第3、5、7和9天均顯著降低(表3)。結(jié)果表明，TZSV的N和NSm蛋白在本氏煙和K326中的表達(dá)也同樣受到抑制，進(jìn)而抑制TZSV侵染。

表2 ID-ELISA檢測(cè)N蛋白表達(dá)量

表3 ID-ELISA檢測(cè)NSm蛋白表達(dá)量

3 討 論

植物病毒引起的病害導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量下降、產(chǎn)量減少，嚴(yán)重危害了農(nóng)業(yè)的產(chǎn)量安全和質(zhì)量安全。2008年，TZSV在云南省煙草和其他寄主中被鑒定為Orthotospovirus的新種[1]。TZSV寄主范圍廣泛，可侵染7科20多種植物，包括重要經(jīng)濟(jì)作物和雜草[17-18]。TZSV對(duì)中國(guó)西南地區(qū)的番茄、煙草等農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重威脅。本研究通過(guò)構(gòu)建N和NSm基因的VIGS載體為研究該病毒的致病機(jī)制，以及田間TZSV的防治提供一定的理論和實(shí)用價(jià)值。

本研究利用TRV載體構(gòu)建N和NSm基因的VIGS載體，將pTRV-pTV00-N、pTRV-pTV00-NSm注射到植物體內(nèi)，當(dāng)PDS基因沉默的植株葉片呈白色時(shí)接種TZSV，使用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)N和NSm基因表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)N和NSm基因沉默效率均超過(guò)90%。ID-ELISA結(jié)果顯示，N和NSm蛋白含量均顯著下降，其中NSm蛋白含量連續(xù)9 d顯著下降。TRV誘導(dǎo)的VIGS體系對(duì)植物傷害較小，因此再次接種TZSV對(duì)寄主植物不會(huì)造成影響。當(dāng)接種TZSV植株出現(xiàn)癥狀時(shí)立即采樣檢測(cè)，可測(cè)得高效的沉默效率。同時(shí)，溫度對(duì)植株的沉默表型也有影響[19]，在此試驗(yàn)中，嚴(yán)格控制溫度使得沉默效率較高且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)。

TRV作為VIGS載體，被廣泛用于研究病毒與宿主的相互作用以及植物基因的功能研究[20]。在本研究中，以TRV為載體的VIGS系統(tǒng)成功沉默TZSVN和NSm基因。TRV寄主范圍廣泛，但物種和品種之間對(duì)TRV的敏感性存在顯著差異[21-22]。例如，對(duì)21個(gè)非洲菊品種進(jìn)行TRV敏感性試驗(yàn)，只有5個(gè)品種在新發(fā)育的葉片上表現(xiàn)出光漂白的PDS沉默癥狀[23]。在本研究中，本氏煙葉片被漂白，而K326煙草葉片未發(fā)生表型變化，表明TRV VIGS載體對(duì)不同宿主品種表現(xiàn)出不同的敏感性。VIGS方法可用于反向遺傳學(xué)研究，確定未知基因的功能，有助于闡明未知的生物合成途徑，縮小現(xiàn)有基因組數(shù)據(jù)與重要藥用植物或觀賞植物生物化學(xué)信息之間的差距。因此，病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)可以得到更廣泛的應(yīng)用。

目前田間采用傳統(tǒng)的化學(xué)藥劑，物理和生物防治等方法控制和預(yù)防TZSV侵染，由于各種措施的弊端使TZSV的侵染仍嚴(yán)重威脅經(jīng)濟(jì)作物和觀賞植物產(chǎn)量和質(zhì)量。生物源農(nóng)藥由于其對(duì)環(huán)境影響較小得到了廣泛的應(yīng)用，如寧南霉素、幾丁寡糖殼寡糖，圓葉腫柄菊素 A等[24-26]。近年來(lái)，VIGS技術(shù)也常被用于防御病毒侵染，有研究發(fā)現(xiàn)，將外源植物病毒dsRNA引入寄主中，可以干擾苜?；ㄈ~病毒(AMV)、辣椒輕斑駁病毒(PMMoV)和煙草蝕紋病毒(TEV)的復(fù)制，預(yù)防其對(duì)煙草的侵染[27]。本研究將TZSVN和NSm基因構(gòu)建到pTRV-pTV00的VIGS載體上，抑制基因和蛋白的表達(dá)，為田間防控TZSV提供了技術(shù)手段和試驗(yàn)材料。

4 結(jié) 論

本研究以TRV為載體構(gòu)建了TZSVN和NSm基因的沉默系統(tǒng)并成功應(yīng)用于本氏煙和K326。通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)沉默效率均高于90%。ID-ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，N和NSm蛋白含量均下降，其中NSm蛋白含量連續(xù)9 d顯著下降。本結(jié)果為研究TZSV的致病機(jī)理奠定了重要的材料和技術(shù)基礎(chǔ)，為T(mén)ZSV的田間抗病育種和防治提供了理論依據(jù)。