亞洲百合及東方百合 AGPase 酶活性及表達(dá)量與淀粉含量的相關(guān)性

張 達(dá)，李蓮蓮，莫江玲，李 緣，張超超，吳學(xué)尉，王麗花

(1.云南大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 昆明 650504; 2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所, 昆明 650205)

【研究意義】百合是百合科百合屬(Lilium)球根花卉植物，是重要的鮮切花[1]，中國(guó)切花生產(chǎn)用百合種球主要依賴進(jìn)口，每年需向荷蘭進(jìn)口約3億粒百合種球[2]。中國(guó)從20世紀(jì)90年代開(kāi)始研究百合種球國(guó)產(chǎn)化，目前已取得一定成果[3]，但在百合種球繁育周期長(zhǎng)及采后處理技術(shù)等方面還有進(jìn)一步研究和進(jìn)步的空間[4]。通常百合鱗莖需要培育到一定圍徑規(guī)格才能開(kāi)花，不同類型百合鱗莖培育膨大速率不同[5-8]。鱗莖的膨大及植株發(fā)育受淀粉合成代謝的影響[9-12]，離不開(kāi)相關(guān)酶的調(diào)控，相關(guān)酶的活性及表達(dá)會(huì)影響淀粉的合成與累積[12]。在淀粉生物合成的相關(guān)酶中，腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)作為淀粉合成限速酶調(diào)控淀粉生物合成的第一步，其活性及表達(dá)量對(duì)淀粉的生物合成至關(guān)重要[13-16]。因此，對(duì)AGPase酶活性及其基因的表達(dá)量與淀粉含量的相關(guān)性進(jìn)行研究，探索出的其相關(guān)性可作為前期優(yōu)良品種的鑒定及為后續(xù)分子實(shí)驗(yàn)提供理論基礎(chǔ)，有利于促進(jìn)百合種球國(guó)產(chǎn)化?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在東方百合種球鱗莖中，AGPase酶活性與淀粉積累量表現(xiàn)為正相關(guān)[17]。百合AGPase基因RNAi載體構(gòu)建也已有報(bào)道[18]。已有使用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法對(duì)蘭州百合籽鱗莖形成發(fā)育過(guò)程中不同時(shí)期淀粉合成相關(guān)酶的基因的研究，結(jié)果表明，與淀粉合成方向相關(guān)的酶，如ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、可溶性淀粉合成酶(SSS)、淀粉分支酶(SBE)和顆粒結(jié)合型淀粉合成酶(GBSS)在鱗莖形成和膨大期表現(xiàn)為母鱗片中活性減少，小鱗莖中基因表達(dá)量增加，而裂解方向的淀粉去分支酶(SDBE)在母鱗片中的基因表達(dá)量高于小鱗莖，這說(shuō)明淀粉合成相關(guān)酶與鱗莖的膨大密切相關(guān)，并在分子水平上證明了碳水化合物代謝在小鱗莖發(fā)生和發(fā)育中的重要性[19]。針對(duì)食用百合蘭州百合的3個(gè)淀粉合成相關(guān)酶(AGPase、SSS、GBSS)的基因克隆，表達(dá)量分析也已見(jiàn)報(bào)道，研究結(jié)果表明淀粉合成酶對(duì)于百合淀粉積累以及種球膨大發(fā)育具有重要作用[20]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】不同種類百合的AGPase表達(dá)量與淀粉含量的相關(guān)性、不同種類百合的AGPase酶活性與淀粉含量的相關(guān)性以及直接針對(duì)切花種球的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究從AGPase的大小亞基基因AGPS及AGPL作為出發(fā)點(diǎn)，克隆并預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)與功能，并通過(guò)研究其基因表達(dá)的模式，測(cè)定淀粉酶活性，使用皮爾遜相關(guān)性分析最終得出淀粉含量，AGPase酶活性，AGPase亞基基因表達(dá)量之間的相關(guān)性，從而更好的了解百合中淀粉合成的影響因素，若AGPase基因與淀粉合成及淀粉含量正相關(guān)，則可作為篩選高淀粉含量百合種質(zhì)的標(biāo)記，為早期快速鑒定百合新種質(zhì)提供新途徑，也可為后續(xù)基因編輯等分子實(shí)驗(yàn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本實(shí)驗(yàn)所采取的研究對(duì)象為亞洲百合川百合及東方百合‘白佩琪’。本實(shí)驗(yàn)所采取的百合鱗片均采集自云南大學(xué)農(nóng)學(xué)院溫室。鱗片分為3個(gè)發(fā)育階段取樣：花期即第1朵花開(kāi)后的2 d進(jìn)行采集；倒苗期即地上莖完全枯萎后的第5天進(jìn)行采集；出苗期即第2年鱗莖出芽后的第5天進(jìn)行采集，所有鱗片均采集鱗莖內(nèi)部鱗片。本實(shí)驗(yàn)所采取的葉片為花期的葉片，采集時(shí)間為花開(kāi)后的2 d進(jìn)行采集。采樣時(shí)每個(gè)樣品采集3份百合組織作為生物學(xué)重復(fù)材料。

1.2 樣品的總RNA提取及cDNA合成

使用北京擎科生物科技有限公司的多糖多酚植物總RNA提取試劑盒在液氮冷凍的研缽中進(jìn)行RNA的提取，提取鱗片時(shí)使用100 mg材料；提取葉片時(shí)，使用200 mg材料。使用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)核酸純度，使用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)量濃度，提取后的RNA置于-80 ℃冰箱保存。取1000 ng RNA，使用北京擎科生物科技有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行基因組DNA的去除以及反轉(zhuǎn)錄。

1.3 基因克隆

以各個(gè)組織的混合樣品提取cDNA作為模板，根據(jù)云南大學(xué)農(nóng)學(xué)院花卉產(chǎn)業(yè)研究中心所測(cè)的轉(zhuǎn)錄組Unigene序列，通過(guò)Blast的方法在nr/nt數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)得到兩類百合的AGPase基因序列信息，設(shè)計(jì)特異性引物(表1)進(jìn)行擴(kuò)增。使用KOD FX酶進(jìn)行克隆，PCR擴(kuò)增體系為20 μL。PCR產(chǎn)物使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳，將目的片段膠回收后連接于T載體上，再轉(zhuǎn)化于DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含卡那霉素抗性的LB平板上。培養(yǎng)24 h后進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選，將陽(yáng)性菌液送到北京擎科生物昆明分公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序所得結(jié)果在NCBI上進(jìn)行CD-search保守結(jié)構(gòu)域分析，在其保守結(jié)構(gòu)域內(nèi)設(shè)計(jì)qPCR引物。

1.4 qPCR及分析

使用Primer6軟件(http://www.premierbiosoft.com)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)的引物由北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行合成(表1)。對(duì)克隆得到的AGPase1 個(gè)小亞基、2 個(gè)大亞基序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，使用設(shè)計(jì)的引物，使用 Takara TB Green?Premix ExTaqTMII 試劑盒(RR820A)，以EIF為內(nèi)參基因，對(duì)所有樣品進(jìn)行 qPCR。得到的結(jié)果使用2-ΔΔCT的方法計(jì)算結(jié)果，數(shù)值使用 GraphPad Prism 8.0.1 進(jìn)行分析及作圖。

表1 引物序列

1.5 淀粉含量及酶活性的測(cè)定

使用索萊寶的淀粉含量檢測(cè)試劑盒(BC0700)，對(duì)所有材料進(jìn)行淀粉含量的測(cè)定；使用索萊寶的AGP活性檢測(cè)試劑盒(BC0430)，對(duì)所有材料進(jìn)行AGPase酶活性的測(cè)定，U為酶活單位，定義為每克組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol 還原型輔酶Ⅱ(NADPH)定義為一個(gè)酶活單位(U)。

1.6 相關(guān)性分析

借助R語(yǔ)言，使用R包Hmisc下的rcorr命令進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性分析(Pearson correlation analysis)，再使用R包c(diǎn)orrplot進(jìn)行可視化展示。對(duì)所有時(shí)期鱗片的AGPase基因相對(duì)表達(dá)量，酶活性及淀粉含量進(jìn)行相關(guān)性分析；葉片由于不是淀粉的貯藏器官，故采用AGPase基因相對(duì)表達(dá)量，酶活性與同時(shí)期的鱗片淀粉含量進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AGPase基因克隆

AGPase是由2個(gè)小亞基基因和2個(gè)大亞基基因組成的異源四聚體，由不同的基因編碼。本次實(shí)驗(yàn)克隆測(cè)序后得到AGPase小亞基基因序列1個(gè)，命名為AGPS；大亞基基因2個(gè)，分別命名為AGPL1及AGPL2，所得保守結(jié)構(gòu)域見(jiàn)圖1。本次克隆到的2類百合各3個(gè)基因都具有PLN02241超級(jí)家族中的PLN02241家族蛋白結(jié)構(gòu)特征。

A：亞洲百合川百合小亞基基因AGPS；B：亞洲百合川百合大亞基基因AGPL1；C：亞洲百合川百合大亞基基因AGPL2；D：東方百合‘白佩琪’小亞基基因AGPS；E：東方百合‘白佩琪’大亞基基因AGPL1；F：東方百合‘白佩琪’大亞基基因AGPL2。

2.2 AGPase相對(duì)表達(dá)量

通過(guò)對(duì)AGPase的3個(gè)基因序列在兩類百合不同時(shí)期的內(nèi)層鱗片中的表達(dá)量分析表明，大亞基基因在不同百合中表達(dá)趨勢(shì)總體是相似的，但相同的發(fā)育階段，兩類百合的表達(dá)量也呈現(xiàn)出一定差異。小亞基基因在東方百合‘白佩琪’中倒苗期表達(dá)量最高，另外兩個(gè)時(shí)期表達(dá)量較低，但亞洲百合川百合倒苗期表達(dá)量最低，另外兩個(gè)時(shí)期都高于倒苗期且另外兩個(gè)時(shí)期表達(dá)量差異不大?？傮w上來(lái)看，大亞基基因的表達(dá)量要高于小亞基基因(圖2～3)。

bc：出苗期；bh：花期；bd：倒苗期，圖中同一基因不同小寫(xiě)字母表示有顯著性差異(P<0.05)，下同。

cc：出苗期；ch：花期；cd：倒苗期。

此外，本研究還測(cè)定了花期時(shí)葉片的3個(gè)AGPase亞基基因相對(duì)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)葉片中的大亞基基因表達(dá)量遠(yuǎn)低于內(nèi)層鱗片，亞洲百合川百合及東方百合‘白佩琪’的AGPL1在內(nèi)層鱗片中的表達(dá)量都約為葉片中的3倍；AGPL2在亞洲百合川百合鱗片中約為葉片的40倍，東方百合‘白佩琪’則約為36倍。但小亞基基因的表達(dá)量?jī)深惏俸铣尸F(xiàn)不同的趨勢(shì)，亞洲百合川百合小亞基基因的表達(dá)量鱗片中約為葉片的一半，而東方百合‘白佩琪’鱗片則是葉片的2倍左右。

2.3 兩類百合的淀粉含量

由圖4可知，不同種類的百合鱗片在發(fā)育過(guò)程中的變化趨勢(shì)一致，但是東方百合‘白佩琪’僅花期含量比亞洲百合川百合高，其余時(shí)期都是亞洲百合川百合淀粉含量更高。同一時(shí)期(花期)不同組織的淀粉含量(圖5)表明，葉片的淀粉含量相對(duì)鱗片低很多，且在該時(shí)期，東方百合‘白佩琪’的葉片及鱗片淀粉含量都高于亞洲百合川百合。

圖5 兩種百合葉片和鱗片在同一時(shí)期(花期)的淀粉含量

2.4 兩類百合AGPase酶活性

由圖6可知，不同種類的百合鱗片在發(fā)育過(guò)程中的酶活性變化趨勢(shì)一致，但是東方百合‘白佩琪’僅倒苗期活性比亞洲百合川百合高，其余時(shí)期均是亞洲百合川百合酶活性更高。

圖6 兩類百合不同時(shí)期內(nèi)層鱗片中的AGPase酶活性

由圖7可知，葉片的酶活性相對(duì)鱗片都很高，且在該時(shí)期，東方百合‘白佩琪’的葉片及鱗片的酶活性都高于亞洲百合川百合。

圖7 兩種百合葉片和鱗片在同一時(shí)期(花期)的AGPase酶活性

2.5 百合淀粉含量與AGPase酶活性、AGPase基因表達(dá)間的相關(guān)性分析

2.5.1 百合鱗莖的AGPase基因、酶活性、淀粉含量的相關(guān)性 相關(guān)性分析(圖8)表明，百合鱗莖的淀粉含量與AGPase酶活性及AGPS基因表達(dá)量高度線性正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.90及0.71。由此可以得出，酶活性及AGPS表達(dá)量都與淀粉含量正相關(guān)。

圖中*表示有顯著性差異(P<0.05)，下同。

2.5.2 百合葉片的AGPase基因、酶活性、同時(shí)期鱗片淀粉含量的相關(guān)性 葉片相關(guān)性分析(圖9)表明，葉片中3個(gè)AGPase基因之間都高度線性正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.96，0.89，0.92，這與鱗片中的3個(gè)基因的相關(guān)性模式不同，說(shuō)明這3個(gè)基因在葉片中與在鱗片中可能存在不同的協(xié)同表達(dá)模式。此外，葉片中AGPase基因表達(dá)量與鱗片淀粉含量相關(guān)性不顯著。

圖9 葉片3個(gè)AGPase基因表達(dá)量及酶活性與同時(shí)期鱗片淀粉含量間的相關(guān)性分析

3 討 論

本次克隆得到的亞洲百合川百合和東方百合‘白佩琪’的3個(gè)AGPase基因序列相似度都在95%以上。此外，本次克隆得到的AGPase基因序列均用Blast進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明，所克隆到的基因與前人在蘭州百合中所克隆基因序列相似度在90%以上[19]。由此可見(jiàn)，不同百合中AGPase相同亞基基因相對(duì)比較穩(wěn)定保守。

本次所測(cè)淀粉含量及酶活性表明，不同類型百合的淀粉含量雖然有差異，但總體差別不大，與蘭州百合及亞洲百合各發(fā)育時(shí)期總碳水化合物變化的趨勢(shì)大體上也是一致的[21]。新鐵炮百合的研究結(jié)果表示，在開(kāi)花前植株鱗莖的淀粉積累達(dá)到最大值，而后淀粉含量開(kāi)始下降[13]，然而本實(shí)驗(yàn)均在倒苗期淀粉含量最高，這一點(diǎn)契合孫紅梅等[21]在之前研究中提出的不同種類百合鱗莖發(fā)育過(guò)程中淀粉積累及轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)不完全相同這一結(jié)論。

本次表達(dá)量分析中發(fā)現(xiàn)兩類百合小亞基基因AGPS的表達(dá)量相較于大亞基基因AGPL1和AGPL2更低，這與蘭州百合的小鱗莖發(fā)過(guò)程中這3個(gè)基因的表達(dá)量結(jié)果相一致[19]。水稻在不同溫度處理下的相對(duì)表達(dá)量結(jié)果也表明，大部分時(shí)期小亞基基因的表達(dá)量都要低于大亞基基因[23]。根據(jù)本次相關(guān)性分析，小亞基基因AGPS表達(dá)量與淀粉累積正相關(guān)，故猜測(cè)這種現(xiàn)象或許是因?yàn)樾喕蛑苯有惺勾x功能而大亞基基因承擔(dān)小亞基基因代謝活性的調(diào)控[24]，所以在淀粉合成旺盛的時(shí)期小亞基基因才高度表達(dá)，而大亞基基因每個(gè)時(shí)期都在表達(dá)。造成表達(dá)量差異的具體原因是否與猜測(cè)想符合，還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

相關(guān)性分析結(jié)果表明，AGPase小亞基基因的表達(dá)量與百合淀粉含量及酶活性都表現(xiàn)出正相關(guān)，說(shuō)明小亞基基因是影響AGPase活性及淀粉合成的關(guān)鍵因子。此外，葉片的酶活性也可以直接影響鱗片淀粉含量，這說(shuō)明鱗莖作為庫(kù)器官，其貯藏的淀粉除了自身合成外，還有很重要的一部分來(lái)自其他源器官。鱗片和葉片中AGPase基因之間的相關(guān)性呈現(xiàn)較大差異，這與玉米中同一AGPase基因不同部位，不同時(shí)間的表達(dá)差異性很大這一結(jié)果一致[25]；與小麥中不同亞基基因存在組織特異性表達(dá)這一結(jié)果也一致[26]，故可以推測(cè)百合AGPase不同亞基基因可能也存在組織特異性表達(dá)。

綜上所述，本研究說(shuō)明亞洲百合川百合和東方百合‘白佩琪’的AGPase基因序列，表達(dá)模式、AGPase酶活性、鱗片淀粉含量等除了小亞基基因表達(dá)模式存在差異外都很相似，故不同類型的百合在對(duì)AGPase進(jìn)行研究時(shí)應(yīng)可參考或直接使用一些其他百合中的相關(guān)結(jié)論。此外，AGPase大小亞基基因表達(dá)量差異及二者的相互作用等在百合中研究較少，值得進(jìn)行深入研究以探明AGPase調(diào)控淀粉合成從而影響種球膨大的基因機(jī)理。另外，相關(guān)性分析的結(jié)果為鱗莖的繁育提供了可通過(guò)調(diào)節(jié)淀粉合成限速酶小亞基基因表達(dá)及調(diào)節(jié)其酶活性以促進(jìn)百合鱗莖膨大的實(shí)踐思路。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)對(duì)東方百合‘白佩琪’及亞洲百合川百合的AGPase基因的克隆及qPCR、淀粉含量及酶活性的測(cè)定得到這兩類百合AGPase基因序列，表達(dá)量，不同時(shí)期淀粉含量及AGPase酶活性以及在兩類百合中的異同。兩類百合不同時(shí)期的淀粉含量及酶活性變化趨勢(shì)相同，但同一發(fā)育時(shí)期不同類型百合的淀粉含量及酶活性存在差異。兩類百合大小亞基基因的表達(dá)量在鱗莖不同時(shí)期的表達(dá)模式是相似的，但同一發(fā)育時(shí)期不同類型百合的表達(dá)量存在差異。AGPase小亞基基因的表達(dá)量與淀粉含量正相關(guān)。