紅三葉種子對納米鐵的響應(yīng)研究

李羽超莫海鳳王田祁兆奔劉權(quán)

(1.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.平?jīng)鍪修r(nóng)業(yè)科學(xué)院，甘肅 平?jīng)?744000)

前言

近年來，納米材料在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用越來越廣泛[1]。許多研究表明施用納米肥料能促進(jìn)種子萌發(fā)、減少化肥施用、提高作物抗性、增加產(chǎn)量、改善品質(zhì)[2-4]。納米鐵對植物生長的影響主要是通過提高光合速率和增強(qiáng)植物抗氧化能力兩條途徑[5]。Waqas等[6]發(fā)現(xiàn)，納米鐵能通過提高干旱脅迫的亞麻植物中光合色素水平，增強(qiáng)抵抗干旱脅迫的能力。納米鐵氧化物能通過提高玉米細(xì)胞中鐵含量，增強(qiáng)植物抗氧化能力，顯著促進(jìn)生長，增加地上部可溶性蛋白含量[7]。有研究認(rèn)為納米鐵作為種子引發(fā)劑，能提高柳枝稷種子活力并促進(jìn)幼苗生長，是通過縮短吸漲后的滯后時間、活化發(fā)芽相關(guān)的酶活性、增加萌發(fā)代謝物的積累、修復(fù)種子損傷和滲透調(diào)節(jié)5個方面實現(xiàn)種子萌發(fā)的促進(jìn)作用[8]。Rakesh等[9]證實了用50ppm納米Fe3O4代替?zhèn)鹘y(tǒng)鐵源，能顯著提高水稻種子的發(fā)芽率、活力指數(shù)、含水量和干重。

紅三葉(Trifolium pratense L)，是一種利用價值很高的牧草，其產(chǎn)量高，品質(zhì)優(yōu)良，在國內(nèi)外分布廣泛，是家畜的優(yōu)良飼料。紅三葉具有很高的藥用價值，其提取物中的異黃酮具有防止乳腺癌，提高機(jī)體免疫功能，抑制前列腺增生，預(yù)防骨質(zhì)疏松，緩解更年期綜合癥等作用[10,11]，而且是該植物種群競爭和環(huán)境適應(yīng)的主要物質(zhì)之一[12]。紅三葉是建植混播草地的優(yōu)良草種，但實踐表明紅三葉存在幼苗不易順利出土[13]，苗期生長緩慢的問題[14]，需要采取一些措施來提高紅三葉種子活力。

利用納米鐵作為種子引發(fā)劑，提高紅三葉種子萌發(fā)效率和幼苗生長活力的相關(guān)研究尚未見報道。本研究所用的納米鐵材料為由Fe3O4包裹的鐵單質(zhì)，同時具有單質(zhì)鐵和氧化鐵的特性。設(shè)置4個濃度的納米鐵(0mg·L-1、20mg·L-1、50mg·L-1、100mg·L-1)處理，觀察對2個品種紅三葉種子萌發(fā)和幼苗生長特性的影響，旨在探究納米鐵在紅三葉種子萌發(fā)時期對其影響及作用機(jī)制，為牧草種植管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料：本試驗所用400 mg·L-1納米鐵(粒徑43.5nm)來自甘肅谷碩納米農(nóng)業(yè)科技有限責(zé)任公司。“海發(fā)”(HF)、“瑞德”(RD)紅三葉種子購買于蘭州種子市場。

1.2 種子發(fā)芽試驗

先用清水清洗種子5min，用2%次氯酸鈉溶液浸泡30min，再用蒸餾水清洗，待用。

用蒸餾水將400mg·L-1納米鐵溶液稀釋至20mg·L-1、50mg·L-1、100mg·L-1，用吸管取20mg·L-1、50mg·L-1、100mg·L-1的納米鐵溶液5mL放入鋪有2層濾紙、內(nèi)徑為9cm的一次性培養(yǎng)皿中，標(biāo)記各處理。將紅三葉種子擺放入培養(yǎng)皿，蓋上培養(yǎng)皿蓋子，置于25°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照條件為12h·d-1。每日向培養(yǎng)皿添加適量蒸餾水，保持濾紙濕潤。以未添加納米鐵溶液的作為對照。每個處理重復(fù)3次，每個培養(yǎng)皿放置100粒紅三葉種子。

將培養(yǎng)得到的植物幼苗全株于60℃下烘干，粉碎得到植物樣品。取10mg植物樣品，加入300μL40%乙醇溶液，在50℃下超聲提取30min，得到待測液，進(jìn)行異黃酮和多糖的測定[15]。

1.3 數(shù)據(jù)采集

1.3.1 種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢的測定

分別于紅三葉種子培養(yǎng)第1天、第2天、第3天、第4天、第5天和第7天，統(tǒng)計種子發(fā)芽情況。利用第3天發(fā)芽情況計算發(fā)芽勢，第7天計算發(fā)芽率。于第4天、第5天、第6天、第7天和第10天，分別從每個培養(yǎng)皿取5株長勢良好的紅三葉幼苗，測定芽高、根長和生物量。

種子發(fā)芽率(%)=發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%

發(fā)芽指數(shù)的計算：

GI=Σ(Gt/Dt)

式中，Gt為發(fā)芽試驗終期內(nèi)每日發(fā)芽數(shù)；Dt為發(fā)芽日數(shù)；Σ為總和。

活力指數(shù)的計算：

VI=GI×S

式中，GI為發(fā)芽指數(shù)；S為幼苗重量，g。

1.3.2 幼苗異黃酮含量的測定

紅三葉異黃酮含量的測定采用分光光度法。以芒柄花素為標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)確配制濃度為0.057mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別準(zhǔn)確移取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1mL、2mL、3mL于7個10mL容量瓶，用40%乙醇分別定容，搖勻后于275nm處測定吸光值，參比為空白試劑。取樣品提取液按上述方法于275nm處測定吸光值，計算樣品中的異黃酮含量。

1.3.3 幼苗多糖含量的測定

多糖含量的測定采用苯酚-硫酸比色法[16,17]。用蒸餾水配制0.1mg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，分別取0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL和0.5mL的0.1mg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液于10mL的試管中，分別加入0.5mL、0.4mL、0.3mL、0.2mL、0.1mL和0mL蒸餾水，再依次向各試管中加入0.5mL濃度為5%的苯酚溶液和2.5mL濃硫酸，搖勻，室溫靜置30min，測定每個樣品于490nm處的吸光值。取0.1mL的樣品溶液置于10mL試管，加入0.4mL蒸餾水，如上操作計算樣品中的多糖含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2016軟件整理數(shù)據(jù)，SPSS Statistic 24.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和差異顯著性檢驗，顯著性水平為P<0.05。使用單因素(One-way ANOVA)和Duncan法進(jìn)行方差比較和多重比較。

2 試驗結(jié)果

本試驗通過分析檢測納米鐵對紅三葉種子在不同天數(shù)發(fā)芽率的變化，以及幼苗芽高、根長、生物量和次生代謝物的影響，研究其對紅三葉種子萌發(fā)的影響情況。

2.1 納米鐵對種子發(fā)芽的影響

為了充分了解納米鐵的作用效果，本文選用了發(fā)芽率具有顯著性差異的2個紅三葉品種進(jìn)行，“海發(fā)”種子在不同處理下的發(fā)芽率均顯著高于“瑞德”種子，約60%的“海發(fā)”種子在試驗第1天就已萌發(fā)，而“瑞德”種子在第1天的發(fā)芽率僅有約30%，在第2天才能達(dá)到60%左右的發(fā)芽率。如圖1所示，雖然納米鐵在第1天和第2天對2個品種的發(fā)芽率都有一定的促進(jìn)作用，特別是高濃度處理，但整體而言，納米鐵對“瑞德”與“海發(fā)”種子的發(fā)芽率無顯著影響。

注：a、b分別為“瑞德”和“海發(fā)”種子的發(fā)芽率；D1、D2、D3、D4、D5、D7表示天數(shù)；0、20、50、100表示不同濃度的納米鐵處理。

2.2 納米鐵對幼苗生長的影響

2.2.1 芽高

如圖2所示，2個品種幼苗生長在第4天、第5天、第6天和第7天存在顯著差異，未添加納米鐵處理中“瑞德”品種的芽高均顯著低于“海發(fā)”。納米鐵處理后的“瑞德”在第4天芽高顯著增加，和“海發(fā)”幼苗無顯著性差異，但在隨后的時間里與未添加處理無顯著差異，“瑞德”芽高均小于“海發(fā)”。在第10天時，2個品種芽高已無顯著性差異。

綜合幼苗生長4～10d的情況來看，納米鐵對“瑞德”幼苗影響相對較大，特別是在第4天。而“海發(fā)”幼苗在施加20mg·L-1納米鐵的處理下芽高略高于其他處理。

注：小寫字母表示與對照組在P<0.05水平差異顯著；下同。

2.2.2 根長

如圖3所示，在幼苗生長的4～10d中，各處理下“海發(fā)”幼苗的根長均極顯著高于“瑞德”幼苗(P<0.01)。

與對照相比，不同濃度的納米鐵對“海發(fā)”幼苗的根長無顯著性影響。對于“瑞德”幼苗，僅在幼苗生長第4天時，20mg·L-1處理根長顯著高于對照。綜合幼苗生長4～10d的情況來看，“瑞德”幼苗在100mg·L-1的納米鐵處理下根長略高于其他處理，“海發(fā)”幼苗在50mg·L-1的納米鐵處理下根長略高于其他處理。

2.2.3 生物量

納米鐵對幼苗生物量的影響如圖4所示，幼苗生長第4天時納米鐵處理的“瑞德”幼苗生物量均顯著高于對照組，但幼苗生長5～10d時，“瑞德”各處理之間無顯著性差異。“海發(fā)”幼苗生長4～10d中，不同處理下幼苗生物量均無顯著性差異。2種品種相比，相同處理下“海發(fā)”幼苗生物量顯著高于“瑞德”。

從圖3中觀察可得，幼苗生長至第6天前，施加一定濃度的納米鐵的幼苗生物量略高于對照組，但在生長第7天后，施加納米鐵的處理生長速率放緩，對照組生物量略高于施鐵處理。

圖3 納米鐵對紅三葉根長的影響

圖4 納米鐵對紅三葉生物量的影響

從表1可知，2種品種相比，“海發(fā)”的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均顯著高于“瑞德”，但同一品種不同處理之間種子的發(fā)芽指數(shù)無顯著差異，說明納米鐵對紅三葉種子發(fā)芽無顯著性影響?！叭鸬隆钡幕盍χ笖?shù)遠(yuǎn)低于“海發(fā)”，約為“海發(fā)”的1/2。納米鐵處理對紅三葉種子活力具有一定影響，“瑞德”100mg·L-1處理顯著高于對照，“海發(fā)”50mg·L-1處理顯著高于對照。

2.3 納米鐵對幼苗代謝的影響

植物的次生代謝反映了植物適應(yīng)生態(tài)環(huán)境的結(jié)果，是植物用于提高自身抗性、調(diào)節(jié)植物生長的一個重要方式[28]。因為幼苗量少，所有其多糖和異黃酮的測定無法進(jìn)行重復(fù)性試驗，但目前的數(shù)據(jù)結(jié)果仍能明確反映出納米鐵對幼苗生長階段的影響。

2.3.1 多糖含量的變化

種子萌發(fā)后幼苗的生長會消耗種子中儲存的營養(yǎng)物質(zhì)，從圖4中觀察可得，不同處理下種子萌發(fā)后第5天、第6天均有多糖含量迅速提升的階段。紅三葉幼苗多糖含量在生長過程中呈現(xiàn)下降趨勢，這可能與多糖作為種子中重要的能量存儲物質(zhì)有關(guān)。其中，“海發(fā)”的多糖含量大多高于“瑞德”，這與其幼苗生物量情況相符?！叭鸬隆?00mg·L-1處理和“海發(fā)”50mg·L-1的多糖含量均表現(xiàn)為較低水平，而這2個處理的活力指數(shù)是在不同處理中最高。但值得注意的是，“海發(fā)”在第7天和第10天時，納米鐵處理明顯增加了幼苗多糖含量。

“瑞德”幼苗對照組4～10d的多糖含量經(jīng)歷先減少后增加再減少的過程，代表了種子生長消耗糖類、脂質(zhì)轉(zhuǎn)化為糖類、糖類再消耗用于生長的過程。100mg·L-1納米鐵促進(jìn)了“瑞德”幼苗的萌發(fā)和初期生長，但發(fā)育到6～10d后，“瑞德”幼苗的多糖含量顯著低于其他處理，這可能是因為種子萌發(fā)和生長導(dǎo)致種子中儲存的營養(yǎng)物質(zhì)消耗較大，而50mg·L-1處理處理雖然在生長的7～10d也存在消耗較大的問題，但在7～10d多糖含量已經(jīng)表現(xiàn)出明顯的上升趨勢。

表2 納米鐵對紅三葉幼苗多糖含量的影響

2.3.2 異黃酮含量的變化

異黃酮是紅三葉體內(nèi)重要的抗逆物質(zhì)，具有抗氧化等活性，幼苗階段植株對外界培養(yǎng)條件響應(yīng)敏感，因此波動較大。如表3所示，隨著幼苗生長，紅三葉體內(nèi)的異黃酮含量總體呈上升趨勢。納米鐵對2個品種異黃酮含量影響情況不同，對照的“瑞德”異黃酮含量保持在相對較高的水平上，而對于“海發(fā)”50mg·L-1處理下含量較高。20mg·L-1處理下，2個品種的異黃酮含量均處于較低水平。

2.3.3 相關(guān)性分析

從表4相關(guān)性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紅三葉生長指標(biāo)(芽高、根長、生物量)之間均為極顯著相關(guān)，異黃酮對紅三葉根長和生物量的發(fā)展具有顯著的促進(jìn)作用。雖然多糖與各項指標(biāo)之間無顯著相關(guān)性，但在生長過程隨著芽高、根長和生物量的增加，多糖呈現(xiàn)出負(fù)增長，與其作為能量物質(zhì)的特性相關(guān)。

表3 納米鐵對紅三葉幼苗異黃酮含量的影響

表4 紅三葉幼苗各指標(biāo)間的相關(guān)性分析

3 討論

種子活力是優(yōu)質(zhì)種子的基本特點，其不僅包括種子的發(fā)芽能力，還涉及到種子幼苗的成活率和生長力乃至作物產(chǎn)量[18]。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，納米鐵對紅三葉種子發(fā)芽率無顯著影響，但施加納米鐵能顯著提高種子的活力指數(shù)。

幼苗生長也是種子活力的表現(xiàn)之一，納米鐵對2個品種紅三葉的芽高、根長、生物量均無顯著影響。施加50mg·L-1納米鐵的“海發(fā)”幼苗的芽高和根長均較對照組略高，而不同濃度納米鐵對“瑞德”幼苗的生長指標(biāo)均無促進(jìn)作用，不過第4天時，施加納米鐵的“瑞德”幼苗芽高均顯著高于對照組，可能是因為納米鐵使得“瑞德”種子提前發(fā)芽。綜合“瑞德”與“海發(fā)”幼苗的生長情況，施加納米鐵能夠促進(jìn)幼苗地上部分的生長，但對幼苗的根系發(fā)育無顯著影響。這與Sundaria等[19]的研究結(jié)果一致，用一定濃度的納米Fe2O3引發(fā)小麥可以顯著增加小麥的株高。這可能是由于納米鐵易被植物吸收，促進(jìn)了植物中葉綠素的合成，從而加快了地上部分的生長。

異黃酮作為紅三葉的重要功能成分物質(zhì)，與根長和生物量積累具有顯著正相關(guān)，對于提高植物防御能力和種群競爭力都有重要意義。紅三葉種子的多糖作為能量存儲物質(zhì)，而且最新研究結(jié)果表明，紅三葉多糖還具有顯著的抗氧化活性[15]，與異黃酮一起對幼苗生長提高防御和保護(hù)。納米鐵處理對紅三葉中異黃酮和多糖含量未見顯著影響。

本文結(jié)果不夠顯著，可能是因為濃度較低。但是對于納米肥料而言，如果大量試用就不夠經(jīng)濟(jì)，也無法體現(xiàn)納米肥料綠色高效的特點。本研究結(jié)果表明，納米鐵肥對紅三葉種子發(fā)芽和幼苗生長的促進(jìn)作用不夠顯著。

4 結(jié)論

本文研究結(jié)果表明，納米鐵應(yīng)用于紅三葉種子種植過程中較為安全，不僅無顯著性抑制作用，還有一定的促進(jìn)效果。100mg·L-1以內(nèi)的納米鐵處理對紅三葉種子發(fā)芽率影響較小，對幼苗生長有一定促進(jìn)作用，但不同品種影響效果相差較大。此外，紅三葉異黃酮代謝與幼苗根長、生物量積累有著顯著正相關(guān)，納米鐵對不同品種紅三葉的影響效果也不同。本文結(jié)果將對紅三葉種植過程中納米肥料的精準(zhǔn)施用提供理論指導(dǎo)。