辣椒炭疽病菌Colletotrichum nigrum 鑒定、生物學(xué)特性及藥劑敏感性研究

陳鵬宇，楊立輝，翟長(zhǎng)蘭，田慧迪，張 敏，白慶榮，2，趙廷昌

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 長(zhǎng)春 130118；2.綠色農(nóng)藥全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·綠色農(nóng)藥與農(nóng)業(yè)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·貴州大學(xué)精細(xì)化工研究開(kāi)發(fā)中心·貴州大學(xué) 貴陽(yáng) 550025；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 北京 100193）

辣椒炭疽病是由炭疽菌屬（Colletotrichumspp.）真菌引起的一種常見(jiàn)病害，可導(dǎo)致幼苗死亡、葉片和果實(shí)腐爛，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)，病果率在30%～40%[1]，嚴(yán)重影響辣椒的產(chǎn)量和品質(zhì)。炭疽菌屬（Colletotrichum）真菌是世界上重要的植物病原真菌群[2]，無(wú)性態(tài)為無(wú)性態(tài)真菌（Anamorphic fungi）炭疽屬（Colletotrichum），有性態(tài)為子囊菌門(mén)（Ascomycota）小叢殼屬（Glomerella）[3]。

在辣椒炭疽菌的早期分類(lèi)中，根據(jù)病害癥狀分為紅色炭疽病菌、黑色炭疽病菌和黑點(diǎn)炭疽病菌[4]。目前在我國(guó)天津、四川、貴州、廣東、甘肅、陜西等地均有辣椒炭疽病的報(bào)道，引起辣椒炭疽病的病原菌主要包括C.acutatum（尖孢炭疽菌）、C.truncatum（平頭炭疽菌）、C.spinaciae（菠菜炭疽菌）、C.boninense（博寧炭疽菌）、C.gloeosporioides（膠孢炭疽菌）、C.siamense（暹羅炭疽菌）、C.fructicola（果生炭疽菌）、C.scovillei（斯高維爾炭疽菌）、C.karstii（喀斯特炭疽菌）[5-11]。

2021 年辣椒炭疽病在吉林省多地和內(nèi)蒙古自治區(qū)東部地區(qū)的辣椒主產(chǎn)區(qū)大面積發(fā)生，對(duì)辣椒產(chǎn)業(yè)造成了十分嚴(yán)重的危害。筆者所在團(tuán)隊(duì)于2021年在吉林省洮南市、雙遼市、長(zhǎng)春市農(nóng)安縣、松原市長(zhǎng)嶺縣和內(nèi)蒙古自治區(qū)通遼市開(kāi)魯縣的辣椒主產(chǎn)區(qū)進(jìn)行辣椒炭疽病病樣的采集，對(duì)病樣進(jìn)行分離純化，明確病原菌分類(lèi)地位，并對(duì)主要病原菌生物學(xué)特性及藥劑敏感性進(jìn)行研究，以期為辣椒炭疽病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2021 年9—10 月對(duì)吉林省及內(nèi)蒙古自治區(qū)東部地區(qū)的辣椒主產(chǎn)區(qū)進(jìn)行辣椒病樣采集，記錄發(fā)病特征并拍照，標(biāo)本保存于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理學(xué)教研室。分離物致病性測(cè)定供試菌株：在不同地區(qū)分離菌株中隨機(jī)挑選1 株，分別為HS4Y- 2- 19、DSD2Y- 1- 41、QTXB2Y- 2- 5- 1、QJB1-2-36、HJ1Y-2-50、HLHY9-1-4-1。分子生物學(xué)測(cè)序供試菌株：在不同采樣點(diǎn)分離菌株中隨機(jī)選取以下菌株，分別為HS4Y-2-19、DSD2Y-1-41、MX6-1-45、QTN2Y-2-4-2、QTXB2Y-2-5-1、HLHY9-1-4-1、BPY1-3-49、HJY3-1-55、BPY3-2-60、QTN1Y-1-35、HJY1-2-50、QJB1-2-36。生物學(xué)特性及室內(nèi)藥劑敏感性供試菌株為HS4Y-2-19。選用25 種化學(xué)殺菌劑作為供試藥劑，藥劑名稱(chēng)及生產(chǎn)廠(chǎng)家見(jiàn)表1。供試試劑有β-巰基乙醇、乙二胺四乙酸（EDTA）、無(wú)水乙醇、75%乙醇、瓊脂糖、Ezup 柱式真菌基因組DNA 抽提試劑盒（生工生物工程上海股份有限公司）。

表1 供試藥劑

供試培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato Dextrose Agar，PDA）、燕麥瓊脂培養(yǎng)基（Oatmeal Agar，OA）、水瓊脂培養(yǎng)基（Water Agar，WA）、西紅柿燕麥瓊脂培養(yǎng)基（Tomato Oatmeal Agar，TOA）、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato Sucrose Agar，PSA）、胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基（Carrot Agar，CA）、玉米粉瓊脂培養(yǎng)基（Corn Meal Agar，CMA）、V8 碳酸鈣瓊脂培養(yǎng)基（V8 Agar，V8）、查氏培養(yǎng)基（Czapek-Dox Agar，Czapek）。

供試儀器為光學(xué)顯微鏡（ZEISS ImagerA.2）、超景深顯微鏡（VHX-600）、GI80DWS 高壓蒸汽滅菌鍋（上海言和）、SW-CJ-2D 型雙人凈化工作臺(tái)（浙江蘇凈凈化）、BIC-300 人工氣候培養(yǎng)箱（上海博訊）、DHG-9140A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海申賢恒溫設(shè)備廠(chǎng)）、BCD-217CHG 立式冷藏柜（河南新飛電器有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 辣椒炭疽病病原菌的分離純化 2021 年9—11 月，將采集到的辣椒炭疽病標(biāo)本用無(wú)菌水清洗并消毒后，用滅菌剪刀剪取病健交界處的組織塊5 mm×5 mm，組織塊經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇消毒，無(wú)菌水漂洗3 次，在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)將表面水分晾干后，放入事先準(zhǔn)備好的PDA 平板中，在恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃暗培養(yǎng)。待組織塊在PDA 平板上長(zhǎng)出菌絲后，用滅菌牙簽在菌落邊緣挑取菌絲塊放在新的PDA 平板中，置于恒溫培養(yǎng)箱25 ℃暗培養(yǎng)。

1.2.2 分離物的致病性測(cè)定 2021 年11 月，采用菌絲侵染和孢子侵染2 種方式進(jìn)行致病性測(cè)定。待分離物在PDA 培養(yǎng)基上長(zhǎng)至直徑為培養(yǎng)皿2/3時(shí)，選取不同地區(qū)的代表菌株1 株，用打孔器制備直徑為6 mm 的菌餅備用，另用無(wú)菌水將孢子洗脫制備成濃度為1.0×106個(gè)·mL-1孢子懸液備用。用無(wú)菌水將新鮮辣椒果實(shí)（辣帝1 號(hào)，山東壽禾種業(yè)有限公司）表面沖洗干凈后，使用75%乙醇對(duì)其進(jìn)行表面消毒并使用無(wú)菌接種針制造細(xì)微傷口，分別將制備好的菌餅貼在細(xì)微傷口處；孢子懸浮液涂抹在細(xì)微傷口處，以無(wú)菌水作為對(duì)照，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，逐日觀察發(fā)病情況。

1.2.3 病原菌形態(tài)特征觀察 2021 年11 月，在PDA 培養(yǎng)基上觀察菌落生長(zhǎng)狀況。用光學(xué)顯微鏡（ZEISS ImagerA.2）觀察分生孢子器和分生孢子的形態(tài)并拍照記錄，用超景深顯微鏡（VHX-600）測(cè)量孢子大?。y(cè)量100 個(gè)），初步確定病原菌的分類(lèi)地位。

1.2.4 病原菌的分子生物學(xué)鑒定 2021 年11－12 月，在吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)經(jīng)濟(jì)作物病害與生物防治研究室內(nèi)進(jìn)行病菌分子生物學(xué)鑒定。采用Ezup 柱式真菌基因組DNA 抽提試劑盒提取不同地區(qū)的代表菌株基因組DNA（供試代表菌株信息見(jiàn)表2），選用ITS、ACT、TUB2、GAPDH和CHS-1進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，各基因擴(kuò)增所需引物見(jiàn)表3。

表2 供試代表菌株

表3 引物信息

引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，25.0 μL 的反應(yīng)體系為T(mén)aqmixture 12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，DNA 模板1.0 μL 以及9.5 μL 的dd H2O，擴(kuò)增程序見(jiàn)表4。

表4 PCR 擴(kuò)增信息

PCR 產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到清晰且單一的條帶委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序并拼接。將所得序列在NCBI網(wǎng) 站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）上與Gen-Bank 中相關(guān)序列進(jìn)行一致性比對(duì)分析，使用MAGEX軟件最大似然法中的ML 方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.5 病原菌的生物學(xué)特性 2022 年1 月，對(duì)病原菌進(jìn)行生物學(xué)特性的研究，具體內(nèi)容如下：

（1）不同培養(yǎng)基對(duì)病菌生長(zhǎng)的影響 將供試菌株HS4Y-2-19 制成直徑為6 mm 的菌餅放置在PDA、OA、WA、TOA、PSA、CA、CMA 和V8 培養(yǎng)基制成的平板中央，每個(gè)平板定量15 mL，25 ℃黑暗條件下恒溫培養(yǎng)，3 次重復(fù)，8 d 后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑[12]。

（2）不同碳源對(duì)病菌生長(zhǎng)的影響 以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以等量的葡萄糖、可溶性淀粉、D-麥芽糖、D-果糖、木糖醇、D-甘露糖、山梨醇、D-甘露醇、乳糖代替蔗糖。每個(gè)平板定量15 mL 培養(yǎng)基，25 ℃黑暗條件下恒溫培養(yǎng)，3 次重復(fù)，8 d 后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

（3）不同氮源對(duì)病菌生長(zhǎng)的影響 以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以等量的L-丙氨酸、L-賴(lài)氨酸、蛋白胨、甘氨酸、磷酸二氫銨、L-胱氨酸、硝酸銨、硫酸銨、硝酸鉀、尿素替換硝酸鈉。每個(gè)平板定量15 mL 培養(yǎng)基，25 ℃黑暗條件下恒溫培養(yǎng)，3 次重復(fù)，8 d 后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

（4）不同溫度對(duì)病菌生長(zhǎng)的影響 以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，每個(gè)平板定量15 mL 培養(yǎng)基，分別置于4、10、15、20、25、30、35 ℃培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)，3 次重復(fù)，8 d 后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

（5）不同光照對(duì)病菌生長(zhǎng)的影響 以PDA 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，每個(gè)平板定量15 mL 培養(yǎng)基，分別置于25 ℃全光照、12 h 光照/12 h 黑暗、全黑暗條件下恒溫培養(yǎng)，3 次重復(fù)，8 d 后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

（6）不同pH 值對(duì)病菌生長(zhǎng)的影響 以PDA培養(yǎng)基為 基 礎(chǔ) 培 養(yǎng) 基，用HCl（1 mol?L-1）和NaOH（1 mol?L-1）調(diào)試培養(yǎng)基pH 值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 和11.0，每個(gè)平板定量15 mL培養(yǎng)基，25 ℃黑暗條件下恒溫培養(yǎng)，3 次重復(fù)，8 d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.2.6 病菌對(duì)藥劑的敏感性測(cè)定 2022 年3 月，分別采用菌絲生長(zhǎng)速率法和孢子萌發(fā)法測(cè)定病菌對(duì)藥劑的敏感性[13]。

（1）菌絲生長(zhǎng)速率法 向50 mL 三角瓶中注入27 mL 的PDA 培養(yǎng)基，高壓蒸汽滅菌鍋滅菌。將不同殺菌劑稀釋為1×103mg·L-1、1×102mg·L-1、1×10 mg·L-1、1 mg·L-1、1×10-1mg·L-1、1×10-2mg·L-16個(gè)質(zhì)量濃度，按照PDA 培養(yǎng)基、藥液的體積比為9∶1 制備成混藥平板，每個(gè)平板定量10 mL 混藥培養(yǎng)基，空白對(duì)照組以等量無(wú)菌水代替藥液，每個(gè)濃度設(shè)3 次重復(fù)。將供試菌株HS4Y-2-19 制成直徑為6 mm 的菌餅放置在混藥平板中央，置于25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗條件下恒溫培養(yǎng)8 d 后，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

抑菌率/%=（對(duì)照組菌落直徑－處理組菌落直徑）/（對(duì)照組菌落直徑－菌餅原始直徑）×100。

計(jì)算出抑制率后，通過(guò)SPSS25 軟件計(jì)算不同藥劑對(duì)病原菌的抑制中濃度（EC50）并建立毒力回歸方程，得出相關(guān)系數(shù)。

（2）孢子萌發(fā)法 向50 mL 三角瓶中注入27 mL 的WA 培養(yǎng)基，高壓蒸汽滅菌鍋滅菌。不同殺菌劑的稀釋濃度如下：12%苯甲·氟酰胺SC 和10%苯醚甲環(huán)唑WG 質(zhì)量濃度配置分別為1×104、5×103、2.5×103、1.67×103、1.25×103、1×103mg·L-1，其他殺菌劑配置質(zhì)量濃度分別為1×103、1×102、10、1、1×10-1、1×10-2mg·L-1，按照WA 培養(yǎng)基、藥液的體積比為9∶1 制備成混藥平板，每個(gè)平板定量10 mL 混藥培養(yǎng)基，空白對(duì)照組以等量無(wú)菌水代替藥液。待病原菌在PDA 培養(yǎng)基上長(zhǎng)至8 d 時(shí)，用無(wú)菌水洗平板制備成濃度為1.0×106個(gè)·mL-1孢子懸浮液。用移液器吸取100 μL 孢子懸浮液滴在不同濃度的混藥平板上并使用一次性涂布器將孢子懸浮液均勻涂布，置于25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗條件下恒溫培養(yǎng)10 h 后，在顯微鏡下隨機(jī)觀察多個(gè)視野，記錄孢子萌發(fā)情況并計(jì)算抑制率，每個(gè)處理觀察100 個(gè)孢子以上。

孢子萌發(fā)率/%=（萌發(fā)孢子總數(shù)/孢子總數(shù)）×100；

孢子萌發(fā)抑制率/%=（對(duì)照孢子萌發(fā)率－處理孢子萌發(fā)率）/對(duì)照孢子萌發(fā)率×100。

計(jì)算出相對(duì)抑制率后，通過(guò)SPSS25 軟件計(jì)算不同藥劑對(duì)病原菌的抑制中濃度（EC50）并建立毒力回歸方程，得出相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離結(jié)果

將采集到的標(biāo)本通過(guò)組織分離得到212 個(gè)菌株，見(jiàn)表5。

表5 病原菌信息統(tǒng)計(jì)

2.2 分離物致病性測(cè)定

辣椒炭疽病在田間侵染辣椒果實(shí)時(shí)產(chǎn)生橢圓形或不規(guī)則形病斑，初期表面稍凹陷，病斑中部黑色并產(chǎn)生黑色顆粒，邊緣黃色（圖1-A）。將供試菌株HS4Y- 2- 19、DSD2Y- 1- 41、QTXB2Y- 2- 5- 1、QJB1-2-36、HJY1-2-50、HLHY9-1-4-1 接種到新鮮的健康青尖椒果實(shí)上（辣帝1 號(hào)），以無(wú)菌水作為空白對(duì)照，接種3 d 后3 個(gè)接種點(diǎn)開(kāi)始表現(xiàn)發(fā)病癥狀，接種7 d 后完全發(fā)病，產(chǎn)生黑色、中間處略凹陷、圓形、橢圓形或不規(guī)則形病斑，發(fā)病部位伴生黑色小顆粒（圖1-B、C），空白對(duì)照無(wú)發(fā)病跡象（圖1-D），接種發(fā)病的植株經(jīng)再分離，獲得與接種菌株形態(tài)一致的分離物，證明接種用的分離物為該病害的病原菌。

圖1 辣椒炭疽病田間發(fā)病癥狀及致病性測(cè)定結(jié)果

2.3 辣椒炭疽病病原菌鑒定

2.3.1 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定 將病原菌放置在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，置于25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗條件下恒溫培養(yǎng)，初期菌落呈淡粉色（圖2），在菌落表面形成黑色微菌核和分生孢子盤(pán)，分生孢子盤(pán)著生剛毛，分生孢子橢圓形、單孢、無(wú)色、中間較兩端略窄，分生孢子大小為（11.84～23.41）μm×（2.29～8.47）μm，菌絲體附著孢灰黑色，形狀不規(guī)則，與C.nigrum形態(tài)特征一致。

圖2 菌株HS4Y-2-19 在PDA 培養(yǎng)基上的形態(tài)學(xué)特征

2.3.2 病原菌分子生物學(xué)鑒定 將供試菌株HS4Y-2-19 測(cè)序結(jié)果在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST 一致性比對(duì)，結(jié)果表明，該菌株的ITS、TUB2、ACT、CHS-1、GAPDH序列與GenBank 中C.nigrumCBS 132451 各序列（JX546846、JX546893、JX546654、JX546701、JX546750）的 一 致 性 均 為100%。

基于12 個(gè)供試菌株的ITS、TUB2、ACT、CHS-1和GAPDH的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)發(fā)現(xiàn)，供試菌株與炭疽菌屬C.nigrum的遺傳距離最近（圖3），支持率為99%且聚在同一分支，表明供試菌株均為C.nigrum。結(jié)合培養(yǎng)性狀和形態(tài)觀察，以及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，確定筆者在吉林及內(nèi)蒙古東部地區(qū)辣椒炭疽病發(fā)病株上所分離純化的菌株為C.nigrum。

圖3 基于ITS、TUB2、ACT、GAPDH 和CHS-1 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4 不同條件對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

2.4.1 不同培養(yǎng)基對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 供試菌株HS4Y-2-19 在8 種培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng)，在OA 培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度最快，顯著大于在其他培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)速度；在CA 培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度最慢，顯著小于其他培養(yǎng)基（圖4-A）。

2.4.2 不同碳源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 供試菌株HS4Y-2-19 在不同碳源條件下均可生長(zhǎng)，以D-麥芽糖為碳源的菌絲生長(zhǎng)速度最快，與以淀粉為碳源的差異不顯著；以D-果糖為碳源的菌絲生長(zhǎng)速度最慢，與以乳糖為碳源的差異不顯著（圖4-B）。

2.4.3 不同氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 供試菌株HS4Y-2-19 在不同氮源條件下均可生長(zhǎng)，在以蛋白胨為氮源的菌絲生長(zhǎng)速度最快，顯著大于其他氮源的菌絲生長(zhǎng)速度；在以L(fǎng)-胱氨酸為氮源的菌絲生長(zhǎng)速度最慢，顯著小于其他氮源的菌絲生長(zhǎng)速度（圖4-C）。

2.4.4 不同溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 供試菌株HS4Y-2-19 在不同溫度下菌絲生長(zhǎng)速度存在一定差異，在20 ℃菌絲生長(zhǎng)速度最快，顯著大于其他溫度條件下的菌絲生長(zhǎng)速度，在4 ℃和35 ℃菌絲停止生長(zhǎng)（圖4-D）。

2.4.5 不同光照對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 供試菌株HS4Y-2-19 在不同光照下菌絲都可以生長(zhǎng)，在全黑暗條件下菌絲生長(zhǎng)速度最快，與其他光照條件下菌絲生長(zhǎng)速度相比差異不顯著（圖4-E）。

2.4.6 不同pH 值對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響供試菌株HS4Y-2-19 在不同pH 值下均可生長(zhǎng)，在pH 值為10 時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度最快，與pH值為9 時(shí)相比差異不顯著；在pH 值為7 時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度最慢，與pH 值為5 時(shí)相比差異不顯著（圖4-F）

2.5 病原菌對(duì)殺菌劑的敏感性測(cè)定結(jié)果

2.5.1 病原菌菌絲生長(zhǎng)對(duì)藥劑的敏感性 由表6可知，代表菌株HS4Y-2-19 的菌絲生長(zhǎng)對(duì)75%肟菌·戊唑醇WG、400 g·L-1氯氟醚·吡唑酯SC、240 g·L-1氯氟醚·吡唑酯EC、42.4%唑醚·氟酰胺SC、40%唑醚·戊唑醇SC、43%氟菌·肟菌酯SC、43%唑醚·氟酰胺SC 較為敏感，EC50＜1 mg·L-1；對(duì)40%苯醚甲環(huán)唑SC、430 g·L-1戊唑醇SC（拜耳）、430 g·L-1戊唑醇SC（寧波）、25%咪鮮胺EC、200 g·L-1氟酰羥·苯甲唑SC、50%腐霉利WP、250 g·L-1嘧菌酯SC、10%苯醚甲環(huán)唑WG 敏感性略低，1 mg·L-1＜EC50＜10 mg·L-1；對(duì)50%多菌靈WP、25%溴菌腈EC、25%溴菌腈WP、6%寡糖·鏈蛋白WP、70%甲基硫菌靈WP、12%苯甲·氟酰胺SC、22.5%啶氧菌脂SC、50%福美雙WP、4%四氟醚唑EW、50%異菌脲WP 的敏感性較低，EC50＞10 mg·L-1。

表6 代表菌株HS4Y-2-19 菌絲對(duì)25 種殺菌劑的敏感性

2.5.2 病原菌孢子萌發(fā)對(duì)藥劑的敏感性 由表7可知，代表菌株HS4Y-2-19 的孢子萌發(fā)對(duì)400 g?L-1氯氟醚·吡唑酯SC、50%福美雙WP、240 g?L-1氯氟醚·吡唑酯EC、250 g?L-1嘧菌酯SC、43%唑醚·氟酰胺SC、22.5%啶氧菌脂SC、40%唑醚·戊唑醇SC、25%溴菌腈EC、42.4%唑醚·氟酰胺SC、25%溴菌腈WP 的敏感性均較高，EC50＜1 mg·L-1；對(duì)50%多菌靈WP、25%咪鮮胺EC 敏感性略低，1 mg·L-1＜EC50＜10 mg·L-1；對(duì)43%氟菌·肟菌酯SC、75%肟菌·戊唑醇WG、50%腐霉利WP、70%甲基硫菌靈WP、200 g?L-1氟酰羥·苯甲唑SC、6%寡糖·鏈蛋白WP、430 g?L-1戊唑醇SC（拜耳）、4%四氟醚唑EW、10%苯醚甲環(huán)唑WG、12%苯甲·氟酰胺SC 的敏感性較低，EC50＞10 mg·L-1。40%苯醚甲環(huán)唑SC、50%異菌脲WP、430 g?L-1戊唑醇SC（寧波）效果不理想，在試驗(yàn)最高質(zhì)量濃度（1×103mg·L-1）下對(duì)孢子萌發(fā)無(wú)明顯抑制作用，未在表7 中列出。

表7 代表菌株HS4Y-2-19 孢子萌發(fā)對(duì)22 種殺菌劑的敏感性

3 討論與結(jié)論

C.nigrum由Halsted[14]首次于1891 年發(fā)現(xiàn)并命名，也有學(xué)者將其與C.gloeosporioides歸為一類(lèi)，并認(rèn)為在以辣椒為寄主時(shí)才被稱(chēng)為C.nigrum[15]。在進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)其與C.coccodes的遺傳關(guān)系較近，據(jù)Liu 等[16]報(bào)道，C.nigrum和C.coccodes都可以侵染辣椒和番茄，但是只有C.coccodes可以侵染馬鈴薯。在貴州[17]、山東[18]均有C.nigrum侵染辣椒的報(bào)道，《中國(guó)真菌總匯》記載該病原菌在東北地區(qū)、內(nèi)蒙古、陜西、江蘇、廣東、廣西、河南、河北等地均有侵染辣椒的記錄[19]。除此之外，該病原菌還可以侵染葫蘆[20]等作物。

馬榮群等[18]研究發(fā)現(xiàn)，最適合C.nigrum菌絲生長(zhǎng)的碳源為麥芽糖，氮源為甘氨酸，pH 值為5～6，而筆者研究發(fā)現(xiàn)，最適碳源為D-麥芽糖，最適氮源為蛋白胨，最適pH 值為9～10?？赡芘c病菌對(duì)辣椒品種及環(huán)境的適應(yīng)性不同有關(guān)，有待于進(jìn)一步研究確認(rèn)。

筆者首次采用孢子萌發(fā)法測(cè)定C.nigrum孢子萌發(fā)對(duì)藥劑的敏感性，發(fā)現(xiàn)50%福美雙WP 對(duì)孢子萌發(fā)抑制作用較強(qiáng)（EC50為0.008 mg·L-1），但病原菌菌絲生長(zhǎng)對(duì)50%福美雙WP 的敏感性較差（EC50為93.355 mg·L-1），因此可將該藥劑可用于預(yù)防C.nigrum侵染，這與李小霞等[17]的研究結(jié)果一致。C.nigrum菌絲生長(zhǎng)對(duì)75%肟菌·戊唑醇WG 敏感性最高（EC50為0.021 mg·L-1），但其孢子萌發(fā)對(duì)該藥劑敏感性略低（EC50為35.039 mg·L-1），可用其進(jìn)行發(fā)病后病害防治。在實(shí)際生產(chǎn)中，也要注意保護(hù)劑和治療劑使用的最佳時(shí)期，建議多種有效藥劑的輪換使用，以延緩抗藥性的發(fā)生。

通過(guò)對(duì)2021 年吉林省及內(nèi)蒙古自治區(qū)東部地區(qū)的辣椒主產(chǎn)區(qū)辣椒炭疽病病樣的采集和病原菌的分離，并進(jìn)行致病性測(cè)定，共計(jì)分離到212 株形態(tài)一致的病原菌，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和相關(guān)分子序列確定病原菌為Colletotrichum nigrum。病原菌的生物學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)，OA 培養(yǎng)基適合病原菌菌絲生長(zhǎng)；D-麥芽糖是最佳碳源；蛋白胨為最佳氮源；最佳pH 為10；最適培養(yǎng)溫度為20 ℃；全黑暗時(shí)最適合菌絲生長(zhǎng)。病原菌C.nigrum的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)對(duì)藥劑敏感性測(cè)試結(jié)果表明，該菌對(duì)400 g?L-1氯氟醚·吡唑酯SC、240 g?L-1氯氟醚·吡唑酯EC、42.4%唑醚·氟酰胺SC、40%唑醚·戊唑醇SC、43%唑醚·氟酰胺SC 的敏感性均較高（EC50<1.0 mg·L-1），可作為該病害預(yù)防和治療的優(yōu)選藥劑。