射干抗病毒口服液薄層色譜鑒別優(yōu)化研究*

白玲玲，李澤平，彭 晨，蘇 華，賈 佳

（中國人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，江蘇 南京 210002）

射干抗病毒注射液由射干、柴胡、大青葉、板藍根、蒲公英、金銀花、茵陳、佩蘭等8 味中藥制成，具有抗病毒、抗菌作用［1］。目前該處方的市售劑型僅有注射劑，常引起類過敏反應［2］，臨床應用受限。我院擬將其研發(fā)為口服液制劑，該劑型能在保證療效的同時減少中藥注射液的不良反應［3］，從而提高患者的順應性。本研究中分析了射干抗病毒口服液中各藥味的理化性質，參考2020 年版《中國藥典》及有關文獻報道，對制劑中射干［4］、柴胡、大青葉、板藍根、金銀花、蒲公英、茵陳藥材的薄層色譜（TLC）鑒別法進行優(yōu)化，便于控制制劑的質量?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

HH - 6 型數顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；KQ - 250DB 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Mettler AE240 型電子天平（梅特勒- 托利多儀器有限公司）；硅膠G 薄層板（青島海洋化工有限公司）；ZF-7N 型智能暗箱式三用紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）。

1.2 試藥

射干抗病毒口服液（我院自制，批號分別為20210616，20210617，20210618）；射干、柴胡、板藍根、大青葉、茵陳、金銀花及蒲公英的對照藥材（批號分別為120994-201206，120992-201509，121177-201608，121367 - 201403，121555 - 201602，121060 - 201608，121195-202004），靛玉紅對照品（含量為99.1%，批號為110717 - 202106），均購自中國食品藥品檢定研究院；試驗所用試劑均為分析純，水為純化水。

2 TLC 鑒別條件優(yōu)化

2.1 藥材TLC 鑒別

射干［4］：取3批樣品各20 mL，用乙酸乙酯萃取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，加1 mL 甲醇溶解，作為供試品溶液。取射干對照藥材粉末1 g，加水30 mL，超聲（功率250 W，頻率40 kHz，下同）處理30 min，濾過，同供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。按射干抗病毒口服液處方和工藝制備缺射干的陰性樣品，然后按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 薄層色譜法，吸取上述溶液各6μL，分別點樣于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷- 甲醇- 冰醋酸（20∶3∶0.2，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鐵乙醇，置日光燈下檢視。結果供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置顯相同顏色斑點，分離度較好，且陰性對照無干擾，與原鑒別圖譜比較優(yōu)勢明顯。詳見圖1。

圖1 射干薄層色譜圖譜A.Before the optimization B.After the optimization 1-3.Test solution 4.Reference medicinal material solution 5.Negative reference solutionFig.1 TLC chromatograms of Belamcandae Rhizoma

柴胡［5-7］：取樣品20 mL，用乙醚萃取2次，每次20 mL，棄去乙醚液，用水飽和正丁醇萃取2 次，每次20 mL，合并正丁醇提取液，用25 mL 氨試液洗滌后回收正丁醇液，蒸干，用1 mL甲醇溶解，作為供試品溶液。取柴胡對照藥材0.5 g，加水50 mL 煎煮1 h，放冷，濾過，濾液自“用水飽和正丁醇萃取2次”起，同供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。按射干抗病毒口服液處方和工藝制備缺柴胡的陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 薄層色譜法，吸取供試品溶液和陰性對照品溶液各4μL，對照藥材溶液5μL，分別點樣于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2，V/V/V）的下層溶液為展開劑，于10 ℃以下放置30 min，展開，取出，晾干，噴以2%二甲氨基苯甲醛的40%硫酸試液，60 ℃下加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置顯相同顏色斑點，分離度較好，且陰性對照無干擾。詳見圖2。

圖2 柴胡薄層色譜圖1-3.Test solution 4.Reference medicinal material solution 5.Negative reference solutionFig.2 TLC chromatograms of Bupleuri Radix

大青葉和板藍根［8-9］：取樣品20 mL，加乙醚提取2次，每次15 mL，棄去水液，合并乙醚液，濾過，濾液蒸干，加1 mL 三氯甲烷溶解，作為供試品溶液。取靛玉紅對照品適量，加三氯甲烷制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。取大青葉和板藍根對照藥材各1 g，分別采用乙醚30 mL 超聲提取30 min，濾過后，濾液蒸干，加三氯甲烷2 mL 溶解，作為對照藥材溶液。按射干抗病毒口服液處方和工藝制備同時缺大青葉和板藍根的陰性樣品，再按供試品溶液制備同時同時方法制成陰性對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 薄層色譜法，吸取供試品溶液、陰性對照品溶液、大青葉對照藥材溶液各4μL，靛玉紅對照品溶液2μL，板藍根對照藥材溶液6μL，分別點樣于同一硅膠G 薄層板上，以環(huán)己烷- 三氯甲烷- 丙酮（5∶4∶2，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，于日光燈下檢視。結果供試品溶液色譜中，在與大青葉、板藍根對照藥材溶液和靛玉紅對照品溶液色譜相應位置分別顯相同顏色斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖3。

圖3 大青葉和板藍根薄層色譜圖1-3.Test solution 4.Indirubin reference solution 5.Reference medicinal material solution of Isatidis Folium 6.Reference medicinal material solution of Isatidis Radix 7.Negative reference solutionFig.3 TLC chromatograms of Isatidis Folium and Isatidis Radix

茵陳、金銀花和蒲公英［4，10］：取樣品20 mL，用乙酸乙酯萃取2次，每次15 mL，棄去水液，合并乙酸乙酯液，蒸干，加1 mL 甲醇溶解，作為供試品溶液。取茵陳對照藥材1.5 g、金銀花對照藥材1.0 g 和蒲公英對照藥材0.5 g，分別以30 mL 水為提取溶劑，80 ℃回流提取1 h，濾過后用乙酸乙酯萃取2次，每次15 mL，合并乙酸乙酯液并蒸干，用1 mL 甲醇溶解，制成單一對照藥材溶液。按射干抗病毒口服液處方和工藝制備缺茵陳的陰性樣品，以及同時缺金銀花、蒲公英和茵陳3 味藥材的陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 薄層色譜法，吸取供試品溶液和陰性對照品溶液各3 μL、茵陳對照藥材溶液5μL，分別點樣于同一硅膠G 薄層板上，以甲苯-甲酸乙酯-甲酸（6∶4∶1，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，于紫外光燈（365 nm）下檢視。結果，以缺茵陳的陰性對照品溶液進行鑒別時，有明顯的陰性干擾（圖4 A）。分析可能是制劑處方中含相似有效成分，與茵陳結構相似的成分也被提取出來所致。供試品溶液色譜與茵陳對照藥材溶液色譜相應位置顯相同顏色熒光斑點，缺茵陳的陰性樣品有此斑點，而缺金銀花、蒲公英和茵陳的陰性樣品無此斑點（圖4 B）。結果表明，如需鑒別金銀花、蒲公英和茵陳，制備陰性樣品時應同時去除金銀花、蒲公英和茵陳，以保證陰性對照無干擾。

圖4 金銀花、蒲公英和茵陳薄層色譜圖A.Before the optimization B.After the optimization 1.Reference medicinal material solution of Artemisiae Scopariae Herba 2-4.Test solution 5.Negative reference solution lacking of Artemisiae Scopariae Herba 6.Negative reference solution lacking of Lonicerae Japonicae Flos，Taraxaci Herba and Artemisiae Scopariae HerbaFig.4 TLC chromatograms of Lonicerae Japonicae Flos，Taraxaci Herba and Artemisiae Scopariae Herba

2.2 展開系統(tǒng)優(yōu)化

賈佳等［4］的研究中以甲苯-甲酸乙酯-甲酸（6∶4∶1，V/V/V）為展開劑進行茵陳TLC 鑒別，但甲苯毒性大，故本研究中基于金銀花、蒲公英和茵陳的化學成分，尋找極性合適、毒性較小的溶劑作為展開劑。先后考察了乙酸丁酯-甲酸-水（7∶2.5∶2.5，V/V/V；展開劑1），環(huán)己烷- 甲酸乙酯- 甲酸（6∶5∶1，V/V/V；展開劑2）和環(huán)己烷-甲酸乙酯-甲酸（6∶7∶1，V/V/V；展開劑3）。按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 薄層色譜法，吸取“茵陳、金銀花和蒲公英”項下供試品溶液和同時缺金銀花、蒲公英和茵陳陰性對照品溶液各3 μL、茵陳、蒲公英和茵陳對照藥材溶液各4μL，分別點于同一硅膠G薄層板，依次以上述展開系統(tǒng)為展開劑，展開，取出，晾干，于紫外光燈（365 nm）下檢視。當采用藥典收載的展開劑1 時，大部分成分未能很好地展開，且陰性對照有干擾，展開時間較長（圖5 A）；當采用展開劑2時，展開過程出現分層現象，部分成分未能很好地分離（圖5 B）；當采用展開劑3時，斑點清晰，分離度較好，陰性對照無干擾（圖5 C），比移值適中，且環(huán)己烷毒性比甲苯小，故選用展開劑3。

圖5 展開系統(tǒng)優(yōu)化薄層色譜圖A.Developing solvent 1 B.Developing solvent 2 C.Developing solvent 3 1-3.Test solution 4.Reference medicinal material solution of Lonicerae Japonicae Flos 5.Reference medicinal material solution of Taraxaci Herba 6.Reference medicinal material solution of Artemisiae Scopariae Herba 7.Negative reference solution lacking of Artemisiae Scopariae Herba，Lonicerae Japonicae Flos and Taraxaci HerbaFig.5 TLC chromatograms of the optimized developing system

3 討論

射干抗病毒口服液處方中，射干為君藥，其性寒，味苦，具有清熱解毒、消痰、利咽及消瘀散結功效，主要用于治療熱毒痰火郁結、痰咳氣喘、痰涎壅盛及咽喉腫痛［11］，在許多咽喉疾病的傳統(tǒng)方劑中亦為君藥。射干主要的化學成分為黃酮類化合物，具有抗腫瘤、抗病毒、抗真菌、抗炎等藥理活性［12］；加之金銀花以增強清熱解毒，兼具疏散風熱之功［13］；輔之板藍根和大青葉以清解風熱疫毒［9，14］；同時方中配以蒲公英既有清熱解毒、消腫散結，又能利尿通淋［15］；再以苦泄下降的茵陳增強清解脾胃肝膽濕熱［16］；此外，處方中還加入了疏散退熱、疏肝解郁、升舉陽氣的柴胡［17］；醒脾開胃、發(fā)表解暑、氣味芳香的佩蘭［18］。因此，該處方有明確的抗病毒和抑菌抗炎功效，但目前關于其質量控制的研究較少。相關標準中僅有紫外雙波長分光光度法測定該注射劑的綠原酸含量［19］。為進一步完善該藥品質量標準，確保藥品質量穩(wěn)定可控，本研究中在賈佳等［4］的研究基礎上，對射干和茵陳的TLC 鑒別進行優(yōu)化，并增加柴胡、大青葉、板藍根、金銀花和蒲公英TLC的鑒別方法。

與我院前期的射干TLC鑒別方法比較［4］，本研究中簡化了射干TLC 鑒別方法，即減少點樣量和噴完顯色劑后直接檢視。結果表明，供試品溶液色譜在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色斑點，所得斑點更清晰，分離度更好，重復性好，且陰性對照無干擾。本研究中參考2020年版《中國藥典（一部）》及朱田密等［6］的研究改進柴胡TLC 鑒別方法，最終確定以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2，V/V/V）為展開劑；同時對柴胡加熱溫度做了優(yōu)化試驗，通過噴以2%二甲氨基苯甲醛的40%硫酸試液后，考察了105，80，60 ℃加熱條件，結果加熱溫度過高時斑點會糊化，故選擇60 ℃加熱。而在對大青葉進行TLC 鑒別時發(fā)現陰性對照有明顯干擾。且在實際操作過程中，以靛玉紅和靛藍為對照品進行TLC鑒別時，靛玉紅斑點顏色清晰，而靛藍易氧化褪色，不易觀察，故本研究中選擇靛玉紅為對照品。板藍根和大青葉主要來源于十字花科植物菘藍Isatis indigoticaFort.的干燥根和葉，均含有共同成分靛玉紅和靛藍［9，20-21］。故在制備陰性樣品時同時除去板藍根和大青葉，結果TLC 中各有效成分斑點清晰，陰性對照無干擾，方法專屬性較強。茵陳鑒別，本研究中驗證賈佳等［4］對茵陳的TLC 鑒別時，發(fā)現陰性對照有明顯干擾，可能因為以乙酸乙酯萃取時萃取出與綠原酸結構相似的成分［22］。對此，本研究中采用“三陰性”法同時去除茵陳、金銀花和蒲公英藥材，以保證試驗有效。因為展開體系中甲苯的毒性大，故選擇低毒的環(huán)己烷代替甲苯。通過調節(jié)展開體系的比例，最終確定展開體系為環(huán)己烷-甲酸乙酯-甲酸（6∶7∶1，V/V/V），結果顯示色譜斑點清晰，分離度良好，且陰性對照無干擾。

綜上所述，本研究中所建立的TLC 法具有點樣量少、重復性好、檢測效率高等優(yōu)點，可用于射干抗病毒口服液的質量控制。