龍膽健肝膠囊在大鼠體內(nèi)的藥物代謝動力學(xué)研究*

楊 嘯，楊 琳，劉愛霞，于 靜，郝玉佩，楊繼章，王玲嬌△

（1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部，陜西 西安 710061；2.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院臨床藥學(xué)部，河北 石家莊 050031；3.河北省邯鄲市第四醫(yī)院藥劑科，河北 邯鄲 056200；4.清華大學(xué)附屬北京清華長庚醫(yī)院·清華大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院臨床藥物試驗中心，北京 100084）

龍膽健肝膠囊是河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院院內(nèi)制劑（冀藥制字Z20050004），由龍膽、虎杖、茵陳、澤瀉、陳皮、山楂等9 味藥材組方，有清肝利膽、改善肝功能功效，臨床用于治療和預(yù)防脂肪肝。有文獻報道，該制劑中的龍膽可清臟腑熱、清瀉肝膽實火、清利肝經(jīng)濕熱；虎杖可清熱解毒、利濕散瘀；茵陳可苦泄下降，清熱利濕；澤瀉可利水滲濕、化濁調(diào)脂［1-4］。龍膽健肝膠囊的有效成分為龍膽苦苷、綠原酸、虎杖苷、金絲桃苷、橙皮苷、大黃酸、大黃素甲醚、川陳皮素。有研究建立了測定制劑中龍膽苦苷、虎杖苷、濱蒿內(nèi)酯、橙皮苷和大黃素含量的高效液相色譜（HPLC）法［5］，但未完全涉及上述成分的藥物代謝動力學(xué)（簡稱藥動學(xué)）特征［6-7］。為此，本研究中采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC - MS/MS）法研究龍膽健肝膠囊中8 種有效成分在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)特征，從而為該藥作用機制的研究提供數(shù)據(jù)支持?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器、試藥與動物

1.1 儀器

TSQ Quantum Access MAX 型超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀（賽默飛世爾科技＜中國＞有限公司）；BT125D 型分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；KQ - 400KDB 型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XW-80A 型漩渦混合器（上海醫(yī)大儀器廠）；D3024 型臺式高速微量離心機（美國Scilogex公司）。

1.2 試藥

龍膽健肝膠囊（河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院制劑室，冀藥制字Z20050004，批號為181112）；龍膽苦苷對照品（批號為110770 - 200409）、大黃酸對照品（批號為0757 - 200206）、橙皮苷對照品（批號為100721 -200512）、大黃素甲醚對照品（批號為100724 -200613），均購自中國食品藥品檢定研究院；綠原酸對照品（批號為17081021）、虎杖苷對照品（批號為18112406）、金絲桃苷對照品（批號為18081761）、川陳皮素對照品（批號為18092451），均購自上海士鋒生物科技有限公司；小檗堿對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號為MUST-16111115）。

1.3 動物

清潔級SD 大鼠6 只，雄性，8 周齡，體質(zhì)量250～300 g，由河北省實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（冀）2018 - 004；飼養(yǎng)于河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物房，通風(fēng)，自由進食飲水，實驗動物使用許可證號SYXK（冀）2020 - 002。該動物實驗經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（批件號20220201）。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Polaris C18- A 柱（100 mm × 2.1 mm，1.8 μm）；流動相：甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～9 min 時10%A →65%A，9～10.5 min 時65%A →100%A，10.5～12 min 時100%A →10%A）；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；毛細管電壓3 000 V；鞘氣（GS1）壓力35 Arb；輔助氣（GS2）壓力7 Arb；毛細管溫度300 ℃；揮發(fā)氣溫度300 ℃。龍膽苦苷、綠原酸、虎杖苷、金絲桃苷、橙皮苷、大黃酸、大黃素甲醚、川陳皮素、小檗堿的母離子/子離子對質(zhì)荷比（m/z）分別為356.96 →177.12，354.94 →163.13，388.69 →227.04，462.88 →299.96，608.92 →300.94，282.92 →238.98，282.98 →265.27，402.89 →373.08，609.20 →300.00；碎片能量分別為95，102，122，95，81，96，89，78，111 eV；撞擊能量分別為11，15，23，29，25，18，26，27，40 eV。

2.2 溶液制備與血漿樣品預(yù)處理［8］

2.2.1 對照品溶液制備

取龍膽苦苷、綠原酸、虎杖苷、金絲桃苷、橙皮苷、大黃酸、大黃素甲醚、川陳皮素對照品各適量，精密稱定，置容量瓶中，分別加甲醇溶解并定容，制成單一對照品貯備液。吸取適量，制成各成分質(zhì)量濃度分別為252.13，32.25，27.09，148.08，72.24，113.92，241.92，10.48 μg/ mL 的混合對照品溶液，- 20 ℃貯存；使用時，精密吸取適量，用甲醇稀釋并定容，制成系列混合對照品溶液。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液制備

取小檗堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度為14.65 μg/ mL 的內(nèi)標(biāo)貯備液，再以甲醇稀釋至質(zhì)量濃度為14.65 ng/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，-20 ℃貯存。

2.2.3 血漿樣品預(yù)處理

精密吸取血漿樣品100μL，置離心管中，加入甲醇300μL，渦旋混合5 min，12 000 r/min 離心5 min，取上清液，即得。

2.3 方法學(xué)驗證［9］

2.3.1 專屬性試驗

取大鼠空白血漿100 μL，按2.2.3 項下方法預(yù)處理，按2.1項下試驗條件進樣測定，記錄色譜圖（圖1 A）；取大鼠空白血漿100 μL，加入混合對照品溶液及內(nèi)標(biāo)溶液，按2.2.3 項下方法操作，按2.1 項下試驗條件進樣測定，記錄色譜圖（圖1 B）；取大鼠灌胃給予龍膽健肝膠囊30 min 后的血漿樣品加入內(nèi)標(biāo)溶液，其余步驟均按2.2.3 項下方法操作，按2.1 項下試驗條件進樣測定，記錄色譜圖（圖1 C）。結(jié)果在選定試驗條件下，龍膽苦苷、綠原酸、虎杖苷、金絲桃苷、橙皮苷、大黃酸、大黃素甲醚、川陳皮素之間分離良好，且大鼠血漿樣品中的內(nèi)源性物質(zhì)無干擾，表明方法專屬性好。

圖1 龍膽健肝膠囊中8個成分及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜圖1.Hesperidin 2.Nobiletin 3.Physcion 4.Berberine（internal standard）5.Polydatin 6.Hyperin 7.Chlorogenic acid 8.Rhein 9.Gentiopicrin A.Blank plasma B.Mixed reference solution+internal standard solution+blank plasma C.Plasma sample after administration+internal standard solutionFig.1 Mass spectrograms of eight components in Longdan Jiangan Capsules and the internal standard

2.3.2 線性關(guān)系考察

精密吸取大鼠空白血漿樣品100μL，加入2.2.1項下系列混合對照品溶液10 μL，制成系列血漿樣品。按2.2.3 項下方法中“加入甲醇300μL”起操作，按2.1項下試驗條件進樣測定，以各有效成分的質(zhì)量濃度（X，ng/mL）為橫坐標(biāo)、各有效成分與內(nèi)標(biāo)小檗堿峰面積的比值（Y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸。結(jié)果見表1。

表1 回歸方程與線性范圍Tab.1 Regression equations and linear ranges

2.3.3 精密度和準(zhǔn)確度試驗［10］

取大鼠空白血漿適量，按2.3.2 項下相關(guān)方法操作，分別制得低、中、高質(zhì)量濃度的混合對照品血漿質(zhì)量控制（QC）樣品，每個質(zhì)量濃度平行5 個樣本，同一日內(nèi)連續(xù)測定5次，連續(xù)進樣5 d；另每天進樣測定1次，連續(xù)測定3 d，求得方法的精密度（QC 樣品測定值的RSD）。取上述QC樣品，按2.2.3項下方法操作，按2.1項下試驗條件進樣分析，記錄樣品儀器響應(yīng)值（As），及其與內(nèi)標(biāo)峰儀器響應(yīng)值比值（As＇）。另取空白血漿100μL，按2.2.3項下方法操作，加入適量低、中、高質(zhì)量濃度的混合對照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混勻后按2.1項下試驗條件進樣分析，記錄儀器響應(yīng)信號值（Ar），及其與內(nèi)標(biāo)峰面積比值（Ar＇）。提取回收率（內(nèi)標(biāo)歸一化，%）=As＇/Ar＇×100%?；旌蠈φ掌费獫{樣品的日內(nèi)及日間精密度的RSD均小于12%，表明方法精密度良好。不同質(zhì)量濃度混合血漿樣品的提取回收率為69.94%～93.21%，表明方法準(zhǔn)確度較好。

2.3.4 穩(wěn)定性和基質(zhì)效應(yīng)考察

分別考察不同質(zhì)量濃度混合對照品QC樣品（n=5）室溫放置、長期冷凍及凍融的穩(wěn)定性?？疾煅獫{樣品在室溫放置條件下的穩(wěn)定性時，將2.3.3項下不同質(zhì)量濃度的QC 樣品在室溫放置8 h 后，按2.2.3 項下方法操作，按2.1 項下試驗進樣分析，計算血漿樣品中8 種有效成分含量；長期冷凍、凍融條件下的穩(wěn)定性，將不同質(zhì)量濃度的QC 樣品冷凍放置20 d，或從-20 ℃環(huán)境中取出于室溫待血漿樣品解凍后再置- 20 ℃中冰凍，如此凍融反復(fù)3 次（間隔24 h），按2.1 項下試驗條件進樣分析，計算血漿樣品中8 種有效成分含量。取空白血漿100 μL，按2.2.3 項下方法操作，取上清液加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的單一對照品貯備液和內(nèi)標(biāo)溶液，得混合血漿樣品；用甲醇代替空白血漿，進行上述操作，按2.1項下試驗條件進樣分析，計算內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)效應(yīng)。各混合對照品QC 樣品3 種條件下的RSD均小于12%，表明相應(yīng)條件下樣品均穩(wěn)定。各混合血漿樣品的內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)效應(yīng)為89.31%～109.29%，表明該方法不存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)。

2.4 藥動學(xué)特征［11］

取SD 大鼠6 只，分別灌胃給予龍膽健肝膠囊0.80 g/kg（參考8 倍臨床等效劑量），分別于給藥前及給藥后0.08，0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，4，6，8，12，24，48 h 眼內(nèi)眥取血0.5 mL，置經(jīng)肝素鈉抗凝處理過的離心管中，4 ℃下3 000 r/min離心10 min，分離上層血漿，置-20 ℃貯存。測定血藥濃度，采用DAS 2.0 藥動學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計算藥動學(xué)參數(shù)。結(jié)果各有效成分藥動學(xué)參數(shù)符合二室模型，詳見表2（t1/2為半衰期，Tmax為達峰時間，Cmax為峰濃度，AUC為血藥濃度- 時間曲線下面積）。

表2 龍膽健肝膠囊中8個成分的主要藥動學(xué)參數(shù)（±s，n=6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters of eight components in Longdan Jiangan Capsules（±s，n=6）

表2 龍膽健肝膠囊中8個成分的主要藥動學(xué)參數(shù)（±s，n=6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters of eight components in Longdan Jiangan Capsules（±s，n=6）

待測成分龍膽苦苷綠原酸虎杖苷金絲桃苷橙皮苷大黃酸大黃酸甲醚川陳皮素t1/2（h）22.64±17.13 159.12±58.54 187.94±86.82 858.64±1 081.14 2 148.83±4 027.38 162.10±218.47 12.50±2.29 1 053.73±1 244.01 Tmax（h）1.50±0.00 0.50±0.00 0.75±0.00 0.50±0.00 0.08±0.00 0.08±0.00 6.00±0.00 0.25±0.00 Cmax（ng/mL）587.38±39.53 26.57±4.00 34.83±2.64 51.29±4.97 58.96±2.22 114.26±7.71 825.19±86.03 1.83±0.03 AUC0-t［ng/（mL·h）］4 042.37±140.73 340.37±6.86 908.15±37.52 908.16±5.64 1 356.61±37.68 1 340.83±62.95 15 304.41±1 798.75 64.32±0.53 AUC0-∞［ng/（mL·h）］5 036.77±1 327.70 1 758.56±548.25 5 765.98±2 312.19 23 902.22±28 980.69 91 124.87±171 255.72 6 621.93±7 660.00 16 540.14±1 798.01 2 050.67±2 373.89

3 討論

根據(jù)前期實驗結(jié)果及文獻報道，本研究中選擇了制劑中含量較高的8種有效成分作為待測成分，初步研究各成分在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)特征。血漿樣品分別采用乙腈沉淀法、乙酸乙酯萃取法、甲醇沉淀法和正丁醇萃取法進行前處理，發(fā)現(xiàn)甲醇沉淀法提取率相對較高，而其余3 法的提取率均較低，且內(nèi)源性物質(zhì)干擾少，因此采用甲醇沉淀法沉淀蛋白。流動相考察中，選擇甲醇-水作為流動相時，所得峰形均較差，且拖尾嚴(yán)重，而加入不同比例的甲酸后拖尾和峰形均有所改善，經(jīng)多次試驗后，最終選擇了0.1%甲酸水溶液-甲醇溶液作為流動相。

中藥復(fù)方制劑的成分復(fù)雜，各成分含量較低。龍膽健肝膠囊有效成分含量低，灌胃給藥后大鼠血漿中的藥物濃度更低，因此對其有效成分在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)研究十分困難。實驗中發(fā)現(xiàn)，給藥劑量較低時，川陳皮素難以在血中檢測到，為研究其體內(nèi)藥動學(xué)過程，多次調(diào)整劑量后，最終以臨床等效劑量的8倍作為大鼠給藥劑量。結(jié)果顯示，大鼠灌胃給藥后，龍膽苦苷、綠原酸、虎杖苷、金絲桃苷、橙皮苷、大黃酸和川陳皮素的Tmax在0.08～1.50 h，說明均可被快速吸收入血。灌胃6 h 后8 種成分血藥濃度均降低，說明制劑的有效成分在大鼠體內(nèi)均可被快速代謝。龍膽苦苷和大黃素甲醚在大鼠血漿中的濃度較高。本研究中龍膽苦苷、大黃酸、大黃素甲醚出現(xiàn)明顯的第2吸收峰，可能與其存在肝腸循環(huán)有關(guān)，文獻［5，12 - 13］報道其在體內(nèi)未出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，這可能與其他成分的相互作用有關(guān)。文獻［13］報道金絲桃苷出現(xiàn)明顯的第2吸收峰，可能與其存在肝腸循環(huán)有關(guān)，但本研究中金絲桃苷未出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，可能與復(fù)方中其他成分的相互作用有關(guān)。綠原酸、虎杖苷、橙皮苷、川陳皮素的AUC則與文獻［13-18］一致。

綜上所述，本研究中建立的UPLC - MS/ MS 法快速簡便、穩(wěn)定可靠，適用于龍膽健肝膠囊在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)研究，為進一步研究制劑有效成分的藥理作用機制提供了參考。