金卷升板膠囊對(duì)模型大鼠血小板減少的改善作用*

韓艷叢，楊 琳，鄭玉玲，于 靜，周春華，劉清池，王玲嬌

（河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，河北 石家莊 050031）

特發(fā)性血小板減少性紫癜（ITP）是以人體血小板計(jì)數(shù)（PLT）降低（低于100×109/L）為主要特征的血液疾病。ITP癥狀多為瘀點(diǎn)、紫癜、黏膜出血（如鼻衄）等，甚至涉及顱內(nèi)出血［1］。ITP死亡率超90%（有效治療前），治療后仍達(dá)10%，至少30%的患者在首次發(fā)作后復(fù)發(fā)。目前臨床共識(shí)推薦的常見治療方案為輸注血小板及促血小板生長因子［2］，但效果欠佳，費(fèi)用昂貴，且藥品不良反應(yīng)明顯［3-4］。金卷升板膠囊由金銀花、黃芩、茜草等10味藥材組方，具有清熱涼血、止血通絡(luò)功效，主治各種血小板減少癥［5-7］，且價(jià)格便宜、原料易得，近年來在我院臨床使用療效確切，但作用機(jī)制尚不明晰。本研究中探討了該藥對(duì)血小板減少模型大鼠凝血能力及脾臟系數(shù)的影響，以及對(duì)血小板減少的改善作用?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動(dòng)物

儀器：MEX-7222 K 型全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀（日本Nihon Kohden公司）；CX23型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

試藥：注射用環(huán)磷酰胺（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)為18100825）；金卷升板膠囊生粉（河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，批號(hào)分別為170813，170826，170901，170914）；咖啡酸片（德州德藥制藥有限公司，批號(hào)為181606013）；大鼠白細(xì)胞介素10（IL-10）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）測(cè)定試劑盒（美國ABclonal 公司，批號(hào)分別為9680002050519，9680002040119）；蘇木素（H）、伊紅（E）染液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為719032，719012）。

動(dòng)物：清潔級(jí)SD 大鼠36 只，雄性，10 周齡，體質(zhì)量350 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（冀）2018 - 004，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（冀）2020- 002。飼養(yǎng)于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，通風(fēng)，自由進(jìn)食、飲水。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)20220712）。

1.2 方法

1.2.1 建模、分組及給藥

將36 只大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（A 組，等體積生理鹽水），模型組（B 組，等體積生理鹽水），咖啡酸組（C 組，9 mg/ kg），以及金卷升板膠囊高、中、低劑量組（D1組、D2組、D3組，1.00，0.50，0.25 g/kg），各6 只。腹腔注射環(huán)磷酰胺溶液（100 mg/kg），每日1次，連續(xù)3 d，以復(fù)制血小板減少大鼠模型，同時(shí)A組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水。以PLT減至建模前的20%～30%為建模成功［8］。建模開始后第5 天，各組大鼠予相應(yīng)藥物或生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)14 d［9］。

1.2.2 觀察指標(biāo)

PLT：分別于建模前和給藥14 d 后取大鼠尾靜脈血檢測(cè)［9］，＜1 100×109/L為PLT減少。

凝血四項(xiàng)：末次給藥后，稱定大鼠體質(zhì)量，腹腔注射水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血適量，分別置惰性分離膠促凝管和枸櫞酸鈉凝血實(shí)驗(yàn)管中，取后者檢測(cè)凝血酶原時(shí)間（PT）、活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）、凝血酶時(shí)間（TT）及纖維蛋白原（Fib）水平。

IL-10 及TNF-α：取前述惰性分離膠促凝管中的血液樣本，采用ELISA法檢測(cè)。

脾臟組織病理形態(tài)：處死大鼠，取出脾臟，稱定質(zhì)量并計(jì)算脾臟系數(shù)（脾臟系數(shù)=脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量）。將脾臟組織浸泡于福爾馬林溶液中固定，石蠟切片，HE染色，置顯微鏡下觀察［9-11］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 PLT

與A 組比較，B 組大鼠給藥14 d 后PLT 顯著減少（P＜0.01）；與B 組比較，C組、D1組、D2組大鼠給藥14 d后PLT均顯著增加（P＜0.01）。詳見表1。

表1 各組大鼠PLT比較（±s，×109/L，n=6）Tab.1 Comparison of PLT of rats in each group（±s，×109/L，n=6）

表1 各組大鼠PLT比較（±s，×109/L，n=6）Tab.1 Comparison of PLT of rats in each group（±s，×109/L，n=6）

注：與A 組比較，**P ＜0.01；與B 組比較，##P ＜0.01。表2、表3同。Note：Compared with those in group A，**P ＜0.01；Compared with those in group B，##P ＜0.01（for Tab.1-3）.

給藥14 d后1 112.50±188.28 311.33±32.10**688.00±75.23##888.83±83.16##614.50±66.10##344.17±17.87組別A組B組C組D1組D2組D3組劑量（g/kg）0.009 1.00 0.50 0.25建模前1 015.83±108.77 1 143.83±110.24 1 125.67±95.52 1 086.17±102.12 1 169.50±75.39 1 131.00±107.03

2.2 凝血四項(xiàng)

與A 組比較，B 組大鼠的PT，APTT，TT 均顯著延長，F(xiàn)ib 水平顯著升高（P＜0.01）；與B 組比較，C 組、D1組、D2組大鼠的PT，APTT，TT均顯著縮短，F(xiàn)ib水平顯著降低（P＜0.01）。詳見表2。

表2 各組大鼠凝血四項(xiàng)指標(biāo)比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison of four blood coagulation indexes of rats in each group （±s，n=6）

表2 各組大鼠凝血四項(xiàng)指標(biāo)比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison of four blood coagulation indexes of rats in each group （±s，n=6）

組別A組B組C組D1組D2組D3組劑量（g/kg）0.009 1.00 0.50 0.25 PT（s）56.52±0.56 96.74±1.05**61.95±1.47##59.19±2.43##59.99±1.51##94.01±1.51 APTT（s）65.57±1.14 75.64±1.06**66.12±1.74##66.63±2.06##64.71±2.34##72.42±1.60 TT（s）61.01±1.59 92.48±1.14**62.03±2.93##62.07±1.97##61.10±1.74##90.43±0.91 Fib（g/L）22.49±1.91 30.32±0.89**24.16±1.50##23.28±1.39##23.72±0.87##28.65±0.86

2.3 IL-10 及TNF-α

與A組比較，B 組大鼠TNF-α水平顯著升高，IL-10水平顯著降低（P＜0.01）；與B 組比較，C組、D1組、D2組大鼠TNF - α 水平均顯著降低，C 組、D1組、D2組、D3組大鼠IL-10水平均顯著升高（P＜0.01）。詳見表3。

2.4 脾臟系數(shù)

與A 組比較，B 組大鼠脾臟系數(shù)顯著降低（P＜0.01）；與B 組比較，C 組、D1組、D2組、D3組大鼠脾臟系數(shù)均顯著升高（P＜0.01）。詳見表3。

表3 各組大鼠IL-10，TNF-α水平及脾臟系數(shù)比較（±s，n=6）Tab.3 Comparison of IL-10，TNF-α levels and spleen coefficient of rats in each group（±s，n=6）

表3 各組大鼠IL-10，TNF-α水平及脾臟系數(shù)比較（±s，n=6）Tab.3 Comparison of IL-10，TNF-α levels and spleen coefficient of rats in each group（±s，n=6）

組別A組B組C組D1組D2組D3組劑量（g/kg）0.009 1.00 0.50 0.25 TNF-α（pg/mL）737.83±45.73 894.50±22.77**823.33±15.89##761.83±23.67##842.83±20.81##882.67±25.75 IL-10（pg/mL）425.50±17.26 255.50±22.47**359.67±17.68##392.83±15.85##341.33±19.92##326.17±28.10##脾臟系數(shù)（%）0.44±0.08 0.29±0.06**0.43±0.07##0.41±0.09##0.38±0.07##0.35±0.06##

2.5 脾臟組織病理形態(tài)

A 組大鼠脾臟組織的被膜、紅髓、白髓清晰；B 淋巴細(xì)胞較大，細(xì)胞膜完整，邊緣清晰，細(xì)胞核著色深且清晰不黏連。B 組大鼠脾臟組織的紅髓可見縮小，白髓有增大跡象，T 淋巴細(xì)胞顯著增多，紅髓的髓索、髓竇中出現(xiàn)大量的巨核細(xì)胞；T 淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，呈膨大破裂，著色變淺，細(xì)胞內(nèi)嗜酸性物質(zhì)減少。與B 組比較，C 組大鼠脾臟組織的被膜、紅髓、白髓較清晰，B 淋巴細(xì)胞增多，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整；D1組、D2組、D3組大鼠脾臟組織的B淋巴細(xì)胞數(shù)量均有所增加，細(xì)胞核內(nèi)的嗜堿性物質(zhì)著色明顯，細(xì)胞核完整度較好。詳見圖1。

圖1 大鼠脾臟組織病理形態(tài)（HE，×200）Fig.1 Histopathological morphology of rat spleen（HE，×200）

3 討論

ITP 的血小板缺乏可能是由血小板產(chǎn)生減少，免疫介導(dǎo)破壞或脾液封存增加等原因引起［1］。80%的ITP 病例屬原發(fā)性，常被視為自身免疫性疾病；20%的ITP 病例為繼發(fā)性［12］。ITP 的主要癥狀為出血，程度可從無癥狀到頑固性出血，發(fā)病可為急性（持續(xù)時(shí)間少于3 個(gè)月或持續(xù)3～12個(gè)月），也可為慢性（持續(xù)12個(gè)月以上）。

常見血小板減少癥模型為免疫性血小板減少和藥物所致血小板減少［10］。前者建模時(shí)間長、費(fèi)用高、操作復(fù)雜，且成功率低。而環(huán)磷酰胺的臨床常見不良反應(yīng)是PLT 明顯減少，即中醫(yī)的血虛證［13-14］。研究表明，以環(huán)磷酰胺建模，可發(fā)生血小板減少，出血時(shí)間延長、凝血困難等，其模型比免疫性血小板減少造模法更經(jīng)濟(jì)，易操作，效果確切［14-15］。

PLT 是評(píng)價(jià)血小板減少癥最直觀的指標(biāo)［13-14］。研究認(rèn)為血小板減少模型大鼠可出現(xiàn)凝血時(shí)間延長的現(xiàn)象，故凝血四項(xiàng)變化可作為衡量血小板減少程度的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)之一［15］。IL - 10 可抑制B 淋巴細(xì)胞生成血小板抗體，還可促進(jìn)T 淋巴細(xì)胞的增殖、分化，從而緩解血小板的免疫性破壞［16］。ITP 患者PLT 減少可能受到TNF-α表達(dá)水平的影響［17］。脾臟系數(shù)是評(píng)價(jià)大鼠血小板減少模型的經(jīng)典指標(biāo)［16］。本研究中，與A組比較，B組大鼠PLT 顯著減少，IL - 10 水平、脾臟系數(shù)均顯著降低，TNF - α 水平顯著升高，PT，APTT，TT 均顯著延長，F(xiàn)ib 水平顯著升高，表明環(huán)磷酰胺致血小板減少大鼠模型復(fù)制成功。與B組比較，C組、D1組、D2組、D3組的指標(biāo)均有改善，表明金卷升板膠囊均可減輕模型大鼠血小板減少程度。

綜上所述，金卷升板膠囊可改善模型大鼠的血小板減少，其機(jī)制可能與升高IL-10及降低TNF-α水平，改善大鼠免疫指標(biāo)有關(guān)。該研究為進(jìn)一步探討該制劑具體活性成分和基于信號(hào)通路的作用機(jī)制提供了參考。