基于Illumina MiSeq分析3種市售茶葉中的微生物結(jié)構(gòu)

范三紅，薛騰達(dá)，白寶清，薛虎貴，藺佳鈺，張錦華*

1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（太原 030006）；2.特色植物資源研究與利用山西重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西大學(xué)（太原 030006）

茶作為世界三大飲料之一[1]，根據(jù)不同的發(fā)酵工藝可以分為不發(fā)酵茶、半發(fā)酵茶、全發(fā)酵茶和后發(fā)酵茶[2-3]。白茶、紅茶、生茶是市場(chǎng)上較為常見的三種茶葉。白茶不經(jīng)殺青或揉捻，只經(jīng)過萎凋、干燥后加工而成[4]。紅茶經(jīng)萎凋、揉捻（切）、發(fā)酵、干燥加工而成，屬全發(fā)酵茶[5]。生茶是直接曬青（殺青、揉捻日曬）后經(jīng)蒸壓而成[6]，未經(jīng)過渥堆發(fā)酵?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)：茶葉的加工工藝對(duì)其中的微生物群落結(jié)構(gòu)組成有驅(qū)動(dòng)作用[7]，且微生物會(huì)參與茶葉中活性成分的代謝與轉(zhuǎn)化[8]，因此研究茶葉加工過程及儲(chǔ)存出售等階段微生物的組成有一定意義。

隨著變性凝膠電泳（PCR-DGGE）[9]、焦磷酸測(cè)序[10]、元基因組學(xué)[11]等多種生物技術(shù)手段的出現(xiàn)，大量研究著重于檢測(cè)茶葉加工過程中的微生物結(jié)構(gòu)[12-13]，研究茶葉功能成分與微生物之間的相關(guān)性[14-15]以及從代謝組學(xué)的角度研究茶中的微生物相互作用[8,16]，而對(duì)于茶葉在市售及儲(chǔ)藏過程中的研究主要集中于不同倉儲(chǔ)年份茶葉理化成分[17-19]以及茶葉儲(chǔ)存條件[20]的研究。普洱茶發(fā)酵微生物溯源分析發(fā)現(xiàn)茶葉內(nèi)生細(xì)菌是普洱茶發(fā)酵微生物的重要來源[21]。同時(shí)，茶葉內(nèi)生菌和根際細(xì)菌也是茶葉生防菌的重要來源[22-23]。茶葉在儲(chǔ)藏中微生物組成與茶葉衛(wèi)生安全問題密切相關(guān)，但目前針對(duì)茶葉在銷售過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究較少，尤其是針對(duì)紅茶和生茶中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究。針對(duì)不同加工工藝制作的茶葉中微生物結(jié)構(gòu)差異的研究不多；對(duì)于茶葉保藏中微生物的變化及微生物對(duì)茶葉品質(zhì)影響的研究不足。研究利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)3種不同類型的市售茶葉中的微生物群落多樣性進(jìn)行分析，以期對(duì)后續(xù)茶葉出售及儲(chǔ)存過程中微生物安全性及對(duì)品質(zhì)的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：市售的生產(chǎn)日期為2020年3月的白茶（BC）、紅茶（HC）及2011年3月的生茶（SC），2021年7月購買自中國云南省雙江勐庫蘊(yùn)品茶廠，購買后原包裝常溫干燥保存于實(shí)驗(yàn)室。

試劑：磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（分析純，天津博迪化工股份有限公司）。

儀器：YXQ-LS型立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；MX-S渦旋混合儀（北京佳航博創(chuàng)科技有限公司）；S.SW-CJ-1FD型凈化工作臺(tái)（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；H2100R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；SC-3614低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

參考王雪山[24]富集微生物的方法，對(duì)3種茶葉樣品進(jìn)行預(yù)處理。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

預(yù)處理后的樣品送往北京諾禾致源股份有限公司，采用CTAB法提取樣品基因組DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè) DNA 的純度和濃度，將合格的DNA樣品作為模板，利用通用引物515F（5＇-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3＇）/806R（5＇-GGACTACNVGGGTWTCTAA-3＇）對(duì)細(xì)菌16SrDNAV3-V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，利用1737F（5＇-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3＇）/2043R（5＇-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3＇）對(duì)真菌ITS1區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系30 μL，PCR擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性1 min，98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃30 s，72 ℃ 5 min，循環(huán)30次。

擴(kuò)增結(jié)束后使用2%濃度的瓊脂糖凝膠PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，上樣時(shí)目標(biāo)片段標(biāo)準(zhǔn)品5 μL（10 ng/μL），DNA marker 2 μL，PCR產(chǎn)物5 μL；之后對(duì)目的條帶使用qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。之后使用Nova Seq 6000平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

對(duì)Illumina NovaSeq測(cè)序得到數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以97%的一致性和OTUs（Operational Taxonomic Units）聚類進(jìn)行物種注釋及豐度分析；通過α多樣性（Alpha Diversity）揭示出樣本中物種組成和樣本間群落結(jié)構(gòu)的差異；利用主成分分析（PCA，Principal Component Analysis）[25]揭示三種茶葉樣品的相似性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

PCR產(chǎn)物電泳圖如圖1所示，目的條帶大小正確且明亮，滿足測(cè)序需要。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 OTU聚類分析

如圖2所示：3種茶葉中共檢測(cè)到403個(gè)細(xì)菌OTU數(shù)，不同樣品的OTU數(shù)中BC（256）＞HC（115）＞SH（64），共有的細(xì)菌OTU數(shù)為56個(gè)，BC、HC、SC特有的OTU數(shù)分別為200，59和8個(gè)。三種茶葉中共檢測(cè)到717個(gè)真菌OTU數(shù)，不同樣品的OTU數(shù)中BC（406）＞HC（405）＞SH（186），共有的細(xì)菌OTU數(shù)為140個(gè)，BC、HC、SC特有的OTU數(shù)分別為266，265和46個(gè)。綜上可知，三種茶葉中真菌的OUT數(shù)大于細(xì)菌，說明茶葉中真菌種類多于細(xì)菌。其次，BC中OTU數(shù)最多，HC次之，生茶最少，可能原因在于：白茶未經(jīng)殺青和發(fā)酵，保留了茶葉本身多的大多數(shù)微生物，使其具有最多的OTU數(shù)；紅茶未經(jīng)殺青，經(jīng)發(fā)酵后一部分微生物死亡，使其OTU數(shù)低于白茶；生茶經(jīng)殺青，殺死了茶葉中的一部分微生物，使生茶的OTU數(shù)最少。

圖2 OTU venn分析

2.3 Alpha Diversity分析

Alpha Diversity用于分析樣本內(nèi)（Within-community）的微生物群落豐富度和多樣性[26]，結(jié)果見表1。三種茶葉樣本中細(xì)菌和真菌的Goods-coverage為1.00，說明測(cè)序深度符合樣品中微生物多樣性分析要求。通過比較三種茶葉樣品的細(xì)菌與真菌多樣性指數(shù)大小關(guān)系發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌與真菌相同，Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)大小均為BC＞HC＞SC，說明白茶中微生物群落多樣性最高，生茶最低；HC的Simpson指數(shù)最高，說明紅茶經(jīng)發(fā)酵后中微生物群落分布均勻，白茶未經(jīng)發(fā)酵，其微生物多樣性最高，但均勻度較低于紅茶。

表1 Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)表

2.4 不同茶葉細(xì)菌群落組成分析

2.4.1 基于門水平和綱水平下細(xì)菌群落組成

在門分類水平下共鑒定到22個(gè)細(xì)菌門，相對(duì)豐度前10的結(jié)果如圖3（A）所示，藍(lán)藻門（Cyanobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）是三種茶中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌門，其他細(xì)菌菌門相對(duì)豐度均小于1%。白茶中藍(lán)藻門（Cyanobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）的占比為53%和43%，但與陳佳佳等[27]研究的儲(chǔ)藏白茶相比，此次試驗(yàn)藍(lán)藻門相對(duì)豐度較高，其他細(xì)菌菌門基本一致。紅茶中變形菌門（Proteobacteria）為主要的優(yōu)勢(shì)菌門，占比為61%，藍(lán)藻門（Cyanobacteria）占比為36%。生茶中藍(lán)藻門占比為94%，變形菌門（Proteobacteria）占比6%。

圖3 門水平（A）、綱水平（B）下三種茶葉中細(xì)菌的相對(duì)豐度

在綱分類水平下共鑒定到43個(gè)細(xì)菌綱，相對(duì)豐度前10的結(jié)果如圖3（B）所示，白茶中Cyanobacteriia、丙型變形菌綱（Gammaproteobacteria）、α-變形桿菌綱（Alphaproteobacteria）、桿菌綱（Bacilli）分別占比53%，32%，10%和2%。紅茶中Cyanobacteriia、丙型變形菌綱（Gammaproteobacteria）、α-變形桿菌綱（Alphaproteobacteria）分別占比36%，56%和5%。生茶中Cyanobacteriia、α-變形桿菌綱（Alphaproteobacteria）分別占比94%和5%。其他菌綱占比均小于1%。

2.4.2 基于屬水平下細(xì)菌群落組成

在屬分類水平下，共鑒定出194個(gè)細(xì)菌菌屬，選取屬水平排名前10的優(yōu)勢(shì)菌屬進(jìn)行相對(duì)豐度計(jì)算，結(jié)果如圖4所示。將不能鑒定到屬水平的序列歸并為unclassfield，將其他菌屬歸并為others。除未分類的unclassfiel_Chloroplast及unidentified_Mitochondria，白茶中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌屬為泛生菌屬（pantoea），占比為21%，其次鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、甲基桿菌屬（Methylobacterium-Methylorubrum）占比分別為4%和3%，在陳佳佳等[27]的研究中也是白茶中的優(yōu)勢(shì)菌屬。紅茶中泛生菌屬（pantoea）占比為1%，乳桿菌屬（Lactobacillussp.）、短桿菌屬（Brevibacteriumsp.）、魏斯氏菌屬（Weissella）等乳酸菌在紅茶樣品中也有檢出，但相對(duì)豐度很低。生茶中細(xì)菌菌落占比較低，unclassfiel_Chloroplast占比為94%。由此可知，紅茶和生茶中細(xì)菌相對(duì)豐度低于白茶。

圖4 屬水平下三種茶葉中細(xì)菌的相對(duì)豐度

2.5 不同茶葉真菌群落組成分析

2.5.1 基于門水平和綱水平下真菌群落組成

在門分類水平下共鑒定出6個(gè)真菌門，如圖5（A）所示，子囊菌門（Ascomycota）是3種樣品中主要的真菌菌門，分別占總數(shù)的90%，90%和50%，擔(dān)子菌門（Basidiomycota）在白茶和紅茶中的含量為4%，在生茶中含量低于1%。

在綱分類水平下共鑒定出29個(gè)真菌綱，如圖5（B）所示。白茶中座囊菌綱（Dothideomycetes）、糞殼菌綱（Sordariomycetes）為優(yōu)勢(shì)菌綱，相對(duì)豐度為59%和30%，銀耳綱（Tremellomycetes）、傘菌綱（Agaricomycetes）占比分別為2%和1%。紅茶中糞殼菌綱（Sordariomycetes）、散囊菌綱（Eurotiomycetes）、座囊菌綱（Dothideomycetes）為優(yōu)勢(shì)菌綱，相對(duì)豐度為38%，34%和13%，酵母綱（Saccharomycetes）、銀耳綱（Tremellomycetes）、傘菌綱（Agaricomycetes）占比分別為5%，2%和1%。生茶中糞殼菌綱（Sordariomycetes）為優(yōu)勢(shì)菌綱，相對(duì)豐度為42%，散囊菌綱（Eurotiomycetes）、座囊菌綱（Dothideomycetes）占比分別為7%和1%。其他菌綱占比均小于1%。

圖5 門水平（A）、綱水平（B）下三種茶葉中真菌的相對(duì)豐度

2.5.2 基于屬水平下真菌群落組成

在屬分類水平下共有418個(gè)真菌菌屬，結(jié)果如圖6所示。在3種樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。白茶中的優(yōu)勢(shì)菌屬為枝孢菌屬（Cladosporium）、帚枝霉屬（Sarocladium），相對(duì)豐度分別為43%和25%。紅茶樣品中優(yōu)勢(shì)菌屬為籃狀菌屬（Talaromyces）、Gloeotinia屬、枝孢菌屬（Cladosporium）、帚枝霉屬（Sarocladium），相對(duì)豐度為33%，31%，8%和5%。生茶中優(yōu)勢(shì)真菌菌屬Gloeotinia屬相對(duì)豐度為33%，帚枝霉屬（Sarocladium）和曲霉屬（Aspergillus）的相對(duì)豐度均為7%。曲霉屬在茶葉發(fā)酵與儲(chǔ)藏市售過程中均存在；枝孢菌屬常見于死掉的作物上的霉菌，屬腐生生物；帚枝霉屬是一種可抑制土傳植物病原菌的真菌，在茶葉上主要起抑菌、溶菌的作用；Gloeotinia屬是一種生防真菌。

圖6 屬水平下三種茶葉中真菌的相對(duì)豐度

2.6 PCA主成分分析

對(duì)3種芽菜中的微生物菌群進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見圖7。細(xì)菌群落中第一主成分貢獻(xiàn)率為70.77%，第二主成分貢獻(xiàn)率為29.23%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為100%。真菌群落中第一主成分貢獻(xiàn)率為55.88%，第二主成分貢獻(xiàn)率為44.12%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為100%。無論細(xì)菌還是真菌，3種茶葉樣本之間的距離較遠(yuǎn)，說明3種茶葉中的微生物群落結(jié)構(gòu)有較大的差異。

圖7 PCA分析

3 結(jié)論

利用高通量測(cè)序技術(shù)分析了3種市售茶葉中微生物群落結(jié)構(gòu)，3種不同工藝不同生產(chǎn)年份的茶葉中微生物的多樣性豐富程度具有顯著差異，其中白茶微生物多樣性最為豐富，其次是紅茶和生茶。不同茶葉體現(xiàn)出不同的微生物群落結(jié)構(gòu)。在門水平下，藍(lán)藻門（Cyanobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）是3種茶中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌門，子囊菌門（Ascomycota）是優(yōu)勢(shì)真菌菌門。在屬水平下，3種茶葉中主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌屬是unclassfiel_Chloroplast，在白茶、紅茶、生茶中占比分別為53%，36%和94%。真菌優(yōu)勢(shì)菌屬各有不同，白茶中的優(yōu)勢(shì)菌屬為枝孢屬菌（Cladosporium），相對(duì)豐度為4 3%，紅茶中優(yōu)勢(shì)菌屬為籃狀菌屬（Talaromyces）、Gloeotinia屬，相對(duì)豐度為33%和31%，生茶優(yōu)勢(shì)真菌菌屬是Gloeotinia屬，相對(duì)豐度為33%。通過主成分分析證明了加工工藝不同的三種茶葉微生物群落有較大差異。茶葉中的微生物主要是一些植物內(nèi)生菌，此外還有一些腐生菌，腐生菌可能會(huì)對(duì)茶葉的儲(chǔ)藏和銷售時(shí)的品質(zhì)安全性存在一定的影響，通過文章可對(duì)后續(xù)研究茶葉儲(chǔ)藏中品質(zhì)與微生物的相關(guān)性研究提供參考，以保證茶葉儲(chǔ)藏中茶葉的品質(zhì)及安全。