16S rDNA克隆文庫(kù)法分析小龍蝦腸道細(xì)菌多樣性

鄭居神，何浣紗，胡奧，石玉，馮光志*

武漢設(shè)計(jì)工程學(xué)院食品與生物科技學(xué)院（武漢 430205）

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii），俗稱小龍蝦，20世紀(jì)20年代由日本傳入我國(guó)，并迅速在我國(guó)廣泛傳播[1-2]，到20世紀(jì)70年代，伴隨小龍蝦飲食文化的興起，小龍蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)開始飛速發(fā)展，使得我國(guó)迅速成為世界上最大和最重要的小龍蝦生產(chǎn)國(guó)[3-4]。

小龍蝦產(chǎn)業(yè)取得長(zhǎng)足發(fā)展，但伴隨小龍蝦養(yǎng)殖規(guī)模和經(jīng)濟(jì)體量的不斷增長(zhǎng)，養(yǎng)殖過程中存在的一些問題開始顯現(xiàn)，進(jìn)而推動(dòng)小龍蝦規(guī)模養(yǎng)殖的相關(guān)科學(xué)研究。這些研究主要集中于小龍蝦的行為學(xué)、養(yǎng)殖密度、疾病和免疫及飼料中蛋白質(zhì)、脂肪配比等方面[5]。隨著研究的不斷深入，科研工作者開始對(duì)小龍蝦腸道微生物逐漸重視起來，腸道微生物在水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)代謝、營(yíng)養(yǎng)吸收以及免疫抗病等方面發(fā)揮重要作用[6]，與小龍蝦的健康息息相關(guān)[7]。

小龍蝦的健康與其腸道微生物的菌群結(jié)構(gòu)密不可分。王飛飛等[8]采用高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)稻蝦共作模式下克氏原螯蝦腸道中菌群多樣性進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)克氏原螯蝦腸道中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種類為厚壁菌門（42.16%）、變形菌門（13.78%）和柔膜菌門（13.07%）。李飛等[9]采用高通量測(cè)序方法分析2種養(yǎng)殖模式下克氏原螯蝦腸道的微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示池塘和稻田養(yǎng)殖克氏原螯蝦腸道微生物在物種組成上、多樣性上都存在明顯差異。高通量測(cè)序技術(shù)因其能完整反映測(cè)試樣品的菌群結(jié)構(gòu)特征，是研究微生物菌群結(jié)構(gòu)的重要工具[10]，而16S rDNA克隆文庫(kù)法技術(shù)成熟，可操作性好，在反映優(yōu)勢(shì)菌群方面具有一定優(yōu)勢(shì)[11]。鑒于此，試驗(yàn)采用16S rDNA克隆文庫(kù)法，對(duì)小龍蝦腸道共生細(xì)菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，通過揭示小龍蝦腸道微生物優(yōu)勢(shì)菌群，探討這些微生物在食物消化過程中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

小龍蝦（實(shí)驗(yàn)室蝦池人工養(yǎng)殖）。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

LB液體培養(yǎng)基：取10 g胰蛋白胨、5 g酵母抽提物、10 g氯化鈉，用蒸餾水定容至1 000 mL，攪拌至完全溶解，于1×105Pa滅菌20 min。X-Gal：取25 mg固體X-gal溶解于1 mL的二甲基甲酰胺中，于-20 ℃避光保存。IPTG：稱取250 mg IPTG溶解于10 mL去離子水中，抽濾分裝后，于-20 ℃貯存。PCR引物的合成及測(cè)序由上海桑尼生物科技有限公司完成。限制性內(nèi)切酶Afa Ⅰ和MspⅠ、Taq酶、dNTP、pGEM-T Vector等（購(gòu)于TaKaRa公司）；DNA提取試劑盒、PCR純化試劑盒（購(gòu)于天源公司）。

1.3 CTAB法提取小龍蝦腸道總DNA

采用CTAB法提取小龍蝦腸道的總DNA，并利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其純度。

1.4 小龍蝦腸道細(xì)菌16S rDNA的擴(kuò)增

以提取的小龍蝦總DNA為模板，利用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物27F，1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min。

1.5 小龍蝦腸道共生細(xì)菌16S rRNA基因文庫(kù)的構(gòu)建

PCR結(jié)束后，將純化后的PCR產(chǎn)物與pGEM-T easy載體在4 ℃條件下進(jìn)行連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取平板上陽性克隆，以M13為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，驗(yàn)證序列是否正確插入，片段在1 700 bp左右。對(duì)插入正確序列的克隆分別采用限制性內(nèi)切酶Afa Ⅰ和MspⅠ這2種酶進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，對(duì)酶切圖譜進(jìn)行限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析。若同一克隆2種酶的酶切圖譜相同則歸為一類，稱之為相同的克隆型。從具有相同克隆型的克隆中選取1～2個(gè)克隆送上海桑尼公司測(cè)序。

1.6 序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

序列經(jīng)DNAstar軟件分析后，通過NCBI的BlastN搜索同源性較高的已知序列，利用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 小龍蝦腸道共生細(xì)菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增

以小龍蝦的總DNA為模板，用細(xì)菌通用引物27F，1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約1 500 bp的條帶，與預(yù)期的大小一致。

2.2 小龍蝦腸道共生細(xì)菌16S rDNA文庫(kù)的建立

隨機(jī)挑取平板上大腸桿菌DH5α白色菌落，以M13為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得到共計(jì)369個(gè)含有正確插入序列的克隆，分別用限制性內(nèi)切酶AfaⅠ（圖1）和MspⅠ（圖2）對(duì)所得到的這369個(gè)含有正確插入序列的克隆進(jìn)行酶切，并進(jìn)行限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析。根據(jù)核糖體DNA擴(kuò)增片段限制性內(nèi)切酶分析（ARDRA），將這369個(gè)陽性克隆分為35個(gè)不同的ARDRA型，其中AfaⅠ共得到19種克隆型，MspⅠ共得到16種克隆型。

圖1 小龍蝦腸道共生細(xì)菌16S rDNA PCR產(chǎn)物的Afa Ⅰ的部分酶切圖譜

圖2 小龍蝦腸道共生細(xì)菌16S rDNA PCR產(chǎn)物的MspⅠ的部分酶切圖譜

2.3 小龍蝦腸道共生細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

將35種克隆型分別隨機(jī)挑取1～2個(gè)克隆測(cè)序，并將序列相似性大于99.5%的克隆視為相同克隆型，最終得到24個(gè)不同的克隆型，將得到的這24個(gè)細(xì)菌16S rRNA基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果顯示小龍蝦腸道共生細(xì)菌的16S rRNA基因分別與檸檬酸桿菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬、Anaerorhabdus furcosa、Haloplasma、希瓦菌屬、巨型球菌屬、中慢生根瘤菌屬、Brachymonas、Sinanaerobacter、Cyanobium、丹毒絲菌屬細(xì)菌的16S rDNA序列最為接近，相似性為83.6%～99.4%。在系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）上，各個(gè)克隆分別形成不同的簇，說明小龍蝦腸道微生物多樣性非常豐富。有些克隆序列與Genbank中最相近序列的相似性低于95%，可能是迄今尚未描述的新種。

圖3 基于16S rDNA的小龍蝦腸道共生細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

3 討論與結(jié)論

腸道菌群結(jié)構(gòu)復(fù)雜，種類繁多，但大體可以劃分為3種類型：共生菌群，占腸道菌群的絕大部分，這些微生物多是益生菌，和宿主一起行使多種生理功能；條件致病菌群，當(dāng)宿主處于健康狀態(tài)時(shí)，這些微生物很安分，能夠和宿主和平相處，但當(dāng)宿主處于病變狀態(tài)，腸道菌群發(fā)生紊亂時(shí)，條件致病菌就會(huì)引發(fā)多種腸道疾病；致病菌群，通常經(jīng)過環(huán)境進(jìn)入腸道，導(dǎo)致病變。腸道微生物在維持宿主健康中發(fā)揮重要作用，腸道菌群結(jié)構(gòu)對(duì)宿主健康具有指示作用。賈麗娟等[12]通過高通量測(cè)序技術(shù)研究武漢地區(qū)的克氏原螯蝦腸道的優(yōu)勢(shì)菌屬，結(jié)果為檸檬酸桿菌屬、氣單胞菌屬和Anaerorhabdus furcosagroup等。試驗(yàn)從小龍蝦腸道共生細(xì)菌中得到的24個(gè)16S rRNA基因序列，分別歸于檸檬酸桿菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬、Anaerorhabdus furcosa、Haloplasma、希瓦菌屬等12個(gè)屬，與賈麗娟等[12]的研究一致，說明小龍蝦腸道具有相對(duì)固定的菌群結(jié)構(gòu)，可考慮篩選指示小龍蝦健康狀況的細(xì)菌種群。

腸道微生物棲居于宿主腸道內(nèi)，與宿主形成共生關(guān)系，作為宿主體內(nèi)最龐大最復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，腸道微生物及其代謝產(chǎn)物不僅能調(diào)節(jié)宿主健康，在宿主消化與代謝、疾病與免疫等方面都發(fā)揮著重要作用[13]。關(guān)于腸道微生物的研究，主要集中在3個(gè)方面：一是腸道微生物群落的結(jié)構(gòu)及其演替規(guī)律[14-16]；二是腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響因素[17]；三是腸道微生物的生理功能[18]。這些研究主要還是集中在人、小鼠及斑馬魚等生物上，關(guān)于小龍蝦腸道微生物方面的研究還較少，且多集中于腸道微生物群落結(jié)構(gòu)及其影響因素方面。腸道微生物與小龍蝦的生理健康息息相關(guān)，研究腸道微生物的菌群結(jié)構(gòu)和生理功能，對(duì)小龍蝦養(yǎng)殖和飼料配方的研制都具有極其重要的作用。試驗(yàn)從小龍蝦腸道得到24個(gè)細(xì)菌16S rDNA序列，系統(tǒng)發(fā)育分析表明，這些克隆分別與檸檬酸桿菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬、Anaerorhabdus furcosa、Haloplasma、希瓦菌屬、巨型球菌屬、中慢生根瘤菌屬、Brachymonas、Sinanaerobacter、Cyanobium、丹毒絲菌屬細(xì)菌的16S rDNA序列最為接近。這些屬的細(xì)菌中有很多具有產(chǎn)酶能力，如：巨型球菌屬微生物產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶；擬桿菌屬細(xì)菌能夠分解糖和蛋白質(zhì)[19]；檸檬酸桿菌屬微生物能利用檸檬酸鹽，發(fā)酵葡萄糖；希瓦菌屬降解染料[20]；梭菌屬細(xì)菌可以發(fā)酵糖、醇和其他有機(jī)物；Sinanaerobacter能降解乙草胺和丁草胺等[21]。這些腸道微生物在輔助小龍蝦消化食物的過程中發(fā)揮著不可替代的作用，可能還存在許多的新種，它們行使的生理功能和作用機(jī)制仍有待深入探究，同時(shí)，小龍蝦腸道中也存在一定比例的條件致病菌，如丹毒絲菌屬[22]、希瓦氏菌屬微生物[23]，在一定條件下可導(dǎo)致小龍蝦致病，為維持和改善小龍蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)，投喂微生物制劑是行之有效的辦法。