龍眼蛋白對口腔細菌生長及生物膜形成的影響

梁姍*，楊凡，田依靈

長江師范學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院（重慶 408000）

龍眼（Dimocarpus longanLour.），也稱桂圓，含有人體所需的糖分、維生素、礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)成分，具有較高的營養(yǎng)價值，但桂圓性溫、味甘，多食易生內(nèi)熱而引起“上火”，常被稱為“熱性水果”[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為，“上火”是一種炎癥反應(yīng)。柑橘和荔枝也是常見的“熱性水果”，有研究發(fā)現(xiàn)其引起“上火”的主要成分是水溶性蛋白，尤其是14-3-3的3個家族蛋白通過人體花生四烯酸（arachidonic acid，AA）代謝途徑誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫炎癥反應(yīng)[2-5]。

牙齦發(fā)炎是“上火”的典型癥狀，主要是由口腔微生物引起的牙周疾病所導(dǎo)致[6]。細菌是口腔微生物的主要類型，常在唾液薄膜上生長繁殖形成牙菌斑。牙菌斑里的細菌代謝產(chǎn)生有害物質(zhì)刺激牙齦組織產(chǎn)生炎癥[7]。變形鏈球菌（Streptococcus mutans）是口腔菌群的主要種類，常形成牙菌斑導(dǎo)致齲病，其作用機制主要是通過3種葡糖基轉(zhuǎn)移酶（GtfsB、GtfsC和GtfsD）將蔗糖合成胞外多糖（exopolysaccharide，EPS），使細菌牢固地附著在牙齒表面并形成生物膜，為細菌的生長提供保障[8]。表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）常為口腔條件致病菌，腐生葡萄球菌（Staphylococcus Saprophyticus）一般在口腔中不致病。口腔細菌在口腔中易形成生物膜，大多數(shù)生物膜對各種抗生素具有較高的耐受性，從而導(dǎo)致口腔中各種病癥的發(fā)生[9-11]。

對龍眼引起“上火”的具體成分和作用機制尚無具體研究報道。試驗通過分析龍眼水溶性蛋白對3種口腔細菌生長、生物膜形成和胞外多糖合成量的影響，為進一步研究多食龍眼引起口腔炎癥提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

龍眼為儲良龍眼種；變異鏈球菌（Streptococcus mutans，ATCC25175）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis，ATCC12228）、腐生葡萄球菌（Staphylococcus Saprophyticus，ATCCBAA-750），均來自中國微生物菌種保藏中心。

SDS-PAGE凝膠快速制備電泳試劑盒、考馬斯亮藍快速染色液（安徽蘭杰柯）；TYP培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基（廣州環(huán)凱）；其他有機試劑為國產(chǎn)分析純。

Avanti J-15R高速冷凍離心機（美國貝克曼）；T6新世紀分光光度計（北京普析）；ZWY-2102CMultiskan FC酶標儀（美國賽默飛）；1658001垂直電泳槽（美國伯樂）；DMi1 倒置顯微鏡（德國徠卡）。

1.2 方法

1.2.1 龍眼蛋白提取

新鮮龍眼果肉榨汁后用4層紗布過濾，在4 ℃，以5 000 r/min離心15 min，收集上清液，冷凍干燥后縮小體積于4 ℃透析3 d后，收集樣品再次冷凍干燥。稱取100 mg干燥粉末，加入15 mL預(yù)冷的酚提取緩沖液（pH 7.5，500 mmol/L Tris-base、63.7 mmol/L EDTA水溶液、100 mmol/L KCl、700 mmol/L蔗糖），加入15 mL預(yù)冷的Tris飽和酚溶液，至于冰盒中，在搖床上劇烈搖晃振蕩2 h，使其混合均勻，在4 ℃，以5 000 r/min離心15 min。取上層，重復(fù)上述步驟，重新取得的上層酚相中加入提前預(yù)冷的含有0.1 mol/L乙酸銨的甲醇35 mL，于-20 ℃靜置過夜沉淀蛋白，在4 ℃，以5 000 r/min離心15 min，去上清液。加入丙酮，輕輕搖晃，后置于-20 ℃靜置1 h，在4 ℃，以5 000 r/min離心15 min。重復(fù)上述步驟2次，空氣干燥得到龍眼蛋白，溶于水后定量[12-13]。

1.2.2 SDS-PAGE電泳

配制10%的分離膠，灌膠冷凝；配制5%的濃縮膠溶液，灌注于分離膠上方，插入梳子。靜置30 min后，拔出梳子，在上樣孔中加入100 μg上述龍眼蛋白水溶液，120 V、1 h，停止電泳，取出膠放入考馬斯亮藍R250染色液中振蕩過夜，將膠依次放入25%甲醇和7.5%乙酸中室溫振搖下脫色，拍照。

1.2.3 菌種活化

配制TYP培養(yǎng)基和TSA培養(yǎng)基，將凍存的變異鏈球菌、腐生葡萄球菌、表皮葡萄球菌進行菌種活化[14-16]。

1.2.4 龍眼蛋白對3種口腔細菌生長的影響

取100 mL處于對數(shù)生長期的菌液，加入2 mL 3 mg/mL的龍眼蛋白樣品溶液，對照加入2 mL 3 mg/mL牛血清蛋白，每隔2 h吸取1 mL菌液用分光光度計在波長600 nm處測定菌液的吸光度（A）[17]。

1.2.5 不同濃度龍眼蛋白對口腔細菌生長的影響

配制質(zhì)量濃度為0，3，6和9 mg/mL的龍眼蛋白溶液，在100 mL 3種細菌培養(yǎng)液中分別加入2 mL上述不同濃度龍眼蛋白溶液，于37 ℃培養(yǎng)12 h，使用分光光度計在波長600 nm處測定吸光度（A）[18]。

1.2.6 不同濃度龍眼蛋白對三種口腔細菌生物膜形成的影響

將1 mL處于對數(shù)生長期的3種細菌菌懸液加入24孔板中，每一種細菌的菌懸液分別加入1 mL 0，3，6和9 mg/mL質(zhì)量濃度龍眼蛋白，于37 ℃培養(yǎng)12 h，小心吸棄孔內(nèi)液體，用PBS緩沖液清洗孔板，在每孔中加入1 mL結(jié)晶紫染色液，染色15 min，用PBS緩沖液清洗3次，置于顯微鏡下拍照，加入1 mL 33%的乙酸溶液，以50 r/min振蕩30 min，吸取200 μL溶液，在波長575 nm處使用酶標儀讀取數(shù)值[19]。

1.2.7 不同濃度龍眼蛋白對3種口腔細菌產(chǎn)EPS的影響

將1 mL處于對數(shù)生長期的3種細菌菌懸液加入24孔板中，每一種細菌的菌懸液分別加入1 mL 0，3，6和9 mg/mL質(zhì)量濃度龍眼蛋白，于37 ℃培養(yǎng)12 h，吸棄上清液，用PBS緩沖液清洗孔底形成的生物膜，將生物膜全部刮下，以4 000 r/min離心10 min，離心后棄上清液，沉淀用PBS溶液重懸并清洗2～3次，每管加入1 mL 0.4 mol/L NaOH溶液重懸沉淀，于37 ℃孵育2 h，在4 ℃，以6 000 r/min離心10 min。取200 μL上清液加入600 μL蒽酮試劑，于95 ℃加熱8 min，冷卻至室溫，取200 μL加入96孔板中，在波長625 nm處讀取吸光度[20]。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)重復(fù)試驗3次，采用 SPSS 19.0軟件進行方差分析和多重比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE電泳分析

由圖1可知，龍眼蛋白提取物經(jīng)考馬斯亮藍染色后條帶清晰，雜質(zhì)較少，分子量在30～250 kDa條帶數(shù)量較多，低于30 kDa的條帶數(shù)量較少，說明蛋白完整、質(zhì)量較高，可用于后續(xù)試驗中。

圖1 龍眼蛋白SDS-PAGE電泳

2.2 龍眼蛋白對口腔細菌生長的影響

分析3 mg/mL龍眼蛋白對3種菌生長的影響。由圖2可知，在0～4 h時，3 mg/mL龍眼蛋白對變異鏈球菌生長無顯著影響。在4～24 h時，3 mg/mL龍眼蛋白顯著促進其生長（P＜0.05），可能是因為細菌處于對數(shù)期，生長迅速。在0～6 h和22～24 h時，3 mg/mL龍眼蛋白對表皮葡萄球菌的生長無顯著影響。在6～22 h時，3 mg/mL龍眼蛋白顯著促進其生長（P＜0.05），在0～24 h內(nèi)，3 mg/mL龍眼蛋白對腐生葡萄球菌的生長影響均不顯著，可能是因為細菌處于遲緩期，生長緩慢。變異鏈球菌為常見的口腔致病菌，表皮葡萄球菌是條件致病菌，而腐生葡萄球菌通常不致病，結(jié)果說明龍眼蛋白對口腔致病菌生長有促進作用，對非致病菌生長無顯著影響。

圖2 龍眼蛋白對口腔細菌生長的影響

2.3 不同濃度龍眼蛋白對細菌生長的影響

由圖3可知：3和6 mg/mL龍眼蛋白可以顯著促進變異鏈球菌、表皮葡萄球菌的生長（P＜0.05），其效應(yīng)隨濃度增大而增強，9 mg/mL龍眼蛋白抑制2種菌的生長，但仍高于對照組（P＜0.05），可能是因為蛋白濃度過大，導(dǎo)致細胞滲透壓過大，從而引起細菌死亡[21-22]。不同濃度的龍眼蛋白對腐生葡萄球菌生長影響均不顯著。結(jié)果說明龍眼蛋白可顯著促進口腔致病菌、條件致病菌的生長，對口腔非致病菌的生長無顯著影響。

圖3 不同濃度龍眼蛋白對細菌生長的影響

2.4 龍眼蛋白對口腔生物膜形成的影響

由圖4可知：3和6 mg/mL龍眼蛋白顯著促進變異鏈球菌、表皮葡萄球菌生物膜的形成能力，且隨蛋白濃度增大，生物膜直徑越大（P＜0.05），而9 mg/mL抑制變異鏈球菌生物膜的形成，但仍顯著高于未處理組。不同濃度的龍眼蛋白對腐生葡萄球菌的生物膜形成均無顯著影響。結(jié)果表明，3 mg/mL以上濃度的龍眼蛋白能促進口腔致病菌的生物膜形成，但過高濃度的龍眼蛋白會抑制生物膜的繼續(xù)形成，可能是由于高濃度的龍眼蛋白抑制細菌生長，從而導(dǎo)致細菌形成生物膜能力的下降。結(jié)果說明龍眼蛋白可顯著促進口腔致病菌、條件致病菌的生物膜形成，對非致病菌無顯著影響。

圖4 龍眼蛋白對細菌生物膜形成的影響

2.5 不同濃度龍眼蛋白對3種口腔細菌生物膜產(chǎn)EPS的影響

利用蒽酮-硫酸法檢測龍眼蛋白對3種細菌生物膜產(chǎn)胞外EPS的影響，結(jié)果如圖5所示。3和6 mg/mL龍眼蛋白使變異鏈球菌和表皮葡萄球菌合成EPS的量顯著增大（P＜0.05），且呈濃度遞增，9 mg/mL龍眼蛋白使上述細菌合成EPS的量有所降低，但無統(tǒng)計學(xué)意義，可能是由于高濃度龍眼蛋白使細菌生長受到抑制，但已合成的EPS仍分泌在培養(yǎng)基中。龍眼蛋白對腐生葡萄球菌產(chǎn)EPS量均無顯著差異影響。結(jié)果說明龍眼蛋白可顯著促進口腔致病菌、條件致病菌的生物膜產(chǎn)胞外多糖，對非致病菌無顯著影響。

圖5 龍眼蛋白對細菌生物膜產(chǎn)EPS的影響

3 結(jié)論

研究表明，3和6 mg/mL龍眼蛋白能增強口腔致病菌變異鏈球菌和條件致病菌表皮葡萄球菌的生長能力，促進其生物膜形成和分泌胞外多糖，且呈現(xiàn)劑量依賴性。但9 mg/mL龍眼蛋白對變異鏈球菌、表皮葡萄球菌的生長、生物膜和EPS形成產(chǎn)生一定抑制，可能是由于過高的龍眼蛋白中某些組分對細菌的生長產(chǎn)生抑制作用，從而抑制生物膜及胞外多糖的產(chǎn)生。同時研究也發(fā)現(xiàn)，龍眼蛋白對腐生葡萄球菌這一非致病菌的生長、生物膜形成、EPS產(chǎn)量均無顯著影響，推測龍眼蛋白可能是較專一的影響口腔致病菌的生長，從而引起口腔“上火”癥狀。

龍眼、荔枝、柑橘等“熱性水果”過多食用后，會引起牙周炎、喉嚨干疼等一系列“上火”癥狀。有研究分析了柑橘引起的“上火”反應(yīng)是由于一種外源物質(zhì)刺激引起的免疫炎癥反應(yīng)，蜜柑水溶性蛋白在炎癥誘導(dǎo)發(fā)生中起關(guān)鍵性的作用，共檢測得到6種可能候選蛋白質(zhì)，分別是多聚半乳糖酸酸酶抑制劑、腕抑素樣蛋白、丙酮酸脫羧酶半光氨酸蛋白酶、磷脂酶和幾丁質(zhì)酶[23]。荔枝14-3-3家族蛋白顯著促進巨噬細胞RAW264.7中促炎因子，如人白介素1β（Interleukin-1 beta，IL-1β），誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、環(huán)化酶（Cyclooxygenase 2，COX-2）的表達，小鼠結(jié)腸、肺部組織表現(xiàn)出炎癥變化，說明荔枝的水溶性蛋白具有促炎作用[24]?？谇痪菏д{(diào)是導(dǎo)致口腔疾病的主要原因，也是引起口腔“上火”的關(guān)鍵因素，對于“熱性水果”對口腔菌群的影響及機制尚未見報道，但有報道中藥或天然植物提取物可以抑制口腔致病菌的生長及并調(diào)節(jié)菌群的組成，降低口腔炎癥反應(yīng)[25-27]。野菊花水提物、廣東涼茶能通過影響小鼠腸道菌群組成緩解食物誘發(fā)的“上火”癥狀，推測“熱性水果”可能通過影響人體微生物菌群平衡而致炎引起“上火”[28-30]。

綜上，試驗證明龍眼蛋白能促進口腔致病菌的生長、生物膜形成和產(chǎn)胞外多糖，為多食龍眼引起口腔“上火”提供試驗依據(jù)。然而，龍眼蛋白對口腔細菌的影響機制仍有待進一步研究。